Appunti Microbiologia - ultima parte

1. OTTENERE UN CERTO N° DI CELLULE = PELLET CELLULARE

- far crescere isolato in un idoneo terreno (solitamente una brodocoltura)

- incubare

- centrifugare per raccogliere il pellet cellulare sul fondo della provetta e scartare il brodo privo di cellule

2. ROMPERE/LISARE LE CELLULE (=far uscire tutti i componenti citoplasmatici)



uso di un agente litico lisozima, riesce ad idrolizzare i legami β 1-4 del peptidoglicano = romperlo

con conseguente disgregazione della parete cellulare

- mettere a contatto pellet cellulare con tampone contenente una certa [] di lisozima (nei protocolli

di laboratorio viene indicata la [] migliore di lisozima da usare in base al microorganismo in esame)

- far agire tampone per circa 30min a 37°C (tempo necessario per lisare le cellule)

 si ottiene una miscela di reazione con frazioni di parete e tutti i componenti citoplasmatici

3. ELIMINARE TUTTO CIÒ CHE NON È DNA



uso di solventi fenolo, in grado di estrarre tutti i detriti cellulari e far precipitare le proteine ad

alto peso molecolare

- aggiungere in provetta solvente in ugual volume alla sospensione cellulare

 si ha la ripartizione delle 2 fasi: sopra fase acquosa, contenente DNA, sotto fase con solvente,

che ha estratto tutto ciò che non è DNA.

è l’agente

precipitante

del DNA 4. RACCOGLIERE DNA ESTRATTO

- aggiungere etanolo (a T -20°C) per far precipitare DNA nella fase acquosa (aggiunto solitamente in

doppio volume rispetto a V della fase acquosa)

- dopo miscelazione e centrifugazione il DNA si raccoglie sul fondo della provetta

- allontanare etanolo mediante evaporazione sottovuoto  mantenere T basse per non distruggere DNA

- ridisciogliere DNA ottenuto in un idoneo tampone: questa soluzione di DNA è quella che noi

andremo a studiare

IN SINTESI – Estrazione DNA

- cellule fatte crescere in terreno completo q in funzione del ceppo che dobbiamo

- ottenimento pellet cellulare tramite centrifugazione +

usare es. Gram hanno tanti strati

- pellet lavato con tampone che disgrega eventuali strati extra parietali quindi necessario tanto lisozima

 aggiunta agente litico (generalmente lisozima) per rompere pareti cellulare

- lisozima a contatto con pellet cellulare a 37° per 30’

 fuoriuscita delle macromolecole

- eliminazione di tutte le macromolecole che non sono acidi nucleici tramite solventi & centrifugazione

 creazione fase acquosa sopra con DNA, sotto solvente; al centro (interfase) precipitato biancastro =

tutto ciò che non è acido nucleico

- eliminazione agente precipitante (etanolo) mediante evaporazione sottovuoto

- aggiunta di soluzione tampone al DNA ottenuto

-se si vuole purificazione estrema si può fare trattamento con RNasi e proteasi-

Quantificare DNA estratto -

determinare quanto DNA siamo riusciti ad estrarre da un certo peso di pellet cellulare-

DNA assorbe nell’ultravioletto con un massimo di assorbimento alla lunghezza d’onda di 260nm: possibile

quantificare il DNA estratto con uno spettrofotometro a doppio raggio predisposto a λ = 260nm.

Bisogna usare cuvette in quarzo.

 si inserisce un’aliquota della soluzione (tampone) di DNA estratto in cuvetta e si fa la lettura a 260nm

 valore di assorbanza che si legge, viene messo in correlazione con la seguente equivalenza:

ad un valore di assorbanza A pari a 1 corrisponde

una concentrazione di DNA in soluzione di 50 µg/ml

NB! Il DNA estratto viene ridisciolto alla fine in una soluzione tampone es. di 1ml ; da questa si

(=> diluizione)

preleva solo una piccola aliquota da quantificare es. 10µl, che viene posta in una cuvetta di volume 1ml:

letto il valore di A e trovato il valore di [] di DNA tramite l’equivalenza, bisogna ricordarsi della diluizione

effettuata quindi moltiplicare ancora il risultato per il fattore di diluizione per avere il valore di [] reale.



Es. leggo A= 0,2 ho 10µg/ml ma ho prelevato solo 10µl di soluzione e li ho posti in 1000µl (=1ml) in



cuvetta ho fatto una diluizione 1 a 100 quindi la mia [] reale sarà 1000 µg per ml (10 x 100).

Quando si fa lettura allo spettrofotometro della soluzione di DNA estratto, si preleva solo

un’aliquota di quel DNA che verrà diluita in opportuno tampone per raggiungere il volume

vuoto della cuvetta che si utilizza: quel fattore di diluizione dovrà essere considerato e

moltiplicato al valore di A letto per avere la [] reale del DNA totale.

Denaturazione & riassociazione del DNA

Variando la temperatura in condizioni controllate si verifica la denaturazione e riassociazione reversibile del



DNA ciò permette processi atti a determinare omologia genetica.

È un processo che ha permesso di mettere a punto tutte le varie analisi genetiche e di costruire la

cosiddetta curva di denaturazione termica del DNA.

PRECONCETTI

 Caratteristica propria del DNA è che all’aumentare della T (della soluzione), il DNA si denatura/si

dissocia: la T rompe i legami H tra le basi che formano il doppio filamento => i 2 filamenti si aprono e

si dissociano.

Quando si ha la rottura di tutti i legami H, il DNA è completamente separato in 2 filamenti: si ha DNA

dissociato/denaturato.

