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In C abbiamo i geni strutturali dell'operone galattosio. Se la cellula nn è in presenza di gal,

dell'operone viene trascritto solo il GalE che permette ala cellula di avere l'UDP-galattosio per la

sintesi della parete. Gli altri non mi serve tradurli. Inoltre l'espressione dell'operone è sotto il

controllo di 2 promotori: P1 e P2 e a seconda del promotore traduco tutto l'operone o solo il GalE.

Se uno sRNA si appaia alla regione che comprende la RBS. Quando si appaia a qst regione maschera

il sito di legame del ribosoma impedendo la traduzione dei geni.

In D abbiamo un gene che codifica un enzima che è una ferro-zolfo proteina. Questo enzima viene

prodotto quando c'è ferro! Attraverso un sRNA in assenza di ferro si appaia alla regione a monte

del gene coinvolto bloccandone l'attacco da parte del ribosoma impedendone la traduzione. E'

negativa xk la presenza di sRNA impedisce la sintesi dell'enzima in questione (superossido dismutasi).

Controllo della traduzione delle componenti delle tossine (Sistema AB)

Batteri che provocano patologie grazie a una tossina (vibrio coleri, clostridium botulinum). C sn 2

componenti nelle tossine: componente A responsabile dell'effetto negativo sulla cellula ospite,

componente B che internalizza la componente A nella cellula ospite innescando la cascata dei danni.

Qst tossine sono classificate nel sistema AB. La quantità delle due catene polipeptidiche può essere

equimolare (1 a 1) quindi entrambi i geni che codificano qst due componenti della tossine sn tradoti

cn la stessa efficienza. Se nn sn in rapporto equimolare allora sn tradotti cn una efficienza diversa.

La minore o maggior efficienza di traduzione dipende dalla regione RBS. Quindi l'efficienza cn il

quale il ribosoma si attacca alla RBS può essere minor o maggior efficiente.

Regolazione dell'espressione genica sequenziale a livello della trascrizione

La differenza rispetto ai sistemi precedenti sta nel

nome sequenziale ossia alcuni geni coinvolti in un

processo cellulare sn trascritti e tradotti per primi.

Questo innesca la trascrizione e traduzione di una

seconda serie di geni i cui prodotti sn coinvolti nei

passaggi successivi di un processo metabolico. A sua

volta innesca la trascrizione di un terzo gruppo di geni

e così via.

Esempio: batteriofago di B. subtilis. Abbiamo gruppi di

geni trascritti precocemente, oppure in uno stadio

intermedio oppure tardivamente. La suddivisione della trascrizione è correlata al meccanismo di

dupliczzione del batterifoago nela cellula ospite. Se parliamo di geni trascritti in mommenti diversi

nell'infezione, se parliamo dei precoci le subunità della RNA polimerasi viene completato di un

aggiunta di un fattore sigma specifico per i geni precoci. Quindi questa RNA polimerasi col sigma

riconosce il Promotore dei geni precoci determinando trascrizione e traduzione. Questo determina la

formazione di un altro sigma diverso dal precedente si attacca all'RNA permettendo il suo attacco al

Promotore dei geni intermedi trascrivendoli e traduce. A sua volta viene sintetizzato un 3° fattore

sigma che si attacca alla RNA polimerasi permettendo il suo aggancio al promotore dei geni tardivi

trascrivendoli e traduce.

Sentire l'ambiente

Le cellule batteriche sentono variazioni ambientali in cui si trovano (quorum sensing ossia percepisce

una quota solida al di sopra della quale innesca delle risposte. Se aumenta trp la densità cellulare

abbiamo la formazione del biofilm attivando i geni responsabili della sua formazione; temperatura,

disponibilità di metaboliti, osmolarità).

Ogni specie batterica che ha la capacità del quorum ha un enzima che sintetizza per delle molecole

segnale per disponibilità di nutrienti, densità ecc. Queste molecole segnale è chiamata omoserina

lattone acilato (AHL). Queste AHL sono INDUTTORI ossia la presenza di un elevata conc. di AHL fa si

che esse si combinano a una proteina regolatrice permettendo la trascrizione di geni controllando il

quorum sensing. ??????

Esempio: nel Vibrio visceri (vive in ambienti acquosi e quando la densità cellulare supera un certo

livello, il batterio emette luce). Emette luce a seguito della presenza dell'enzima luciferasi che

richiede ossigeno e una notevole quantità di energia.

Trasduzione del segnale (o Sistema a due componenti)

Questo sistema di percezione ambientale giocano 2 proteine. E' diffuso nei batteri e si basa sulla

presenza di una proteina chiamata SENSORE (percepisce il segnale) e di una EFFETTORE (innesca la

reazione della cellula a quel certo stimolo ambientale. Esempio chemiotassi).

E' un processo continuo di fosforilazione e defosforilazione dal sensore all'effettore. Per questo il

sensore si chiama anche CHINASI xk ha la capacità di autofosforilarsi qnd percepisce il segnale e

poi trasferisce il gruppo P all'effettore.

La prima componente di sto sistema a 2 componenti è la chinasi sensore. Quindi avverte il segnale,

si autofosforila, l'a.a. che viene fosforilato è sempre una Hys, trasferisce il gruppo fosfato alla

proteina regolatrice o effettore. Essa è un attivatore trascrizione e quindi fa trascivere i geni

coinvolti nella risposta a quel determinato stimolo ambientale.

Nel B. subtilis la sporificazione è mediata da fosforilazione e defosforilazione a cascata di una serie

di proteine che alla fine portano alla sporulazione. Ci vogliono 6/8h per sporificare, in qst tempo

entrano in gioco 500 geni trascritti e tradotti sequenzialmente in seguito allo stimolo chimico che è

la mancanza di nutrienti. L'inizio della sporulazione nn inizia appena mancano i nutrienti xk il

battere fa altre risposte per cercare di sopperire alla mancanza. Se nn riesce allora inizia la

sporulazione. Quali geni intervengono all'inizio o alla fine o intermedi è sempre grazie ai mutanti.

Chemiotassi: sistema a due componenti

La prima fase è la risposta della cellula a stimolo esterno. Entrano in gioco solo proteine indicate

come MCP (proteine sensore o chinasi sensore). Quando uno stimolo ambientale si lega al sensore

accade una modificazione della sensore che col contributo della proteina CheW inizia la

fosforilazione-defosforilazione. Quindi il sensore legata allo stimolo chimico fosforila CheA. La CheA-

P agisce fosforilando la proteina CheY che quando è fosforilata inizia la fase II (controllo del senso

di rotazione del flagello).

Nella seconda fase la CheY-P interagsice col motore del flagello inducendolo a ruotare in senso

orario con un conseguente cambio di direzione della cellula. Orario xk stiamo parlando di repellenti e

quindi la cellula deve allontanarsi, se no era in senso antiorario. Se CheY nn è fosforilata nn

interagisce col motore che quindi continua a ruotare in senso antiorario. Quindi fosforilo la Y solo

qnd c sn segnali ambientali. La continua presenza all'esterno di molecole repellenti aumenta sempre

di più la fosforilazione di CheY che continua a provocare cambiamenti nella direzione di marcia della

cellula.

Nella terza fase la cellula deve sempre percepire se

all'esterno c sn repellenti o meno. Quindi deve resettare

tutto il meccanismo per continuare temporalmente la

presenza o meno dei repellenti. Questa fase è chiamata

ADATTAMENTO. Sono coinvolte le proteine CheR che

aggiunge gruppi metilici al sensore. Entra in gioco

anche la CheB che ha una finzione contraria alla CheR.

Quando CheB è fosforilata è più attiva nella sua

funzione.

Il diverso grado di metilazione della sensore determina il cambiamento conformazione della sensore

stessa innescando reazioni che portano al variare del senso di rotazione del flagello.

Se CheY e CheB nn sn fosforilati la cellula si avvicina all'attraente in linea retta.

Se CheB nn è fosforilata nn è efficiente nel staccare gruppi metilici dalla sensore e quindi la

metilazione della sensore continua da parte di CheR aumentando. Quando MCP (sensore) ha tutti i

siti metilati nn può più rispondere al segnale chimico esterno xk è saturata. Se il livello di attraente

rimane alto ma costante la cellula si capovolge.

Dopo un certo periodo di tempo CheB si fosforila andando a demetilare la sensore re-iniziando a

percepire segnali esterni. La fosforilazione di CheB deriva dal P di CheA legata a CheW.

Tutto questo è sempre stato dimostrato attraverso mutanti.

Esistono molti altri componenti che riconoscono molecole

segnali diverse attivando chinasi differenti.

Nell'ultimo abbiamo la regolazione della porine attivato

dalla pressione osmotica esterna. La chinasi sensore è la

EvZ e la effettore è la OmpR.

La cellula di E. coli si può trovare in un ambiente in cui

l'osmolarità varia regolando la produzione di porine. La

porina F prevale nella cellula qnd siamo in bassa

osmolarità; la porina C si trova qnd siamo in alta

osmolarità. Ovviamente se siamo in qst situazione è

inutile che continuo a produrre la F e viceversa.

Entramni i geni che codificano qst porine sn controllati

a livello trascrizionale con un meccanismo a 2

componenti (chinasi ed effettore). Inoltre abbiamo

anche la modulazione di questi due geni OmpF e OmpC

attraverso l'ultizzo di sRNA.

I pori formati qnd viene formata la C sn più piccoli

rispetto ai pori di quando viene formata la F.

I pori della C si formano in condizioni di alta pressione osmotica e sn piccoli, i pori della F viceversa.

Se l'osmolarità è elevata la sensore si autofosforila trasferendo il P fosforilando la effettore

(regolatrice) OmpR sempre a livello di un aspartato. Quando è fosforilata la OmpR sappiamo che

serve la porina C e allora attiva con maggior efficacia la trascrizione del gene che codifica per la

porina C (ompC).

Se l'osmolarità è bassa allora vado a trascrivere per la F.

Quindi se abbiamo alte concentrazioni di OmpR-P, ompF è represso e ompC è attivato. Se abbiamo

basse concentrazioni di OmpR-P, si attiva il gene ompF.

Ricorda che OmpR si lega ai promotori di entrambi i geni.

L'espressione di ompF e ompC è regolata anche a livello post-trascrizione attraverso la sintesi di

MicF RNA e MicC RNA.

Se attivo la trasvrizione di OmpC attivo anche la trascrizione di MicF.

Qnd la cellula si trova senza a.a ativa la trascrizione dei geni coinvolti nella sintesi. Qnd si trova in

carenza di più a.a attiva una risposta globale che va a interferire con la sintesi specifica degli a.a

ma anche con la duplicazione del DNA, trascrizione ecc. Spengo e attivo molti operoni che

permettono alla cellula di risolvere la mancanza di a.a.

Livelli di regolazione globale nei batteri

Un battere qnd si trova in ambiente in cui mancano gli a.a attiva la trascrizione di operoni coinvolti

nella sintesi di quell'a.a. ma la risposta alla mancanza di più a.a è più complessa.

La molecola che risponde alla deprivazione di a.a innescando una serie di inibizioni e attivazioni

degli operoni è dovuta alle ALARMONI indicando che qst piccole molecole captano variazioni

nell'ambiente esterno.

La ppGpp è una guanosina pentafosfato che soi attiva qnd mancano a.a.

La cellula risponde anche qnd siamo in shock termico ossia situazuoni nn fisiologiche per la cellula.

Esempio passando da 37°C a 45°C in E.coli si va in shock temrico e essa cerca di proteggere le

proteine da fenomeni di denaturazione.

Oppure la cellula risponde a stress ossidativi producendo enzimi anti ossidanti.

Qst 3 esempi indiciano cm la cellula risponde globalmente a un determinato fenomeno.

L'adattamento del battere a modifivazioni dell'ambiente si esplica sempre in una riprogrammazione

dell'espressione di una serie di geni inducibili o reprimibili. Si parla di proteine che hanno funzione

regolatoria della trascrizione dei geni globale.

Come primo esempio vediamo una risposta da uno stress

termico e quindi come è controllato la espressione dei geni

heat-shock. La trascrizione dei geni in certi situazioni è

sempe dovuto a un fattore sigma.

Il sistema si basa sull'intervento di 2 sigma: il primo è quello

indicato come sigma H (o sigma 32) e anche il sigma E.

Il sigma H qnd è complessato con la sua RNA polimerasi attiva

una serie di geni HSP che codificano: chaperonine molecolari

(assunzione della coreetta struttura terziaria -folding-) o

proteasi ATP dipendenti. L'insieme di queste due funzuoni

determina la stabilizzazione o degradare il fattore sigma H. E. coli

Qst vuol dire che in T° normali (assenza di shock termico) la

trascrizione di qst geni viene mantenuto a bassi livelli di concentrazione xk nn servono prtoeine che

servono a proteggere la cellula a T° fuori dal ramo fisiologico. Quindi il fattore sigma H è mantenuto

a livello basale grazie alle proteasi.

Se la T° è superiore alla norma, aumenta la capacità di sigma H di legarsi all'RNA polimerasi. Qst

maggiore stabilità di sigma H è dovuto al fatto che il gene che codifica il sigma H è trascritto con

maggiore efficienza. Qst maggiore efficienza è dpvuta al fatto che avviene la stimolazione del sigma

E che permette la tarscrizione dell'mRNA che sintetizza sigma H e traduzione di proteine che

rispondo a stress extracitoplasmatici.

Se si parla di cold-shock saranno diversi i fattosi sigma che intervengono ma il principio è sempre lo

stesso: sintetizzare prodotti genici utili in quel preciso momento.

Esistono sistemi analoghi in altri batteri.

Quindi c'è sempre la cascata dei fattori sigma e reazioni di fosforilazione e defosforilazione. Qst

due fenomei insieme permettono l'innesco successivo sia temporalmente che spazialmente dei 500

geni che intervengono nella sporulazione.

Un altro esempio è qll che determina la tarscrizione dei geni che sintetizzano prodotti che

proteggono il battere dai danni dei raggi ultravioletti.

Se la cellula riesce a riparare i danni da mutazioni

allora la cellula vive, se i danni sn trp estesi la cellula

muore. Ecco xk usiamo i raggi UV per sterilizzare.

Esistono diversi meccanismi cn il quale il battere ripara

i danni al DNA: il primo è l'SOS chiamato così xk i geni

coinvolti nel riparo del DNA presentano nella regione 5'

una corta sequenza di nucleotidi comune a tt i geni.

Quindi si sospetta che tt qst geni sn controllati insieme.

Qst regioni sn chiamati SOS. Sn tt in diversi operoni,

pronti a rispondere e riparare DNA.

Se la cellula nn subisce danni qst geni nn vengono trascritti e un ruolo principlae è la LexA che si

regola alla regione SOS reprimendo la trascrizione dei geni DIN che sn qll che intervengono nel

riparo del DNA.

Se la cellula subisce danni da raggi UV si ha un'immediato blocco della replicazione del DNA. Una

conseguenza dello stallo delle forche replicative è la formazione di ssDNA (frammenti di DNA a

singola elica). La presenza di regioni a singola elica nel DNA attiva la proteina RecA che si legano a

qst regioni permettendo l'attivazione dei meccanismi che portano riparo ai danni. Se RecA

complessata con DNA a singolo filamenti ripara i danni vuol dire che è partita la trascrizione dei

geni che riparano. Qst xk RecA è in grado di degradare LexA che era legata alla regione SOS dei

geni che riparano. Ma quindi se c'è danno si formano singoli filamenti a cui si lega RecA che

degrada LexA così che la regione SOS è libera e la RNA polimerasi si attacca alla sua regione P

trascrivendo i geni che riparano il DNA.

La LexA inibisce geni che permettono la ricombinazione omologa (riparo) ma anche operoni i cui

prodotti sn coinvolti nei meccanismi di riparo del DNA.

Un altro esempo di regolazione globale vede la presenza di una piccola molecola ossia la guanosina

tetra o pentafosfato intesa come ALLARMONE che induce la trascriuzione e tarduzione di geni che

rispondono a una situazione critica.

Il punto di partenza è la carenza di a.a. Quindi è diverso dalla regolazione di un singolo a.a.

Il primo effetto è il blocco della sintesi delle proteine. Se mancano allora viene inibita anche l'inizio

della replicazione del DNA xk mancano enzimi coinvolti. Qnd si ha il blocco della sintesi proteica

avviene però la sintesi dell'allarmone. Il suo accumulo nella cellula determina una sua risposta: da

una parte l'inibizione di una serie di operoni che formano tRNA e rRNA dato che nn c'è sintesi

proteica; inoltre dato che siamo in carenza di a.a esso attiva operoni biosintetici (sintesi degli a.a in

qst caso dato che mancano a.a) e catabolici.

Così la cellula cerca di rispondere globalmente alla carenza di a.a o altri fattori scatenanti.

Attraverso l'isolamento di mutanti coinvolti nelal risposta

globale di qst tipo (controllo stringente), si è arrivati a

dimostrare che due proteine hanno un ruolo

fondamentale nella ridsposta della cellula a qst segnale

attraverso qst meccanismo. Una è la RelA che ha la

capacità di formare la guanosina pentafosfato che poi

diventa tetrafosfato che innesca la serie di risposte di

attovazione o inattivazione. L'altra è chiamata SpoT che

ha funzione di idrolizzare e sintetizzare penta o

tetrafosfato.

Abbiamo un ribosoma localizzato sull'mRNA che deve tradurre e le due proteine.

In carenza di a.a c'è un eccesso di tRNA scarichi. Qst tRNA scarichi si legano cn minor efficienza al

sito A del ribosoma impedendogli di svolgere la sua funzione. In qst modo rimane un filamenro di

mRNA nn tradotto che viene riconosciuto da RelA che è il sgenale x formare gianosina pentafosfato

in prensenza di GTP con formazione di GDP. Successivamente si forma la guanosina tetrafosfato.

SpoT contribuisce alla sintesi o alla idrolisi di guanosina tetra qnd la cellula ha ripristinato la

situazione fisiologica ossia ha a.a. Viene idrolizzata in GDP che grazie a una proteina NdK si riforma

GTP usata dalla RelA per formare guanosina pentafosfato.

Il sistema descritto è di E.coli. Se inattiviamo RelA in un mutante e infettiamo un topo con il

batterio della tubercolosi, il batterio si replica ma nn provoca la tubercolosi cronica nel topo.

Il Rhizobium che forma i noduli della radici, se RelA è inattiva nn si formano.

L'ultimo esempio di regolazione globale è la sporificazione. E' un casino xk abbiamo 2 compartimenti

cellulari che qst geni devono funzionare: cellula madre che si allunga, formazione del sotto

asimmetrico e inizio dei 7 stadi che portano alla liberazione della spora.

Il processo è stato studiato in B. subtilis e i geni coinvolti sn sempre indicati cn Spo (sporulazione)

con un n° che identificano le fasi di sporulazione. Accanto abbiamo una lettere dell'alfabeto che

inducano gli oeproni attivati in qll precisa fase.

Lo stimolo principale è la carenza di nutrienti ma prima di attivare la sporulazione la cellula cerca

di attivare altri meccanismi che se deovessero funzionare permettono alla cellula di nn sporificare

cm la produzione di antibiotici, biofilm, tossine. Produce antibiotici xk essi uccidono altre cellule

batteriche presente nello stesso habitat così da farle lisare e liberare nell'ambiente precursori, lipidi

ecc che permettono di essere usati dalla cellula per crescere senza sporulare. Produce tossine xk

serve sempre per uccidere cellule batteriche che nn si adattano subito alla situazione ambientali

ciulando i loro precursori e fonti di nutrimento.

La regolazione di qst meccanismi è l'intervento a cascata di diversi fattori sigma indica che vengono

trascritti e tradotti operoni diversi. Oppure abbiamo reazione di fosforilazione defosforilazione.

Si ha temporalmente trascrizione diversa dei geni xk è un evento a cascata e ad ogni salto si ha

attivazione di un fattore sigma contemporanea a fosforilazione e defosforilazione di proteine che

controllano la sintesi dei sigma. Spazialmente xk per un certo periodo di sporificazione nella cellula

madre si sviluppa la spora. Quindi i fattori sigma devono agire nella spora e nella cellula madre in

modo coordinato.

La proteina che attiva i geni coinvolti nella sporulazione nel caso la cellula nn ha bypassato la

mancanza di nutrienti è la proteina Spo0A. Fosforilata induce la trascrizione di tutti i geni della

sporulazione. Mentre è P, blocca l'attività di un'altra proteina avente effetto contrario.

Spo0A si fosforila attraverso l'intervento di chinasi e la catena di fosforilazione defosforliazione

porta a fosforilare Spo0A inducendo la trascrizione dei geni.

Dobbiamo vedere il secondo fattore della sporulazione: il fattore sigma. Abbiamo 5 sigma che

intervengono. In E. coli il fattore sigma che garantisce tt i metabolismi di base è il 70. In B. subtilis

il suo equivalente si chiama sigma D.

Il primo sigma che interviene che sostituisce il sigma D è il sigma H. Poi vengono innescati i sigma F,

E, G e K attivati nelle diverse fasi della sporulazione. Tt qst sigma vengono sintetizzati nella cellula

come pre-sigma inattivi e attivati per complessarsi cn la RNA polimerasi ecc.

La attivazione dei pre-sigma avviene da parte di proteine Spo fosforilate o meno. Ecco che i due

fenomeni si compenso x la sporulazione.

La cellula madre quindi forma un setto asimmetrico e poi inizia la formazione della spora lisando la

madre eliminando la spora nell'ambiente.

Durante qst ciclo vengono sintetizzati fattori sigma diversi (F, E, G e K) dove F e G sn attivi nella

spora nascente, E e K nella madre. L'F attraversa il setto per agire sul sigma E. La sigma F

determina la sintesi e attivazione di sigma E. Il fattore sigma F è tipico della pre-spora.

Regolazione traduzionale

Un battere può regolare anche la traduzione di qualche cosa. Può controllarla attraverso la

sequenza S-D o RBS ove si lega il ribosoma oppure:

nell'operone S10 di E. coli (S per small) è formato da geni che se vengono trascrtti e tradotti sn

respinsabili di proteine ribosomali che formano subunità minore e maggiore del ribosoma. In

situazione normale quindi la cellula trascrivere qst operine e lo traduce x avere le proteine per

formare le subunità del ribosoma.

Il ribosoma è formato da proteine e rRNA. Qnd la cellula si trova in una situa in cui rRNA

tracsrirve e traduce l'operone S10 xk ha la seconda componente del ribosoma. Ma se manca rRNA

è inutile che sprechi energia x trasrcivere quell'operone xk poi le proteine me le infilo nel culo.

Se quindi l'S10 viene trascritta si ha la formazione di mRNA ma si bliocca la traduzione qnd si

forma la proteina L4 dell'operone xk si lega all'estremità 5' dell'mRNA dell'operone S10 impedendo

la traduzione. Ma la L4 è un prodotto genico di qst mRNA? chiedere

Quorum sensing in riferimento alla Bioluminescenza

Dipende molto dal quorum sensing. Inoltre il fenomeno fu applicato in pratica andando a progettare i

biosensori.

La modalità attraverso la quale le cellule sentono qualcosa è il quprim sensing gestendo fenomei di

virulenza, biofilm, motilità, produzione di antibiotici, coniugeazione, la competenza (cellule pronte ad

accettare DNA esogeno), sporulazione e bioluminescenza.

Il quorum sensing è un meccanismo di trasmissione del segnale da cellula a cellula. Qst tipo di

comunicazione siattiva qnd la densità cellulare supera un certo quorum. Le cellule producono

molecole chiamate AUTOINDUTTORI nel citoplasma della cellula ma essi vengono secreti nel terreno

di coltura. Qnd la conc. di queste molecole segnale supera una certa soglia allora le stesse molecole

rientrano nella cellula batterica andando a complessarsi cn le proteine regolatrici e il complesso

scaturito attiva i geni che rispondo a quel tipo di segnale (per es. i geni responsaibili della

formazione del biofilm o bioluminescenza).

Il fenomeno è valido sia nei batteri gram- sia gram+ avente differenze in base alla natura chimica

delle molecole segnale e anche il meccanismo cn cui gli autoinduttori rientrano nella cellula. Nei

gram- rientrano per diffusione semplice, nei gram+ attraverso un sistema di trasporto specifico ABC.

Le proteine chiave derivano da geni quali la LuxR (regolatoria) che attiva la traxrizione di certi geni

che producono la preoteina regolatrice e la LuxI ossia il gene della sintesi dell'autoinduttore e

contemporaneamente si ha la moltiplicazione delle cellule aumentando la conc. dell'uato all'esterno e

qnd si raggiunge il quorum rientra che si complessa con la proteina regolatrice. Un sistema di

quorum bioluminiscenti è indicato con LuxR e I.

C sn tanti geni in un operone che produce la luciferasi che permette al batterio di emttere luce. Fa

parte il gene LuxR che codifica per la proteina regolatrice.

Serve O2 e energia. Il batterio emette luce sl qnd la conc. cellulare ha raggiunto una certa densità.

In un calamaretto le cellule di Vibrio visceri è racchiuso in un sacculo e determina in qst modo la

produzione di luce. Qst è utile xk può sfuggire ai predatori xk si mimetizza cn l'ambiente. Vibrio

visceri può vivere in acqua ma nn potrà mai raggiungere livell tali da fare bioluminiscenza xk è

troppo disperso e diluito l'ambiente.

Se in acqua c'è tossina, Vibrio visceri nn cresce e nn fa luminescenza. Lo si usa per dimostrare la

presenza di inquinanti.

In generale la emissione della bioluminscenza dipende dalla quantità di tossina.

Nel Photobacterium phosphoreum (nome vecchio di vibrio visceri) possono essere messe in provette

on conc. diverse della tossina a cui è sensibile il vibrio. Qst biosensori possono essere usati per

verificare la capacità e la velocità cn le quali un batterio può mineralizzare una sistanza inquinante

in un certo luogo. In ql caso si deve ingegnerizzare il batterio a livello genomico x dare un segnale.

Inserendo l'operone Lux in un plasmide permette che il sistema di trascrizione e traduzione di E.

coli lo legga oppure direttamente nel genoma di E. coli diventanto biolimuniscente.