 La denaturazione è un fenomeno reversibile (vantaggio per le analisi genetiche): se viene riabbassata

la T, il DNA denaturato tende a riassociarsi via via che la T diminuisce.

 Se viene alzata la temperatura all’interno della soluzione di DNA, il valore di assorbanza che dà la

concentrazione di DNA aumenta, pur rimanendo la [] uguale a quella di partenza.

CURVA DI DENATURAZIONE TERMICA

Usando un particolare spettrofotometro, in grado di riscaldare in modo

controllato le cuvette, si può seguire l’innalzamento del valore di A -in

ordinata- in funzione dell’aumento della T -in ascissa-.

All’inizio del processo il DNA è ancora accoppiato a doppio filamento =>

l’aumento di A è minimo;

T continua ad aumentare -> cominciano a rompersi i legami H =>

l’aumento di A è significativo.

Questo è legato all’effetto ipercromico delle basi nucleotidiche: il valore

di assorbanza a 260nm è dato dalla presenza delle basi, che associate a

formare il doppio filamento danno un certo valore di A ma, quando i 2

filamenti si dissociano, le basi separate assorbono maggiormente la luce



UV è questo che determina un innalzamento del valore di A letto.

Quando la curva arriva ad un valore di A che si mantiene più o meno costante, a quel valore di A e di T

corrisponde la completa dissociazione del DNA nei 2 filamenti.

Si ottiene una sigmoide, dove il punto di flesso è la T = temperatura media di denaturazione termica melting temperature

m

 è caratteristica di ciascun DNA estratto: è diversa e specifica per i vari tipi di DNA

 al di sopra di essa è favorita la dissociazione del DNA, al di sotto la riassociazione

 è legata al contenuto di guanina e citosina, in quanto tenute insieme da 3 legami H: se sul totale delle

basi di un DNA c’è una maggiore quantità di G e C, maggiore sarà il valore di T , perché c’è bisogno di

m

maggiore energia per rompere il n° maggiore di legami H presenti nei 2 filamenti del DNA;

se valore di T è molto diverso tra 2 DNA vuol dire che questi non sono simili, perché uno di essi avrà un

m

maggior contenuto in G e C

T è un indice per valutare in modo indiretto se 2 DNA messi a confronto sono simili o meno.

m Curva di denaturazione termica e valore di T sono stati sfruttati per mettere a punto l’analisi

m

della riassociazione molecolare del DNA che permette di comparare 2 DNA eterologhi

(provenienti da 2 ceppi diversi) e valutarne il grado di omologia per definire un ceppo

appartenente ad una determinata specie.

COME SI VALUTA IL GRADO DI OMOLOGIA?

 Si usa spettrofotometro in grado di riscaldare e di leggere contemporaneamente almeno 4 cuvette

 si estrae DNA dai 2 ceppi che si vogliono comparare

 si riempiono le cuvette: cuvetta n.1 -> bianco per fare la lettura di riferimento

cuvetta n.2 -> DNA di un ceppo ad una [] iniziale precisa

cuvetta n.3 -> DNA dell’altro ceppo ad un uguale []

cuvetta n.4 -> miscela dei 2 DNA eterologhi in modo tale che la loro [] sia ½

rispetto a quella delle cuvette precedenti

 si effettua un’analisi di aumento della T per far dissociare completamente i 2 DNA

 si imposta una cosiddetta T di riassociazione: è inferiore al valore della T calcolata per i 2 DNA in

m

modo tale da entrare nella parte a sx della curva e favorire la riassociazione

 a questa T calcolata di riassociazione si lasciano le cuvette per ca. 30-40min

 contemporaneamente il software collegato allo spettrofotometro registra all’interno di ogni

cuvetta il decremento di A che si ha in funzione del grado di omologia

 si va poi a misurare il tempo intercorso tra l’inizio della riassociazione e quando il DNA si è

riassociato al 50%: lo si fa calcolandolo per i 2 DNA omologhi, che hanno ovviamente un tempo di

riassociazione che sarà considerato il 100% (perché sono DNA dello stesso tipo), e andando poi a

confrontare questa percentuale con quella della cuvetta in cui sono contenuti i 2 DNA eterologhi

 si avrà così una % di omologia in funzione della loro capacità di riassociare filamenti diversi, che si

può seguire con la variazione del valore di A in funzione del grado di denaturazione o riassociazio.

Visualizzare DNA: gel elettroforesi orizzontale

- per separare e vedere DNA estratto

- per calcolare il peso molecolare delle molecole di DNA estratto

CARATTERISTICHE DNA

 

ha sempre una carica netta negativa la migrazione all’interno di un gel elettroforetico avverrà

soltanto in funzione della grandezza delle molecole di DNA

 

ha un elevato p.m. per il gel viene utilizzato come polimero un composto che crea maglie

relativamente grandi, attraverso le quali la più grande molecola di DNA riesce a migrare

IL GEL

 si usa solitamente dell’agarosio => è un componente puro che, sciolto in

(non è l’agar per solidificare terreni)

un tampone e scaldato, crea un polimero con maglie più o meno grandi a seconda della [] di agarosio

utilizzata: basse [] di agarosio (0,7 -1%) per separare DNA di grandi dimensioni

fino a [] del 3% per separare piccoli frammenti di DNA

 

per separare frammenti molto piccoli di DNA gel elettroforesi verticale con poliacrilammide come

polimero (uguale a quello utilizzato per la separazione delle proteine)

1. PREPARAZIONE GEL & POZZETTI

Si utilizza un vassoio orizzontale con 2 estremità aperte, chiuse con uno scotch apposito.

(vassoi di diverse dimensioni in base a n° di