TRASDUZIONE

GENETICA BATTERICA (TRASDUZIONE)

Parliamo di fagi o batterifoagi specifici per cellule

batteriche. Tt sn morfologicamente organizzati come il

batteriofago della immagine (serie T).

L'immagine illustra che tipo di ciclo vitale può avere un

batteriofago. Essi sn suddivisi in 2 classi in funzione

della loro modalità di replicazione: virulenti (vanno

incontro a ciclo litico in cui l'esito finale dell'infezione

fagica virulenta porta alla lisi e morte della cellula

batterica. Contemporaneamente vengono liberate

nell'ambiente centinaia di nuove particelle fagiche che

derivano dal fatto che nella cellula batteriche è

avvenuta la moltiplicazione delle cellule virali). Possiamo distinguere il processo di infezione e lisi in

4 fasi:

1. adesione alla cellula batterica. Distinguiamo una sottofase reversibile e irrevesersibili. Essi si

riferiscono al fatto che il batteriofago in un primo momento prenda contatto con la celliula

batterica in modo casuale, non è specifico. Nella irrevesersibile il batterifoago riconosce il

proprio recettore sulla superficie della cellula batterica stabilendo un legame. Questo recettore

può essere un pilo specifico oppure qnd abbiamo parlato dell'operone maltosio avente tra i geni

strutturali la LamB coinvolta nel metabolismo del maltosio ma anche è recettore per il

batteriofago di E. coli nello specifico. Se è reversibile nn c sn recettori. Se la cellula è insensibile

è xk mancano recettori specifici.

2. Fase di penetrazione! Nella immagine vediamo un quadrato che specifica che il virione inietta

nella cellula batterica solo il genoma. Il capside rimane tt fuori dalla cellula. Parlando di

infezione di cellule animali con virus, esso entra nel citoplasma delle cellule eucariotiche

completi del capside. Poi all'interno le proteine del capside verranno degradate liberano il DNA.

Il batteriofago inietta il proprio genoma all'ijterno del battere (parlando della serie T) xk hanno

struttura in cui all'interno abbiamo un tubo cavo circondato da una guaina di natura proteica.

Qnd il batterifiago riconosce il recettore la guaina si schiaccia permettendo al tubo di

penetrare all'interno della parete cellulare e entrare nel citoplasma. I virus cmq nn hanno

ribosomi quindi se devono replicare il proprio genoma e sintetizzare proteine del capside ecc

hanno bisogno del macchinario biosintetico del

battere.

3. Fase biosintetica nella quale nel citplasma del

battere avvengono la replicazione del genoma,

traascrizione e traduzione. Quindi avviene la sintesi

d tt le componenti che servono per formare nuove

particelle virali. Vediamo le fimbrie, guaina, capside

prodotti singolarmente. Poi ognuno di essi dovranno

riassemblarsi x formare il batteriofago in toto.

4. Maturazione. Avviene attraverso un meccanismo di

autoassemblaggio dei componenti per formare nuove

particelle fagiche. c'è una certa successione in qst autoassemblaggio in cui il DNA duplicato

viene incapsulato nel capdide prima che esso si leghi alla guaina e successivamente ad essa si

legano le fimbrie ecc.

5. Rottura della parete cellulare e membrana della cellula infettata con liberazione di centinaia o

migliaia di nuov particelle fagiche con conseguente morte del battere. I nuovi fagi liberati

possono reinfettare nuove cellule batteriche a loro specifiche e iniziare il ciclo di nuovo. Se

devono rompere la cellula insomma c deve essere qualche attività enzimatica che intervengono:

ne abbiamo 2! Esse possono essere raggriuppate nelle: oline che provocano la formazione di pori

nella membrana e attraverso essi vengono libeati la seconda classe di proteine che sn enzimi

che attaccano e degradano la parete cellulare.

Gli altri fagi sn detti temperati che possono fare ciclo

litico e lisogenico. Il fago si lega al recettore, inietta

l'acido nucleico e per replicare il proprio DNA sfrutta il

macchinario biosintetico dell'ospite come prima.

Ma essi possono intraprendere il ciclo lisogenico. Le

prime fasi sn uguali xk deve sempre esserci

riconosciumento del recettore specifico e l'inserimento

del suo acido nucleico. Da qui le cose cambiano! Durante

il ciclo lisogenico l'acido nucleico del fago si integra nel

genoma della cellula batterica. Qnd l'acido nucleico si è

integrato prende il nome di profago! La cellula batterica se è in condizioni ottimali per crescere si

moltiplica duplicando il proprio DNA duplicando anche il DNA del profago. La cellula nn ha nessun

danno e continua a moltiplicarsi. Il battere che contiene nel genoma un profago si chiama

BATTERIO LISOGENO. Esso può morire xk in certe situazioni, cm l'irraggiamento della cellula

lisogena con raggi UV, si può avere l'excisione del profago dal genoma batterico intraprendendo il

ciclo litico. Un esempio di fago temprato è il Batteriofago Lambda. Uno di fago virulento sn i

Batteriofagi della serie T (pari e dispari).

Queste informazioni sn utili x capire le 2 tiplogie di trasduzione:

• generalizzata

• specializzata

La trasduzione è un meccanismo di trasporto del materiale genetico trasducente da un donatore a

un ricevente mediato da un batteriofago.

La trasduzione fu scoperta nel 1951 da Lederberg (test

di fluttuazione) e Zinder che lavorarono sul batterio

gram- Salmonella typhimurium che preferiscono

l'apparato gastrointestinale.

Lavorarono cn due mutanti di Salmonella aventi un

genotipo indicato in figura (il primo nn fa met e his

mentre il secondo il contrario). Mettendo a contatto qst

2 ceppi ausotrofi per diversi a.a. sn riusciti a

osservanre la comparsa di prototrofi ossia ceppi di

Salmonella che possono sintetizzare tt gli a.a. La

frequenza cn la quale ottenevano qst prototrofi era 1/10^5. Ottenre un prototrofo di qst tipo può

essere anche spiegato mediante coniugeazione dato che Salmonella ha il pilus sessuale. ma anche

che essi fossero originati da trasformazione. Ma qst due meccanismi nn c'entrano nnt spiegandolo

con un esperimento. Usarono un tubo a V separato nella base da un filtro che nn permette il

passaggio di cellule batteriche ai due lati. E' un filtro avente pori molto piccoli (0.22 µm gli stessi

nel processo di sterilizzazione di soluzione termolabile). In una delle 2 parti del tubo viene

inoculato il ceppo ausotrofo per met e his e nell'altro

lato l'altro ausotrofo. Se tarsferiamo su terreno minimo

(C e sali) nessuno dei due prelivebi fatti dai singoli tubi

permette di ottenre colonie. Raramente (1/10^5)

riescono a crescere xk è prototrofo. Lo ottenevano dal

lato dove c'era il secondo ceppo. Nn poteva essere

coniugazione xk nn c'era contatto e neanche

trasformazione xk le cellule erano vive. Inizialmente la

spieazione era reputata da un'agente filtrabile xk

passava il filtro. Poi fu scoperto che qst agente è lo

stesso fago.

Trasduzione generalizzata: qualsiasi frammento di DNA della cellula donatrice puòe ssere trasferito

alla ricevente (es. geni localizzati vicino all'O di replicazione del genoma oppure anche geni situati

dalla parte opposta). Il frammento di genoma batterico trasferito può essere lungo a seconda

dell'acido nucleico del fago coinvolto xk il capside ha una sua capacità massima di conteninemto di

DNA. L'acido nucleico del virus deve moltiplicarsi usando i nucleotidi del battere dato che il genoma

batterico viene degradato producendo frammenti nel proprio citoplasma. Può accadere che durante

la fase di assemblaggio nel capside della particella virale in via di assemblamento nn venga

accumulato l'acido nucleico virale ma venga accumulato il framnento del genoma batterico dato che il

fago nn riconosce il suo o quello del battere. L'importante è che sia lunga uguale. E' un evento raro

questo. Quindi quando i fagi vengono liberati abbiamo particelle virali wilde type ma anche fagi con

DNA batterico. Questi fagi trasducenti se infettano nuovi batteri iniettano il loro acido nucleico nel

suo citoplasma. Qst DNA dovrebbe andare incontro a ricombinazione col genoma della cellula ospite.

Ecco xk otteniamo prototrofi dei 4 a.a. in quell'esperimento. Quindi con la trasduzione possiamo

costrutire le mappe genetiche del genoma batterico xk se la diemnsione del frammento del battere

accumulato nel capside è limitato dal capside stesso, riusciremo a cotrasdurre tt i geni che sn

contenuti in quel capside e basta. (Pag.329)

Trasduzione specializzata: con qst noi riusciamo trasdurre solo e sempre lo stesso framnento di

genoma batterico e nn uno qualsiasi. Il frammento dipende dal punto in cui l'acido nucleico del fago

temprato si è inserito nel genoma batterico. Quindi i fagi temperati si inseriscono in punti specifici

sul genoma. Il lambda di E. coli per esempio si inserisce in una regione finacheggiata a sx

dall'operone gal e a dx dall'operone bio (produce biotina). Si integra solo qui xk sia sul DNA del

fago lambda che sul DNA batterico sn presenti sequenze uguali che permettono un fenomeno di

ricombinazione specifica.

Sn presenti sia sul DNA del fago che sul DNA della coli regioni att che permettono la

ricombinazione tra le due forme di DNA. Qst lambda si inseriscono solo in qst punto e quindi tt i

batteri lisogeni di E. coli avranno il profago sempre e cmq in qst punto.

In certe situazioni il profago può essere exciso. Ecco che qui entra in gioco la trasduzione

specializzata.

Nella immagine vediamo il batterio in arancione il

genoma del fago che contengono geni che producono

proteine che stabliscono quale ciclo intraprendere.

La ricombinazione avviene qnd si hanno delle cassette

ibride formate su entrambi i DNA. Se avviene in modo

sito-specifica sfruttando le regioni di omologia la

excisione è perfetta xk si scinde solo l'acido nucleico

del fago lambda.

Se la ricombinazione nn è precisa xk avviene in modo

aspecifico. Quindi l'acido nuleico del lambda conterrà un frammento del genoma della cellula

batterica, un frammento che può essere gal o bio. Quindi qst fago avrà perso una parte dei propri

geni sostituiti dal gal o bio. A sua volta nel DNA batterico avremo inseriti uno o più geni tipici del

fago.

Le particelle avente nel capside qst tipo di acido nucleico si chiamano Lambda D-Gal o Lambda D-

Bio (D per Difettivi xk alcuni geni sn rimasti nel DNA

batterico).

Se prosegue normalmente il ciclo litico avremo

particelle lamnda normali e difettive. Se c sn ospiti

specifici che fine fanno le difettive? Dipende dai geni

persi. Se abbiamo Gal+ avviene ricombinazione con DNA

batterico di un altra cellula sito specifica si ha la

formazione di un diploide parziale xk avremo nel

cromosoma batterico sia Gal- del battere, sia Gal+ del

fago. Qst situazioe si ha qnd la particelle difettiva

contiene nel DNA il gene che codifica l'enzima coinvolto nel processo di integrazione (Integrasi).

la presenza nella stessa miscela di particelle wilde type e difettive, la presenza di wilde type funga

da fago helper. Lo metterà per scritto.

Oppure può avvenire un doppio CO mediato

dall'omologia delle regioni att che stanno a fianco di Gal

dato che affinchè che venga ricombinazione i pezzi che

ricombionano devono avere dimensione minima oltre che

omologhi. Non si ha integrasi. Si ha uno scambio tra i

geni Gal ossia la difettiva acquisisce Gal- e la batterica

prende Gal+. Così la cellula ricevente diventa Gal+

acquisendo un nuovo fenotipo.

Qst meccanismi compresi coniugazione e trasformazione avvengono in natura. La possibilità di

trasferire geni aumenta la variabilità genetica.

Il battere può riconoscere l'entrata di acido nucleico che nn sia il suo. Lo riconosce ma nn essendo il

suo lo attacca e lo degrada. Qst avviene xk abbiamo i sistemi RM che modificano il DNA e

degradano qll nn modificato.

Il fago ha svilupatto metodi per bypassare questi sistemi RM attraverso la presenza di diverse basi

come la idrossimetil citosina che nn viene riconosciuta dagli enzimi di restrizione. Ma il batterio

vuole bypassare qst trucco e così via il fago.

I batteriofagi possono fare da vettore del DNA

batterico. Nella nostra clelula batterica col suo genoma,

la facciamo crescere in un terreno pesante nel senso

che vengono aggiunti azoto15 e H2 che sn radioisotopi.

Crescendo e modificandosi, se dopo la crescita in qst

terreno viene trasferita in terreno leggero e viene

infettata con fagi, nel corso del processo di trasduzione

generalizzata accade che in alcune particelle nel

capside venga accumulato DNA batterico mentre nella Esperimento di Ebel - Tsipis

maggior parte abbiamo DNA virale. Qst miscwla di

particelle fagiche viene depositata su gradiente di densità e i fagi infettivi wilde type (giallo)

rispetto ai trasducenti (capside con frammento batterico) hanno densità diversa xk hanno

incorporato element pesanti. Recuperiamo gli anelli dove s sn depositate le particelle fagiche e

andiamo a infettare batteri cresciuti su terreno leggero. Le fagcihe contententi genoma batterico

iniettano nella cellula batterica sensibile genoma batterico alla fine che si integra con qll della

infettata. Estraiamo il DNA e lo frammentiamo e misuraimo la densità dei frammenti che sarà

diversa xk in alcuni saranno presenti N15 e H2. Qst frammenti possono essere separati in funzione

della densità. Il leggero avrà un picco poco pronunciato rispetto al trasducente ma dimostra che le

fagiche possono trasdurre genoma batterico e qst derivano dalle cellule cresciute all'inizio su

terreno pesante.

BATTERIOFAGI E VIRUS ANIMALI E VEGETALI

Batteriofago con capside, lunga coda e struttura che

prende contatto col recettore.

Sono definiti parassiti genetici xk sfrutttano il macchinario

biosintetico dell'ospite Sn differenti tra loro nella dimensione e forma del capside.

Modificando la dimensioen del capside si varierà anche la

dimensione dell'acido nucleico contenuto.

Esistono diversi sistemi di classificazione:

DNA, tipo vibrione, dimensione del vibrione e presenza

dell'involucro esterno. Questo è il classico sistema di

classificazione dei virus.

L'altro è qll di Baltimore che si basa sul tipo di acido

nucleico distinguendo 7 classi!

Nel 2009 il comitato internazionale aveva il

compito di indicare un certo n° di ordini, famiglie,

sottofamiglie e specie inserendo in ognuna i

virus conosciuti.

Qll in rosso sn qll usati nel nuovo sistema di classificazione

Baltimore quindi individuò sette classi: 3 di queste hanno acido nucleico a DNA e le altre 4 avevano

RNA (entrambi cmq possono essere a singola elica, doppia elica ecc).

NN è possibile definire una struttura di un capside più frequentemente presente in virus e un altro,

tt dipende da come esso si replica nella cellula ospite.

Tipologie di Capside

E' sempre di natura proteica e può essere formato da una unica proteina oppure da svariate altre

proteine diverse tra loro, a seconda della complessità. Le forme principali dei capsidi sn elicoidali

oppure icosaedrica. C sn situazioni paricolari in cui il batteriofago ha il capsie collegato a una

struttura complessa.

Le modalità attraverso le quali le subunità proteiche si autoassemblano permettono di creare sia in

un caso o nell'atro degli involucri all'interno è presente l'acido nucleico.

Un esempio di forma d capside elicoidale è il virus a mosaico del tabacco. Una di natura icosaedrica

è il virus HPV (papilloma virus) per il quale recentemente è stato trovato ora un vaccino.

Nel TMV abbiamo RNA. All'interno del suo tubo cavo l'acido nucleico può formare legami con le

proteine del capside. Ci sn triplette di basi che fanno legame diretto con le proteine del capside.

I virus a RNA siano una conseguenza di qll che si presume sia stato un mondo a RNA e dato che sn

stati avvantaggiati sn arrivati sino ai giorni nostri. Un tempo in cui l'acido nucleico presente era qll a

RNA.

I virus animali sn a DNA per la maggiorparte e quelli vegetali sn a RNA. Alcuni fanno il salto di

specie (da animale a uomo) e questi si pensa siano più a RNA. Complessità del capside

Il pericapside è una membrana citoplasmatica che deriva

dalla cellula eucariote che ql virus ha infettato ed è una

conseguenza dell'uscita per gemmazione dalla cellula che

ha infettato (Herpesvirus). Anche il Paramyxovirus ha una

struttura simile.

Funzioni Pericapside o Envelope

Contiene e protegge l'acido nucleico da degradazione da parte di agenti chimici o fisici. Ma nn solo,

serve anche per il primo step delle fasi di infezioni di una cellula eucariote da parte di un virus

animale: serve per aderire alla cellula. In qst l'adesione è favorita dalle glicoproteine del

pericapside.

Serve anche per introdurre l'acido nucleico nella cellula. Ricordiamo che nei fagi solo l'acido entra

mentre negli eucarioti entra in toto. Qst fase di entrata di acudo nucleico nella cellula si chiama

Penetrazione.

In alcuni l'acido nucleico è indicato come (+) RNA significa che può essere già tradotto dall'apparato

ribosomiale della cellula ospite. RNA a polarità positiva può essere quindi subito tradotto. Se si parla

di (-) RNA allora nn può essere tradotto direttamente e quindi deve essere copiato in un (+) mRNA e

poi tradotto.

Nell'adenovirus vediamo l'acido nucleico, capside formato

da capsomeri indiciati col nome di Pentone che

occupano i vertici dell'icosaedro e una serie di esoni

che occupano altre parti della struttura. Inoltre dal

pentone parte una struttuira chiamata Fibra che è impo

nell'interazione dell'adenovirus con la cellula ospite.

Si chiamao pentoni xk interagiscono con altre 5 proteine

che formano l'adenovirus.

Nel Poxvirus nn ha una struttura tonda o elicoidale xk

qst virus hanno un capside definito a mattone. Sotto

MET, osserviamo la formazione nel capside di una

struttura biconcava chiamata CORE affiancata nella

parte in cui è concava da corpi laterali. All'interno del

core c'è l'acido nucleico del virus che è una molecola di

DNA a doppia elica.

Ricordare che è rivestito. I bastoncini sn proteine

presenti nella struttura biconcava che servono per il

processo di adesione e infezione del virus.

Envelope o Pericapside

E' formato da MC ma nn in tt i casi xk la tipologia dipende da come il virus animale esce dalla

cellula ospite dopo aver completato il suo ciclo vitale. Se esce per gemmazione, il nucleocapside si

avvicina alla MC della cellula eucariote stabilendo interazioni cn la MC che inizia ad avvolgere il

nucleocapoide. Qnd l'avvolgimento è completato il virione si stacca dalla cellula ospite e diventa

libero nell'ambiente. Alcuni escono dal nucleo e vengono rivestiti da membrana nucleare e esocitati

attraverso vari sistemi di secrezione. Cmq il punto è che sn rivestiti.

Quindi è formato da lipidi, proteine e glicoproteine.

Possiamo distinguere 3 tipologie di proteine aventi funzioni diverse:

1. Proteine Matrici che stabilizzano la struttura del pericapside

2. Glicoproteine. Sn proteine di membrana quindi aventi domini transmembrana che le permettono

di aver ela maggior parte della struttura rivolta all'esterno rimanendo ancorati alla MC. Sn

sottoposte dopo sintesi a varie modificazioni di glicosilazione. La maggior parte d esse sn

responsabili dele caratteristiche antigeniche del virus stimolando il suo sistema immunitario,

sfruttate per test che dimostrano la presenza di virus in campioni biologici di pazienti.

3. Proteine canale. Sn in grado di modificare il microambiente interno del capside.

I virus aventi l'envelope il ruole di adesione spetta a lei. Inoltre ha funzioni di camuffamento ossia

il virus qnd entra in contatto cn l'individuo, l'organismo ospite mette in atto rispsote aspecifiche e se

nn rirsce attiva il SI anticorpale e cellula mediata. La presenza di qst envelope sembrerebbe aver la

funzione di mascherare il virus agli occhi del SI.

C sn tanti vaccini contro diverse patologie di origine virale. Ma xk è difficile metterne uno a punto

contro un virus piuttosto che un batterio? XK l'acido nucleico virale viene duplicato, la fedeltà cn la

quale la polimerasi duplica l'acido nucleico è piuttosto bassa e quindi introduce sempre a ogni

duplicazione diverse mutazioni casuali. Se finisce in un gene che codifica per una glicoproteina

sostituendo un'a.a., cambia la caratteristica antigenica d qll glicoproteina.

Spettro d'ospite

Generalmente i virus sn specie-specifici xk riconoscono e si legano a recettori specifici su cellule

ospiti. Il n° d ospiti che un virus infetta dipende dai recettori specifici per quel virus. Se i recettori

sn su molte superfici di cellule ospiti allora il virus avrà un ampio spettro, se no na merda.

Se è vero che deve riconoscere un recettore specifico, possono avere molecole che impediscono il

riconoscimento e il legame del virus col recettore della cellula ospite bloccando il suo ciclo vitale.

7 classi di Baltimore.

Virus a dsDNA a doppia elica verrà trasvritto nell'mRNA da RNA polimerasi DNA dipendenti della

cellula ospite.

Se avessimo ssDNA (singola elica) l'RNA polimerasi nn può trascrivere xk DNA dipendenti.

Virus a ssRNA (+) può essere usato direttamente dal ribosoma eucariotico x tradurre, senza

intermedi. Qst servirà nn sl x la sintesi delle proteine ma anche duplicato.

Virus a ssRNA (-) nn può essere tradotto direttamente dai ribosomi. Trascrizione in un filamento a

RNA (+) ma nn c sn RNA polimerasi RNA dipendenti. Qst è un caso nei quali all'intenro del virione è

presente quella RNA polimerasi così che l'acido nucleico qnd entra nella cellula ospite viene

trascritto direttamente in un RNA (+).

Virus a dsRNA (±) nn può essere tradotto subito essendo a doppia elica. Serve la trascrizione del

filamento a polarità negativa in un RNA (+) da una RNA polimerasi virale.

I retrovirus (HIV) hanno un acido nucleico a ssRNA (+) quindi in teoria può eessere diretramente

tradotto. Nn accade quindi serve la sintesi di un intermedio di DNA a doppia elica dal quale viene

trascritto l'mRNA. Qst passaggio da virus a intermedio a DNA a doppia elica si chiama trascrittasi

inversa catalizzato da qst enzima con lo stesso nome che è di origine virale.

Alcuni farmaci antivirali sn contro patologie indotte da retrovirus e quindi sn inibitori della

trascrittasi inversa. Infatti il virus dell'HIV nel citoplasma viene liberato una moleca a singola elica,

ma se ho una molecola che ne blocca la funzione qll'ssRNA rimane così e nn completa il ciclo.

Posso usare molecole analoghi dei nucleosidi bloccando l'allungamento e quindi la sintesi della doppia

elica di DNA.

Duplicazione dell'acido nucleico delle 7 classi ed esempi

Classe I

Sn a DNA (±) in cui viene duplicato normalmente in un

altro DNA (±) oppure trascritto il filamento negativo in

uno mRNA (+).

Hanno effetti trasformanti sulle cellule, oppure

infezione cronica latente.

Classe II

Genoma a DNA a singola elica formando DNA (±) ecc.

Classe VII (Epatite B)

Sn a DNA a doppia elica ma una è frammentata e quindi nn può essere substrato della DNA

polimerasi eucariotica quindi serve completare l'elica. Da qui viene formato mRNA ma anche RNA (+)

formando DNA (-) che poi riformerà DNA (±).

Le altre sn tt a RNA.

Quindi ricordare la classificazione di Baltimore!!!!

Virus animale (generico)

Prima fase di assorbimento della cellula ospite.

Ricnoscimento di recettori specifici sulla cellula

bersaglio. La maggior parte dei virus che recepiscono i

rcettori sn sul pericapside. L'entrata comporta la

fusione del rivestimento del virus cn la MC della cellula

bersaglio. Nei virus animali il nucleocapside entra nel

citoplasma della cellula ospite. Oppure un virus animale

può entrare attraverso il quale una normale cellula

porta all'interno una serie di molecole (endocitosi) che

può essere dipendente da 2 proteine diverse oppure

indipendente. Quindi il nucleocapside si trova nel citoplasma della cellula batterica rivestito di una

membrana in cui abbiamo proteine specifiche della cellula ospite.

Seconda fase di penetrazione e decapsidazione. Una volta che il nucleocapside è entrato deve

accadere qiualcosa x cui l'acido nucleico sia rilasciato nel cito e a volte raggiungere nel nucleo. La

decapsidazzione cociste nella denaturazione delle proteine che formano il capside. Le modalità sn

diverse a seconda del virus. C sn alcuni viru animali che una volta che il nucleocapside è entrato

vengono inglobati negli endosomi, poi nei lisosomi dove il pH acido e enzimi degradati degradano la

struttura capsidica liberando l'acido nucleico. L'acido nucleico serve a trascrivere e tradurre tt le

proteine del virione e anche per la moltiplicazione dell'acido nucleico. Se avvengono qst fenomeni

allora nella cellula animale c sn prtoeine e acidi nucleici sufficienti per avvenire la fase di

assemblaggio e maturazione.

Terza fase di espressione genica e sintesi delle proteine virali.

Quarta fase i replicazione del genoma virale.

Quinta di assemblaggio e maturazione dei virioni. Avvengono nella cellula eucariote

contemporaneamente oppure l'assemblaggio avviene nella cellula ma la maturazione all'esterno.

Esempio il virus dell'HIV segue qst metodo.

Sesta fase di fuoriuscita dalla cellula. Può avvenire attraverso gemmazione per cui la particelle

virali e quindi nucleocapside viene a contatto con la MC che circonderà il virione oppure se

l'assemblaggio avviene nel nucleo, qnd la prticella virale esce dal nucleo si porterà dietro una parte

della membrana nucleare. Ma qst per uscire dal citoplasma può essere un semplice rilascio mediante

sistemi secretori che la cellula animale possiede. Può coinvolgere anche l'apparato di golgi fintanto

che il virione completo nn viene rilasciato.

Nei virus vegetali invece Artropodi fanno da vettore del virus iniettandolo nella cellula vegetale.

Alcuno virus vegetali si moltiplicano negli artropodi favorendo la diffusione. La diffusione del virus

vegetale da una cellula all'altra è vettoriata dai plasmodesmi.

Coltivazione dei virus

Fino a poco tempo fa la coltivazione dei virus animali

veniva effettuata in uova con embrione. Vediamo aghi

dimostrando in quali strutture si può iniettare il virus.

Poteva essere inoculato nella sacca allantoidea,

membrana corio-allantoinde, nella cavità amniotica a

seconda del virus.

Si potevano usare anche animali ma oggi si cerca di

sostituire gli animali con linee cellulari coltivabili in vitro.

Ma se nn riesco a coltivare linee cellulari fertili per il

virus devo perforza usare animali.

Come nei batteri, alcune specie nn possono essere coltivate in laboratorio ne cn linee cellulari ne cn

animali.

Studiare il virus è importante per la diagnosi e produzione di vaccini contro un virus (usando es.

linee cellulari del rene di scimmia).

Le macchie sn causate dall'infezione del singolo

virus che si è moltiplicato. I danni che il virus

provoca sn diversi: alcuni virus animali cm i fagi sn

litici, altri hanno un comportamento simile al ciclo

lisogenico dei fagi.

Ci possono essere anche effetti citopatici cn

formazioni di vacuoli, aggregati cellulari. Sn effetti

sotto osservazione al Microscopio. Le linee cellulari che sostituiscono gli animali devono

avere certe caratteristiche.

Alcune linee cellulari sn immortali ossia possono

essere mantenute all'infinito. Alcune sn definite

HELA che sn immortali che derivano da un tumore

di una signore americana. Sn immortali xk hanno

perso il controllo della divisione cellulare.

Il tipo di terreno utilizzato è liquido ma viene

messo nelle piastre chiamate fiasche di forma

rettangolare, incubate in orizzontale.

Un tessuto è trattato con enzimi per separare le

cellule che vengono messe in terreno che

aderiscono alla base delle fiasche formano il monostrato. Le cellule tumorali immortali si sviluppano

in modo continuo sviluppandosi nn sl in monostrato.

Affinche una linea cellulare sia utile per coltibare un virus le cellule delle linee devono essre

sensibili al virus ma anche permessive ossia permettere al virus di far effettuare al virus il suo

ciclo vitale. C sn cellule che sn sensibili (entra il virus) ma nn permissive (nn si moltiplica). Allora in

qst il virus diventa latente.

Se utolizziamo una coltura cellulare permissiva e la infettiamo cn virus animale vediamo sotto

microscopio gli effetti del virus sulla morfologia della cellula. Così vedo la differenza tra una coltura

nn infettata e una infettata. vediamo gli effetti citopatici del virus.

L'effetto della moltiplciazione del virus può essere di tipo citopatico e l'evidenza è diretta xk siamo

noi stesso col MO a evidenziare. Vediamo necrosi, apoptosi, citofagia, aggliutinazione cellulare,

formazione di sincizi. Possono essere evidenziate attraverso l'utilizzo di certi coloranti.

In alcuni casi nn si può avere qst evidenza diretta e si parla di evidenza indiretta ricorrendo a test

che dimostrano la presenza del virus o di anticorpi contro ql virus se parliamo di campioni biologici

di pazienzi infettati potenzialmente da un certo virus. Qnd si parla di agglutinazione

emoassorbimento si parla di test che utilizzano i globuli rossi quindi il virus può riconoscere

recettori anche sui globuli rossi e si attacca determinando l'agglutinazione di quel campione. Un

virus può essere osservato anche in ME ma comprota una certa procedura per preparare il

campione. Per effettuare un test di agglutinazione basta diluirlo e inserirlo in una macchina.

Il ME viene utilizzato qnd si identifica un nuovo virus e quindi voglio capire il tipo di capside,

pericapside, presenza di coda e spicole.

Il virus qnd assorbito, decapsidato ecc può arrivare a

provocare la lisi della cellula eucariote. Es. d qst virus

litici sn il virus del raffreddore e dell'influenza.

Un virus animale può infettare una cellula specifica

dando luogo a una infezione latente o provirale oppure

una cronica persistente. Es di infezione cronica

persistente è qll del virus dell'epatite B e infezione di

virus dell'epatite C (preferisce gli epatociti). E' cronica

xk il virus infetta gli epatociti ma nn da origine a

nessuan manifestazione fino a un certo punto. Quindi ha

un periodo di latenza lungo e addirittuta qnd si riattiva può nn dare manifestazioni.

Il virus dell'epatite B può portare all'epatocarcinoma e quindi è considerato oncogeno nel senso che

contribuiscono a sviluppare il tumore.

L'altro effetto può essere una infezione latente provirale (Herpes simplex) avente celliule bersaglio

preferite le cellule labiali. Qnd penetra l'epidermide, causa l'infezione, si replica e forma la febbre.

Può spostarsi al trigemino e l'acido nucleico del virus si integra con l'acido nucleico delle cellule ma

nn si ha nessuna manifestazione xk resta latente. Dopo una serie di fenomeni possono riattivare il

virus allora il virus viene exciso e ritorna a quelle cellule permissive labiali. C sn herpes zoster e

altri virus che provocano herpes genitali oppure altri che provocano virus della mononucleosi.

La cellula va incontro al processo di trasformazione (nn qll batterica) qnd il virus entra ossia nn

controlla più la duplicazione cellulare. Alla fine danno origine al tumore del collo dell'utero provocato

dall'infezione del papilloma virus oppure il virus a RNA che provoca il sarcoma. Alcune proteine dei

virus inibiscono proteine coinvolte nel controllo di duplicazione cellulare.

Un altra via sn gli effetti citopatici (manca nell'immagine).

Colture cellulari primarie

Il terreno di coltura nel quale coltivare linee cellulari in genere sn ricchi contenetni a.a, vitamine ma

anche siero di sangue e antibiotici. Il siero xk è una fonte di nutrienti. Si usa siero fetale o bovino

ma costa un botto quindi la produzione di un vaccino ha un costo. Antibiotici xk la lavorazione cn

linee clelulari animali è delicata xk sn facilissimi da contaminare da batteri xk il terreno dove sn

fatti crescere i batteri ce ne sono. La contaminazione più diffusa nelle linee cellulari animali sn

micoplasmi (senza parete cellulare). Eliminare micoplasmi nn è semplice.

Le colture primarie: si parte da tessuti trattati cn enzimi per separare le singole cellule ed esse

inoculate nel terreno di coltura hanno le stesse caratteristiche aventi nell'organi da cui derivano. Sn

cellule diploidi!!! Possono essere mantenute in vitro al massimo x una decina di generazioni.

Linee continue o trasformate

In genere sono di origine tumorale oppure prodotte da mutazioni insorte nelle linee cellulari

primarie. Sn capaci di moltiplicarsi per sempre in vitro: immortalizzazione di una linea cellulare.

hanno corredo aneuploide (nn sn uguali a quelle dalle quali sn partito dal tessuto di origine). I tipi di

cellule possono essere conservate tramite congelamento cercando di preservare la MC delle cellule

aggiungendo il dimetilsulfossido che cerca di mantenere la integrità delle MC.

Diagnosi eziologica delle malattie infettive (approcci)

Si può fare una diagnosi diretta dimostrando la

presenza del virus nel campione oppure indiretta xk

cerco gli eventuali anticorpi e nn il virus in se. Se nn c

sn anticorpi nn c'è virus.

Cm metodi convenzionali intendiamo la coltivazione in

linee cellulari.

C sn metodiche molecolari che evidenziano l'acido

nucleico di un certo virus attraverso PCR.

Alcuni virus possono riconoscere recettori presenti sui globuli rossi dei mammiferi e se sn presenti

ci si legano. Qst caratteristica è sfruttata nelle reazioni sierologiche. Sn reazioni che mettendo a

contatto il siero di un pazienze con un certo antigene (sostanza riconosciuta dal SI) dimostrano

direttamente o indirettamente la presenza del virus nel siero del paziente.

Le reazioni sierologiche sn duplici xk contentono di evidenziare il virus oppure l'anticorpo specifico

contro quell'antigene.

C sn altri test immunologici che possono essere usati pe dimostrare la presenza di un certo

antigene. Il test di agglutinazione al lattice è anche usato per dimostrare se una donna è intortata

oppure se un individuo ha assunto droghe.

Emoagglutinazione

Usiamo un siero di un paziente che ha avuto sintomi

derivati da infezione virale. Alcuni virus riconoscono

recettori sui globuli rossi. Qnd la sitazione è questa, si

ha l'emoagglutinazione ossia globuli rossi e virus

agglutinano formando una agglutinazione visibile a

occhio nudo xk la reazione la posso fare anche in

provetta cn antigene e miscela di globuli rossi e se

agglutina vedo la formazione di un fondo del pozzetto

completamente ricoperto di una patina rossa. Se nn

agglutinano nel pozzetto osserviamo una macchietta.

Per capire se c sn anticorpi contro quel virus o meno, nella provetta abbiamo una soluzione di ceppo

e virus specifico e globuli rossi. Aggiungiamo una aliquota del siero del paziente e vediamo se c'è

agglutinazione. Se c'è il virus hanno potuto interagire coi globuli rossi. Se nn c'è nel siero del

paziente sn presenti anticorpi contro ql virus che si legano al virus che nn potranno più legarsi ai

globuli rossi (complesso antigene-anticorpo). Questo è il TEST DELL'INIBIZIONE

DELL'EMOAGGLUTINAZIONE. Un test del genere è usato per determinare il titolo anticorpale ossia

qnt anticorpi sn presenti in circolo nel paziente.

Si fanno diluizioni seriali del siero. Alle diluizoni si aggiungo l'antigene del virus e i globuli rossi. Il

principio è sempre sull'emoagglutinazione. Ma x sapere qnt anticorpi sn presenti man mano che

diluisco il campione di siero diminuisco la conc. di anticorpi ma affinche avvenga la fomraizone del

complesso antigene-anticorpo, i due devono essere presenti in certi rapporti. Se gli anticorpi sn trp

diluiti nn c sarà più inibzione della agglutinazione e quindi la agglutinazione aumenta man mano che

diluisco il siero.

Per determinare il titolo anticorpale faccio diluizioni seriali 1:2. Per ognuni dei pozzetti vedo se c'è

agglutinazione o meno. Se c'è agglutinazione in alcuni e in altri no (immagine titolo anticorpale). Il

reciproco della maggore diluizone di siero in cui si evidenzia la agglutinazione qui è 160 xk la

diluizne più alta alla quale osservo ancora agglutinaione è 1:160. Può essere alto o basso in

funzione dekla fase della malattina. Nelle prime settimane la viremia è elevata, poi scende per poi

risalire nella fase tardiva della patologia.

Si possono usare tecniche più sensibili all'emoagglutinazione usando sistemi come l'ELISA più

sensibile dell'emo. Qst test dato che devono evidenziare la formazione del complesso antigene-

anticorpo, in ELISA nn lo vedo con l'occhio quindi devo avere un sistema di rilevazione del complesso.

C sn 2 modi per evidenziare che si è formato che fanno si che andando ad analizzare lo sviluppo di

colore io posso sapere se si è formato o no il complesso. Devo coniugare all'anticorpo un'ezima come

la beta-galattosidasi e tt qst si lega all'anticorpo, il substrato della beta è il gal e qnd viene

idrolizzato si sviluppa colore blu. Se sviluppa il blu allora il complesso si è formato.

Chiedere

I test che abbiamo visto sn usati prevalentemente in clinica. Ma un

virus può essere studiato in ricerca. Quindi da una linea infettata

devo isolarlo attraverso centrifugazione differenziata ossia

sottopongo la provetta contente l'ipotetico virus da isolare a

centrifugazioni a vleocità e periodi di tempo diversi. Man mano quindi

ci liberiamo dei ribosomi ecc ottenendo la sospensione di cellule virali.

Oppure possono usare centrifugazione in gradienti di densità e quindi

i componenti della sospesnio si distribuiscono nel gradiente in

funzione della densità.

TERAPIA FAGICA

IN OCCIDente sn sempre stati scettici xk ogni volta che studio una patologia devo eseguire una

serie di esperimenti e test su umani che devono seguire il protocollo della FDA. In Polonia invece

pubblicavano su riviste scentifiche polacche e quindi nn utilizzabili dalla comunità scientifica.

Su Nature fu pubblicato un articolo contente: " un agente batteriolitico che riconosce e uccide

Bacillus anthracis".

I batteriofagi possono essere usati a un processo che permette di arrivare a isolare molecole ad

attività antibiotica e quindi inibire i batteri.

Ad oggi la FDA ha approvato l'utilizzo d un pattern di antibiotici da inserire in alimenti per

prevenire l'Hysteria monocitogenes.

Nel 2004 su Nat. biotechnology fu pubblicato un esperimento: prelevando batterifoagi dalle acque

reflue, ognuno deve essere caratterizzato isolandone l'acido nucleico e sequenziandolo di almeno

200-300 fagi diversi specifici per S. aureus. Attraverso prorgammi informatici sequenzo tt le

regioni codificanti del virus. Ogni gene lo inserisco in un plasmide facendo in modo che l'espressione

genica sia inducibile. Quindi ogni plasmide viene inserito in coltura di aureus. Ogni colonia contenete

un plasmide diverso viene trasferito su terreno senza induttore e parallelamente su terreno che

contiene induttore. Se il gene del plasmide nn viene trascritto il batterio cresce. Se il gene viene

trascritto e tradotto produce qualcosa che può nn dare ripercussioni sulla crescita del battere e

quindi cresce. Se blocca qualcosa quwsto prodotto allora blocco la crescita del batterio.

Facendo un estratto cellulare e caricandolo su una colonna caricata cromatografica con una resina...

guardare sul libro. Facendo una colonna cromatograficoa cn una resina a cui è legata la proteina che

viene espressa e che uccide il battere, prendo la coltura batterica, la liso e faccio l'estratto

cellulare e la carico in alto sulla colonna. Le varie componenti passano nella colonna e vanno verso il

fondo dove rimane nella colonna con quella componente che interagisce con le proteine del

batteriofago. Vengono elencati una serie di vantaggi che

l'utilizzo dei batteriofagi in campo

terapuetioco avrbbero confrontanti con i

svantaggi che potrebbero avere l'utilizzo degli

antibiotici.

Ovviamente c sn svantaggi anche nel caso

utilizzassimo i batteriofagi

• Attività battericida anche contro persisters. Nei virus aventi latenza, esiste anche x batteri

patogeni. Il M. tubercolosis si trasmette attraverso aerosol e quindi se tossisce espelle bioaerosol

le inalo e contraggo. Il 5% di individui a contatto di bioaerosol sviluppa la patologia. Il resto nn la

sviluppa ma il batterio si rifugia in certe cellule del polmone per cui rimangono in uno stato di

latenza. Entrano nei macrofagi e si dice che il batterio è murato vivo dentro al macrofago. E' vitale

cmq! Quando il SI abbassa la guardia, il M. si riprende a moltiplicare e causare la tubercolosi.

Alcuni sono positivi alla tubercolina test che prevede l'iniezione sotto braccio di un estratto di M.

tubercolosis. Se dopo 2 giorni si è sviluppato un ponfo, allora sono positivo. Se è positivo allora

meglio fare la radiografia polmonare x vedere se è in corso la patologia. Ecco xk si dice persisters

xk il M. persiste cm latente nel macrofogo polmonare. Gli antibiotici sn attivi quando il batterio è

in fase esponenziale. Quindi se l'antibiotico passa la MC del macrofago nn elimina il batterio xk è

latente. Il batteriofago invece uccide anche batteri latenti xk lisano i macrofagi.

• La terapia fagica è una pèossibile diffusione di ceppi patogeni batterici resistenti agli antibiotici.

Nei batteriofagi invece può sempre insorgere resistenza ma dato che hanno bisogno di una cellula

ospite essi co-evolvono insieme ai batteri. Così essi si adattano all'evoluzione della cellula

batterica bypassando meccanismi di resistenza al batteriofago stesso.

• I batteriofagi penetrano il biofilm i quali possono stare sui cateteri vescicali, protesi, valvole

cardiache. Grazie alla loro formazione, sn cellule batteriche cementate negli esopolisaccaridi.

Alcuni sn in fase di crescia altre no, la formazione rende più difficile l'uso degli antibiotici anche

xk i batteri come pseudomonas, stafiloccocus resistono di per se agli antibiotici. Nei biofilm peggio.

Alcuni batteriofagi producono enzimi che degradano esopolisaccaridi che cementano le cellule

batteriche nel biofilm. Si può trattare a priori il catetere ecc con una sospensione di fagi così che

se un batterio tenta di colonizare quella superficie il fago lo attacca subito e lo lisa. Ma siamo

ancora nel campo della ricerca.

• Sono presenti in natura fino a 10^31, 32 diversi fagi e questo vuol dire che con molta probabilità

possiamo avere un fago specifico per ogni patogeno. Mediamente da quando isolo un batterio ad

avere una molecola antibiotica usandola in clinica passano 10 anni. Ma da qui quanti anni passano

per isolare un batterio resistente a certi antibiotici passano 2 anni. Un fago capace di lisare un

batterio resistente a un fago precedente passano 2 anni.

• I fagi sono sicuri dalla FDA e quindi hanno vantaggi in più rispetto ad altre molecole xk infettano

solo cellule batteriche. C'è uno svantaggio però xk a priori nn possono sapere se un ceppo è

sensibile a un ceppo di antibiotici ecc a meno di fare un antibiogramma. Allora prendo un

antibiotico ad ampio spettro x tenere la situazione sotto controllo. Nei fagi invece nn è così ad

ampio spettro allora devo isolare dal campione biologico il ceppo batterico preciso e poi capire il

fago specifico da usare. Quindi per i fagi c'è un intervallo maggiore di tempo in cui il paziente nn

è trattato.

• L'uso di fagi privati da endotossine nn inducono una stimolazione del SI. Il fago di solito nn è self

e quindi stimola la produzione di anticorpi specifici contro il fago. Questo accade anche per

l'antibiotico ma è troppo piccola per comportarsi da antigene. Sembrerebbe però che anche

quando il SI riesca a produrre anticoproi, essi nn neutralizzano il fago.

• Il fago agisce colpendo un bersaglio della cellula batterica ma senza inibire altri batteri presenti

nel corpo. L'antibiotico no.

• Nessuna terapia antibiotica prevede 1 sola dose. Nei fagi invece basta solo 1 dose xk il fago

raggiunge il sito d'infezione come l'antibiotico ma quando ha infettato le cellile batteriche

patogene esso si moltiplica da solo.

• I fagi sono attivi contro ceppi multi-resistenti agli antibiotici. Gli antibiotici invece sono sensibili.

A volte si usano antibiotici efficaci su certi ceppi ma con molti effetti collaterali.

• I fagi sn poco costosi nella produzione industriale xk devo mettere a contatto la cellula ospite con

la sospensione di fagi e in una notte ottengo un lisato fagico elevatissimo. Inoltre raccolgo il lisato

contenente sia nuovi virioni ma anche l'esito della lisa della cellula batterica e se fosse gram-

libero il LPS che è una endotossina. Quindi devo togliere queste cose e purificare le particelle

virali per eliminare tt qll che nn c'entra. Per un antibiotico devo isolare il ceppo produttore che

ne fa una quantità minima. Devo però ottenerne grammi/l. Es. nella penicillina inizialmente

produceva 10 µg/l ma oggi siamo ai g/l ma questo aumento è stato conseguenza di una serie di

passaggi di mutazione e selezione. Muto il wt, prendo la colonia che ne produce di più e quindi

seleziono. Poi di nuovo muto e così via. Oggi posso modificare il genoma del batterio

iperproduttore ma i costi sn enormi. Se insorge un ceppo resistente al fago posso somministare un

cocktail di fagi oppure trovo un altro fago. Si può usare una famiglia di enzimi chiamate

endolisine che sono quelli che i fagi producono per passare la MC dei batteri e rompere la parete

cellulare del battere. Alla fine del ciclo litico enzimi del fago producono enzimi che lisano la

cellula. Per ora si usano solo gram+ xk i gram- hanno anche la ME.

Fagi usati in campo diagnostico

Se vogliamo dimostrare la presenza di un battere patogeno in un campione di un paziente devo

isolare il batterio patogeno su terreni selettivo-differenziali (McConkey agar) e vedere se sviluppa

colonie tipiche del batterio che stavo cercando. Se l'infezione è provocata da E. coli, in 24h possiamo

vedere le colone ma nel M. tubercolosis invece arriva ad alcune settimane. Allora i kit diagnositici

accorciano i tempi.

Inoltre un altra ragione di uso di un kit è la sua sensibilità. Utilizzare i fagi aumenta la sensibilità di

identificazione di M. tubercolosis.

Alcuni fagi possono aiutare se un ceppo è sensibile a antibiotici sostituendo l'antibiogramma. Ecco

che il ciclo litico è utile per accorciare i tempi.

Anche nei fagi ci serve il ceppo batterico indicatore. Cm ceppo indicatore (cellula specifica) nn uso

lo stesso battere per evidenziarlo ma uso un altro ceppo nn patogeno che si duplica velocemente in

poche ore.

La procedura è:

1. Lo sputo è un campione biologico ma prima deve essere sottoposto a certi trattamenti.

2. Da qst campione si deve estrarre e isolare eventuali cellule di M. tubercolosis presenti. Poi le

mettiamo a crescere per 24h in terreno per rivitalizzarli e poi la mettiamo a contatto col fago

specifico (Actiphage, D29).

3. Lasciandolo a contatto per un certo tempo e 37C°, i fagi andranno ad aderire e infettare

ecentuali cellula di tubercolosis presenti. Dopo 1h di questa procedura, devo eliminare tt i fagi

che nn hanno infettato cellule trattandole con una sostanza che li denatura. Per evidenziare che

ho un aumento di fagi rispetto a qll usate all'inizio si usa il ceppo indicatore. Quindi i fagi

entrati si moltiplicano lisando la cellule e vengono liberati. Metto a contatto questa spensione cn

altro batterio in cui i fagi entrano in queste formando le placche. Se manco di placche allora nn

c'era la tubercolosi.

4. Un altro test evidenza la preseza di bacilli attraverso terreno di coltura in cui ci dovrebbero

essere almeno 10^4 cellule per ml.

Oppure la conoscenza del vibrio fisceri è utile. In pratica se utilizzassimo un fago mutato in modo

tale che contenga il famoso operone LuxA ossia quello che codifica per la luciferasi. Se c'è l'ospite

specifico, il fago segue il normale ciclo litico. Ma se la infetta allora aumenta il n° di particelle

presenti e quindi anche l'intensità della luce emessa.

BATTERIFOFAGI

• L'adesione avviene attraverso le fibre della coda di un fago o proteine del capside o pericapside

per quanto riguarda il fago. La controparte del battere può essere lipidi, LPS, fimbrie, pili.

• Penetrazione nei fagi il capside e pericapside rimangono all'esterno. Nella cellula batterica si

inserisce l'acudo nucelico ma nei virus animali entra tt il virione.

• Decapsidazione solo nei fagi-

• Biosintesi delle proteine e acido nucleico virale per formare nuove particelle fagiche. Nei batteri

avviene nel citoplasma mentre in quelle eucariote sia nel nucleo sia nel citoplasma

• Infezione cronica come la Lisogenia nei batteriofagi. Xk l'acido nucleico del fago si inserisce nel

genoma batterico. E' in fase latente.

• Rilascio che può avvenire per gemmazione o secrezione negli eucarioti, nei fagi il processo è solo

la lisi rompendo la parete cellulare. Alcuni fagi utilizzano sistemi di secrezione veri e propri che

ricordano un tipo di secrezione particolare.

C sn capsidi icosaedrici, tubulari, oppure i fagi della

serie D xk c'è un capside ma poi una serie di strutture

come una struttura tubuliforme collegata alla testa

tramite il collare che può essere ancora più complesso

attraverso strutture filamentose chiamate setole.

Nella struttura tubulare abbiamo in realtà due tubuli,

una più interna e una esterna chiamata guaina. Essa è

contrattile, qll dentro è rigido. LA guaina è collegata

alla pastra basale alla quale sono collegate fimbire e

spine. Tt questo è la coda dei fagi della serie D. La

guaina contrattile si conrae quando il fago si lega al battero facendo in modo che il tubulo intenro

penetri nel citoplasma della cellula batterica così che dal capside l'acido nucleico passa nel

citoplasma iniziando tt il ciclo litico.

La tiplogia e le dimensioni dell'acido nucleico dei fagi sn molto variabili nel caso di diversi virus

animali.

Oppure possiamo avere anche il batteriofago lambda in cui l'acido nucleico è doppia elica di DNA

lineare. Di solito è di 50 kb. Anche nella struttura di lambda c'è una testa icosaedrico con una coda

nn contrattile che termina cn una regione conica che è chiamata fibra della coda. Il recettore è una

proeine che viene trascritta e tradotta dall'operone mal che è inducibile. Percò devo aggiungere

maltosio alla coltura per indurre l'operone a produrre un recettore. Altri casi può essre Mg. Questi

sn temperati.

Oppure in un batteriofago filamentoso, aventi DNA a singola elica circolare. C sn alcune proteine

localizzate alle estremità e quella p3 interagisce col recettore del fago che sn i pili.

Il DNA è raccolto in un capside filamentoso proteico ma formato da una sola tipologia di proteine.

Nel genoma dei fagi le regioni codificanti possono essrre o parzialemnte sovrapposti uno all'altro e

qst permette al fago pur avendo una dimensione limitata di acudo ncuelcio di codificare più geni.

Simile a qst c'è nei batteri per rsempio in qll che codifica un enzima della biosintesi della lisina

(aspartico chinasi, due subinità) in cui il primo gene è dentro al secondo. Hanno anche basi insolite

(idrossi metil citosina).

Saggio di placca

C deve essere la sospensione di fagi e la coltura

del micro indicatore. Li misceliamo e la

aggiungiamo all'agar soffice fuso (agar molle).

Soffice xk nn è così consustente come l'aagr

normale e fuso xk se nn lo manteniamo a 50°C

solidifca. Uniamo fagi, batteri e agar fuso,

mescoliamo e rovesciamo tt sulla iastra avente

terreno idoneo x crescere il batterio indicatore.

Il giorno dopo se osservo placche di lisi ossia in

ql punto tt i batteri presenti sn infettate e

lisate. Dove nn c sn vediamo crescita a patina.

Stabilire titolo fagi

Crescere batteri e mette e aonctatto con la

sospensione virale ma nn saendo il titolo

devo fare una serie di diluizioni che viene a

messa contatto col ceppo indicatore e

seminata su opportuni terreni. Man mano

che diuuisconi i fagi, vedo placche di lisi.

Conto le placche dove sn l'una separata

dall'altra.

Come cambia nel tempo il n° di particelle fagiche?

Tramite l'esperiemnto One step grow?? Se mettiamo a contatto 10^5 fagi con 10?5 cellule la

molteplicizita di infezione è il loro rapporto (MOI).

Prima fase è la fase di latenza seguita dalla fase di

scoppio e per finire una fase stazionaria.

Nella latenza si distibgue un periodo di eclissi. La blu

trattegguata indica come auemnta nelt empo il n° di unita

formanti palcche (ufp). Osserviamo che quando mettiamo

a contatto i batteri col fago c'è le'cilisse ossia nn si può

dimostrare la presenza di fagi in qst fase xk i fagi hanno

infettato le cellule o almeno sn aderiti e quindi nn li vedo.

Ma dopo qst periodo di eclisse, il n° di fagi aumenta.

La fase di scoppio è la lisi batterica e quindi assistiamo a

un aumento evidente del n° di ufp. Questo è detto numero di scoppio xk ogni cellula infettata ha

liberato un n° di particelle ottenute favendo un rapporto tra 10^9 e 10^7 cellule nuove per ogni

cellula infettata.

Possiamo anche ottenere la densità ottica batterica che misura la massa cellula batterica x capire la

loro crescita. Associando la fase di latenza con la DO, in questa fase la DO è cosyante xk nessun

battere è lisato. Ma qnd le particelle fagiche vengono liberate lisando i batteri la DO diminuisce.

Una volta che si inizia la trascrizione dell'acido nucleico

virale inizia anche la duplicazione del DNA virale che

variano a seconda del virus.

Nell'immagine è indicata la replicazione del DNA del

virus lambda (DNA a doppia elica). Alle estremità

abbiamo una corta sequenza di 12 nculeotidi a singola

elica chiamata regione COS (Coesiva) ossia questi due

frammenti sn tra di loro complementari. Una volta che

lambda ha riconosciuto il suo recettore e ci si è legato,

inietta nel citoplasma del battere la molecola di DNA.

Una volta dentro la molecola circolarizza legando qst due frammenti grazie alla ligasi. La

replicazione di essa prevede una prima fase secondo un meccanismo teta e dopo un certo n° di

replicazione secondo qst modello la replicazione prosegue secondo il modello a cerchio rotante

introducendo un taglio di una delle 2 eliche. C'è qst secondo modello di replicazione xk permette di

ottenere i concatenameri ossia lunghe molecole di DNA formate dal legame di più molecole di DNA a

doppia elica. La formazione è necessaria x l'impaccamento del DNA nelle teste del fago lambda. In

qst fase di impacchetamento entrano in gioco le sequenze COS. A livello delel COS avviene un taglio

che permette di inserire nelle teste del fago la giusta quantità di DNA lineare ridondante con qll

due COS.

Non tt gli acidi nucleici formati da DNA si replicano così. C sn altri acidi nucleidi dei fagi della serie

T. Nel T4 abbiamo acido nucleico a DNA a doppia elica

aventi regioni ridondanti ossia le estremità d qst

molecole hanno regioni ridondanti dove sia da una parte

sia dall'altra troviamo ABC. Partendo dalla prima riga

vediamo le due estremità ridondanti. Qui c'è un

problema nella duplicazione xk nn è circolare allora la

molecola iniziale viene replicata formando 3 nuove

doppie elica lineari di DNA ma può avvenire anche

ricombinazione xk ogni molecola ha la presenza di

regioni che sono uguali e quindi può avvenire

ricombinazione. Qst processo permette di ottenre quella

struttura chiamata concatenamero formato da più molecole di quell'acido nucleico cje si ripetono

costantemente. La formazione del concatenamero è essenziale x l'impaccamento dell'acido nucleico

nella testa dei fagi. Nel lambda nn esistono sequenze COS ma cmq nella fase di impacchetamento nn

può entrare tt il concatenamero xk più lungo rispetto alla capacità della testa del fago ma andrà

incontro a una suddivisione del concatenamero con sequenze avente dimensione opportuna. Quindi

intervengono enzimi che tagliano il concatenamero in certe precise posizioni. L'impacchetamento

richiede energia ottenuta dall'idrolisi dell'ATP. Nella testa del T4 entrano sequenze ridondanti.

Una votla che l'acido nucleico si è duplicato e sn state

sintetizzate le proteine coinvolte nella formazione del

capside ma anche del collare, coda e fimbrie, sn scritte

nella immagine.

Prima della prima figura abbiamo avuto la duplicazione

del DNA virale e formazione delle proteine che hanno

formato il collare e il capside. Ora il concatenamero

subisce il taglio in certe posizione e la molecola di DNA

tagliata entra nel capside e in funzione dell'energia

disponibile riempie la testa fino a compattarsi. Quando

abbiamo finito si lega la coda, piastra basale, fimbire,

spine caudali ecc formano il fago nella struttura finale. Cio che varia nell'impacchetamento è la

modalità cn la quale avviene xk sn note 2 modalità.

La 1° viene chiamata modalità a estremità fisse, la 2 a

quantit' fissa o a teste piene. Lamnda segue la prima, T4

segue la seconda. Vederle sul libro!!!!!

• estremità fisse indica che il primo taglio viene

ffettutato delle sequenze COS. Il secondo taglio e

determinato da una sequenza COS ma e sfasato xk

presente le due estremita coesive.

• a quantità fissa nel senso che i tagli avvengono in

posizioni diverse tra loro. Quindi all'ointerno della

testa del fago entrano molecole avente estremità

ridondanti di lunghezza diverse.

• Attraverso un pilo sul battere alcuni batteriofagi filamentosi iniettano il loro DNA. Quando è

iniettato ecc vediamo che è il capside che si costruisce si autoassembla attorno alla molecola di

acido nucleico.

Anche coi fagi così cm i batteri, si possono fare incroci

che selezionano ricombinanti specifici. Questo è

possibile solo quando si possono ottenre mutanti

batteriche ma anche dei fagi. Vengono usate qll definite

mutanti condizionali letali che possono essere 2: (in una

certa condizione nn permette la moltiplciazione del

virus che èuò avvenire in altre condizioni):

• termosensibilità ossia il fago si moltiplica solo a 30°C

ma non a 37°C per esempio

• mutanti di ospite ossia un fago con una mutazione che

gli permette di moltiplicarsi in un certo ceppo ma nn in un altro.

Incrociando possiamo selezionare i ricombinanti.

Nella immagine vediamo ce dua fagi infettano lo stesso battere e i loro DNA vanno incontro a

ricombinazione ottenendo ricombinanti e parentali. Per verificare l'avvenuta ricombinazione semino

su terreno a 30°C e a 42°C. A 30 tt crescono ma a 42 crescono solo quelli che hanno entrambi geni

wt ossia resistenti alla temperatura.

Se paetiamo dal fago della serie T sn fagi contenenti

acido nucleico DNA a doppia elica lineare di dimensione

elevata (160-180 Kb).

Il fago T hanno la guaina che è contrattile in cui

all'interno abbiamo un tubo più sottile che passa

attraverso la ME, parete e MI del battere Gram-

quando la guaina si contrae, rilasciando nel citoplasma

l'acido nucleico del fago. Esso poi va incontro alle varie

fasi del ciclo vitale di T4 (trascrizione e traduzione e

replicazione). Tt il sistema enzimatico coinvolto nella replicazione del suo DNA è analogo a qll che

replica il genoma di E. coli. Alla fine abbiamo l'autoassemblaggio.

Altro esempio sn i fagi filamentosi avente la proteina p3 che riconosce i recettori specifici ossia i

pili. Un esempio è il fago N13 (genioma di 6.5 Kb) avente proteine coinvolte nell'assemblaggio,

struttura del capside e proteine che permettono la replicazione del DNA. Il genoma è a singola

elica di DNA circolare superavvolto. Esso infatti qnd è entrato nn può fare nulla e allora va incontro

a duplicazione originando la forma replicativa a doppia elica (RF). Essa serve per la sintesi di

proteine ma anche cm molcola di partenza x formare l'acudo nucleico tipico del virus. Avviene la

forma rotante per duplicare il DNA. Il filamento positivo circolare della progenie poi servirà per

entrare nel capside formando il nucleocapside.

Un altro è il phiX174.

Per ogni ciclo di replicazione a crechio rotnate si genera una molecola a singola elica circolare che

viene avvolta per ormare il nucleocapside.

Ora vediamo fagi a RNA a singola e a doppia elica.

Nel fago MS2 avente un ssRNA (+), il fago riconosce il

pilus sessuale dei batteri. Il capside rimane fuori

mentre nel citplasma c troviamo la ssRNA che può

essere tradotto subito dal sistema batterico. La proteina

A è secreta dal virus stesso che fa entrare l'RNA.

Una volta dentro viene tradotto l'RNA + in proteine

coinvolte nella sintesi del filamento -. La proteina P

permette utilizzando come stamp il gilamento - di

sintetizzare il filamento +. La proteina C forma il

capside e la L permette la lisi cellulare.

Ora vediamo un fago phi6 che contiene dsRNA. E' un

fago avente una serie di eccezioni del ciclo vitale

rispetto agli altri. Nella struttura ha il pericapside

intanto sul quale abbiamo la p3 che riconosc eil

recettore batterico. Sotto l'envelope abbiamo una serie

di proteine (verdi) e altre proteine diverse rispetto alle

verdi. Insomma ha un capside interno e esterno e

esternamente il pericapside. All'interno d tt abbiamo

l'acido nucleico il quale è segmentato ossia abbiamo più

molecole di DNA. Il n° varia da 2 a 12. Le modalità di replicazione sn più complesse. La proteina p5

è coinvolta nella fase di entrata del fago nella cellula idrolizzando la parete cellulare batterica con

fusione della MC batterica col pericapside fagico e RdRP o p2 che serve per replicare il DNA virale.

Un fago di E. coli avente DNA doppia elica lineare con estremità COS. Ha un genoma di circa 50

KDa. Circolarizza appena entra nella cellula batterica. Il Lambda è temperato e la scelta dipende

dalla presenza di nutrienti. Durante la replicazione del DNA intervengono proteine fagiche sia

proteine batteriche. Una volta circolarizzato il DNA segue con teta.

In genrale il ciclo termina del taglio del concatenamero a livello delle COS, l'entraa del DNA nel

capsie e impacchetamento e infine la lisi.

Le regioni ossia l'insieme dei geni espressi

durante i due cicli sn peculiari in qst. Alcuni geni

sn espressi dopo che il DNA entra nella cellula

batterica prima della scelta del ciclo.

La regione compresa nella parte alta della

immagine è chiamata regolatrice che regola la

scelta del ciclo. Inoltre sn presenti diversi geni

coinvolti nel ciclo litico del fago che formano

quindi il capside e coda di lambda non

contrattile. Sn prodotte proteine coinvolte nella

lisi del batterio.

A sx abbiamo i geni del ciclo lisogeno cn 2 proteine cm l'integrasi che permette l'integrazione di

lambda nella cellula ospite. Esiste una regione nn essenziale per il ciclo vitale del virus che pemrette

di usare lambda cm vettore di trasporto di geni in ospiti che può infettare (come nella trasduzione).

Essa può essere sostituita da DNA esogeno.

Esiste un sistema che permette di trascievre e tradutte geni litici e lisogeni.

Le proteine regolarie sn localizzate nella regione in alto e la principale è la CI chiamata anche

repressore di lambda. Qnd la proteina è presente viene favorito il ciclo lisogeno.

Tt la parte che regolano la scelta del ciclo è nella regione in alto e abbamo anche il gene CII e

anche il CRO mentre a sx abbiamo il gene N e CIII. Sn le 5 proteine regolatrici.

Nel caso di lambda la successione di eventi del controllo sequenziale della trascrizione nn è dovuta a

fattori sigma diversi ma dipende da un fenomeno di anti-terminazione. L'RNA polimerasi riconosce il

promtire di un gene, lo trascrive e qnd raggiung eil sito di STOP si stacca. Una proteina interagisce

con la polimerasi permettendole di saltare questo sito di terminazione e di continare a trascrivere.

La possibilità di andare oltre qst sito è soggetta alla sintesi di questa proteina però che viene

chiamata proteina ANTI-TERMINATORE. In lambda esse sn: proteina N che sta a sx del CI

repressore e qnd permette di andare oltre la trascrizione di se stessa permette di fare CIII e le

proteine del lisogeno. Un'altra cn la stessa attività è la proteina Q che sta a dx di CI e se viene

sintetizzata permette all'RNA polimerasi di andare oltre al trascrizione di Q attivando i geni litici.

Essendoci 5 proteine, saranno presenti anche promotori diversi ricnosciuti e trascritti dall'RNA

polimerasi batterica.

L'RNA poli trscrive il genoma di lambda in 5 promotori

principali. PL e PR trascrivono in direzione opposta

rispetto all'altro e sn i primi a essere trascritti e

tradotti xk i loro prodotti servono subito. PL trascrive

la proteina N mentre PR trascrive la CRO. Quindi

appena il DNa entra si circolarizza viene trascritto in

mRNA ma anche trascritti e tradotti PR e PL.

Un altro promotore è il PR' che permette la

trascrizione dei geni tardivi ossia qll che codificano

per le proteine della testa, coda e tt i prodotti

necessari x il ciclo litico. Esso è localizzato a dx del CI e codifica tt qll serie di geni rossi. Deve

essere sintetizzato Q che è l'anti-terminatore così da permettere alla polimerasi di trascrivere tt

quei geni.

Gli altri sn il PRE e PRM in cui PRE permettono la sintesi del repressore di lambda CI mentre PRM

mantiene il repressore CI e se è mantenuto allora il fago va incontro al ciclo lisogeno se no parte il

ciclo litico. Il PRM richiede lo stesso CI come regolatore positivo che è responsabile della condizione

di lisogenia. Il promotore Pr è sovrapposto al Prm. Qst regione

in omune è la regione Operatore suddivisa in R1,

R2 e R3. Il promotore che mantiene CI e qll che

trascrive a dx hanno in comune quella rgione.

Quindi l'RNA polimerasi può yrascrivere o in un

senso o nell'altro. Se CRO è sintetizzata allora

viene attivato il litico, se CRO è bassa

concentrazione si innesca il lisogeno. Il gioco è su

tutto il repressore CI. Quindi se la poli si attacca

alla regione 3 dell'O viene trascritto CI e appena

viene trascritto blocca la regione 1 e 2 dell'O e quindi la poli nn può trascrivere dalla parte opposta

dove c'è CRO. Se CRO viene prodotta xk la poli si attaca alla 1 dell'O allora viceversa accade.

CI è il repressore di lambda che installa il ciclo lisogeno. A dx c'è a proteina INT che integra.

Appena avviene infezione allora produco subito N che è un anti-terminatore. La poli va oltre la N

per sintetizzare sia CIII sia CII. La CIII protegge dall'attacco di proteasi batteriche CII ma se CII

nn è degradata dalle proteasi permette la sintesi di CI e quindi la lisogenità. La proteasi agisce a

seconda delle condizioni del battere. Se è in assenza di nutrienti nn può moltiplicarsi e quindi nn

può diffondere nuove particelle virali e quindi in quel contesto il fago intraprende il ciclo lisogeno.

Se sn in attiva fase di crescita si moltiplicano allora inizia il litico. Se CII e CIII sn a bassi livelli

prende la via il ciclo litico.

Illustra le condizione di crescita del battere ospite di

lambda. La scelta del ciclo litico del fago rispetto al

lisogenico è condizionato da condizioni fisiologiche e

nutrizionali ma anche dalla moltiplicità delle infezioni

(MOI=rapporto n° batteriofagi e n° di cellule coinvolte in

una infezione).

Se il battere si trova in condizioni di crescita ottimali il

fago inizia il ciclo litico xk se il battere si replica bene

allora lambda piuò infettare bene quelle cellule.

Se il battere si trova in condizioni nutrizionali e fisio nn

ottimali allora lambda inizia il lisogeno xk se il battere si replica poco è meglio che il fago si

nasconda nel genoma del battere aspettando condizioni migliori.

Se è intrapreso il ciclo lisogeno deve essere

prodotto il repressore CI. Se è eleavat la sua conc.

inizia il ciclo.

La proteina Cro impedisce che venga sintetizzato il

repressore CI consetendo l'attuazione del ciclo ma

senza escludere la possibilità di instaurare

lisogenia (fase iniziale trascrizione geni precoci

immediati). E' come se si fermasse e riflettesse su

cosa avere avendo a disposizione le 2 proteine.

Se CI è in quantità maggiore in fase successiva si instaura il lisogeno. Ma se prende il sopravvento

Cro inizia il ciclo litico. Quindi la stessa concentrazione di CI e Cro nn si ha mai nel fago.

Qst sn i geni che codificano il CI, Cro. Sn indicate le

5 proteine che interagiscono per permettere al fago

di decidere.

La Cro viene trascritto dal promotore R. Il

repressore ha 2 promotori: PR (espressore iniziale) e

PRM (permette di mantenere la trascrizione del

gene). Mantenerlo vuol dire che il fago inizia il

lisogenico. Il PR e PRN condividono lo stesso

operatore!! Questo O è formato da 3 regioni R1, R2

e R3 aventi sequenze nucleotidiche simili. Se due P

hanno lo stesso O vuol dire che nn possono essere

trascritti entrambi in contemporanea. La trascrizione di

CI da PRM richiede un regolatore positivo ossia proteine

che favorisca la trascrizione di quel P: la stessa CI. La

trascrizione a partire dal PRM è repressa da Cro. La

Cro è trascritta dal Pr ma nn richiede nessuna

attivazione ma se c'è CI nn viene fatta Cro. Se c'è Cro

nn viene fatto CI.

Se si ha la sintesi di CI, esso agisce come omodimero.

L'estremità N-Terminale interagisce con l'O, i C-terminali eprmettono la formazione dell'omodimero.

CI viene prodotto xk è attivo il promotore PRE. Qnd si forma si forma l'omodimero che si lega alla

regione R1 o R2. Se si lega a esse l'RNA poli nn può trascriver eil gene Cro xk c'è un impedimento

sterico. Quindi viene attivato il P che permette di mantenere attiva la trascrizione di CI. Se viene

sintetzzata Cro essa si lega alla R3 ma qst impedisce alla RNA poli di attacarsi alla R3 e quindi

trascrivere CI.

La proteina CII attiva il P che permette la trascrizione

di CI.

Ci manda le slide con tt la spiegazione!! BELLA FIGA!!

I P in giallo sono promotori attivi in qll fase 1. Qll in rosa sn inattivi nella 1.

Il DNA entra, circolarizza grazie alle COS e poi l'RNa poli batterica si lega al PL e PR. Trasceivere

il gene N e il gene Cro. Questo accade nella prima fase di entrata dell'acido nucleico virale nel

battere.

Nella seconda fase l'RNA poli inizia a trascrivere e alla fine incontra uno STOP staccandosi

liberando mRNA. La proteina N è l'anti-terminatore della trascrizione e quindi permette alla RNA

poli di andare oltre al sito di terminazione e quindi di trascrivere geni oltre a N sia a sx sia a dx

ma nn ha ancora deciso il fago su quale via prendere. N infatti permette anche la trascrizione di

CII che attiva CI. Qnd siamo in fase attivo di crescita una proteasi tradotta degrada CII e quindi CI

è a livello basso. Così è alto Cro e quindi ciclo litico. Se la cellula nn è in condizioni ottimali è il

contrario.

Nella fase 3 le due vie sn in competizione infatti.

Se c'è tanto cibo c'è allora le cellule producono una

specifica proteasi che attacca CII e la degrada. Quindi

CI nn c'è e quindi la lisogenia nn può aprtire e parte il

ciclo litico.

Se siamo in merda la quantità di proteasi è bassa e

quindi CI viene prodotto.

Se stiamo male produciamo int e CII che attiva il

promotore òer l'espressione di CI. CI si lega all'OR e

OL dei PR e PL bloccando la sintesi di mRNA. Quando

CI è legato a OR stimola la sintesi di ulteriore

repressore a partire da PRM. Se produco PRM la

quantità di CI è mantenuta alta e costante e quindi

viene stabilita la lisogenia attraverso la traduzione del gene Int che codifica l'integrasi.

Se predomina Cro xk ho proteasi dato che stiamo bene

CII viene degradata e quindi CI viene perso. Quindi nn

blocca OR che sarà riconiusciuta dalla poli per

continuare a produrre Cro. Cro permette una suff.

trascrizione verso dx così da avere un'accumulo della

proteina Q che ha una attività anti-terminatrice che

permette alla poli di andare oltre trascrivendo tt i geni

strutturali del fago finanziando il ciclo litico. Questa

proteina Q attiva PR' che regola la produzione di tt i

geni strutturali.

Nella prima c'è anche il gene Xis che produce l'excisione del genoma di lambda.

Se la cellula subisce un danno come irradiazione UV il profago può excidersi anche se il meccanismo

sta andando bene nel caso. Il CI è una sorta di LexA che avevamo visto ossia l'induzione di un

profago può essere provocata trattando una coltura di batteri con raggi UV che danneggiano DNA

producendo ssDNA che producono RecA che si mangia CI. Se CI nn blocca più la trascrizione a

partire dal PL e PR allora viene trascritto e tradotto l'enzima coinvolto nell'excisione del DNA virale

iniziando il ciclo litico. Il gene Xis sta sulla stessa parte di Int quindi la trascrizione è rilegata a uno

o l'altro. Se CI è attivo Xis è smerdato ma pompato Int.

Xis ha un P che rimane inattivo fintanto che rimane CI.

Ocio che sul libro PR' c'è scritto PR2

Per l'excisione vengono sfruttate le stesse regioni utilizzate per l'integrazione. Se è perfetta

l'excisione si ha la liberazione del DNA del fago completo, se è incompleta allora lambda si tira

dietro la regione gau o bio.

Sul libro è trp dettagliato fare quello che ho scritto che è qll che c manderà per mail.

CIII protegge CII dalla degradazione proteasica xk il livello basale di proteasi è sempre presente.

ANTIBIOTICI LISIOMIAZIDE inibisce la sintesi della

parete cellulare solo dei Micobatteri.

Altri come PENICILLINA sn attivi contro

gram+ e gram-.

Intrinsecamente resiste vuol dire che nn sn

avvenute mutazioni ma lo sono di per se come i

micoplasmai nei confronti della penicillina.

Se invece è avvenuta mutazione il batterio

acquisisce resistenza a un certo batterio e qst si

chiama resistenza acquisita.

Non ha aggiunto l'ultimo punto xk esistono

molecole che hanno attività antibatterica: gli

anitbiotici che sn molecole prodotte

naturalmente dai microrganismi come batteri, e

funghi. l'altra classe sn i chemioterapici ossia

molecola ad attività antibatterica ma

sintetizzate e nn prodotte naturalmente da

micro. Una classe di chemioterapici agiscono

bloccando l'attività di enzimi coinvolti in processi

metabolici (come la sintesi di acido folico che è

un precursore della sintesi di acidi nucleici

Anche la iperproduzione di enzimi la cui attività può essere

inibita da antibiotici. determinando la morte del batterio).

Un antibiotico deve entrare nella cellula batterica e interagire con una struttura, enzima ecc del

battere e l'interazione tra antibiotico e qst struttura deve essere in grado di bloccare la

replicazione batterica o addirittura ucciderla. Questi sn i requisiti minimi di un antibiotico.

Allora se deve entrare nella cellula attraverso diffusione semplice, oppure attraverso porine (Gram-)

oppure usano trasportatori specifici. Allora se l'antibiotico nn riesce oppure entra in quantità minima

nn riuscirà a interagire col suo bersaglio.

L'antibiotico se entra nella cellula può nn interagire col bersaglio specifico a causa di pompe di

efflusso nella MC del batterio. Le pompe buttano fuori le molecole di antibiotico. Qst pompe sn

normalmente presenti nella membrana del battere ma non si sa quale sia la funzione fisiologica di

esse. Inoltre le pompe sn aspecifiche quindi espellono molecole di antibiotici aventi caratteristiche,

chimiche e funzionali diverse tra di loro.

Se l'antibiotico entra nella cellula e nn viene espulso può cmq nn interagire col bersaglio specifico

rendendolo resistente. Questo vuol dire che il gene che codifica qst bersaglio cellulare ha subito

mutazione provocando il mancato riconoscimento del bersaglio.

Se l'antibiotico entra ma nn interagisce può essere causato invece dalla produzione di enzimi

batterici che inattivano o modificano chimicamente l'antibiotico provocando la sua inattiuvazione. Sn

enzimi inattivanti xk rompono legami della molecola dell'antibiotico essenziali per l'attività oppure sn

enzimi che aggiungono un gruppo chimico all'antibiotico rendendolo cmq inattivo. Alcuni dei geni che

codificano qst enzimi sn sui plasmidi e quindi possono essere trasmessi a ceppi sensibili attraverso

trasformazione e coniugazione diffondendo la resistenza a quell'antibiotico. Alcuni enzimi nei Gram-

sn inducibili ossia solo se la cellula ha quell'antibiotico, qst enzimi vengono prodotti.

La ragione x la quale nn portare a termine una terapia

antibiotica contribuisce alla diffusione di ceppi R agli

antibiotici è: quando un individuo viene infettato da un

certo ceppo batterico, la popolazione che si moltiplica

nell'individuo è eterogenea xk c sn cellule

estremamemnte sensibili all'antibiotico oppure meno

sensibili oppure ancora a seguito di mutazione casuali sn

R.

Nella imamgine vediamo come se la terapia viene

completata la popolazione batterica è sparita. Ma se


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Pavia - Unipv
A.A.: 2015-2016

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Biologo93 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Microbiologia generale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Pavia - Unipv o del prof De Rossi Edda.

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