Microbiologia Appunti Parte 2

Genetica batterica

Il cromosoma della cellula batterica è circolare e accanto a questo DNA sono presenti DNA accessori nel senso che la loro presenza non è necessaria per la duplicazione e crescita della cellula batterica. Se li possiede, la cellula può essere favorita nello sviluppo in un certo ambiente, ma se mancano, non muore. I DNA accessori sono per esempio il DNA plasmidico (DNA a doppia elica circolare) con alcune eccezioni in cui ci sono plasmidi a doppia elica lineari. Il plasmide si replica indipendentemente dalla replicazione del DNA cromosomale. Il cromosoma può essere circolare o lineare come anche il plasmide. Ci sono alcuni batteri che hanno i plasmidi, altri no.

Elementi trasponibili

All'interno del cromosoma batterico, sia nei plasmidi sono evidenziati piccoli frammenti di vari colori. Se associamo il colore alla definizione, in entrambe le tipologie di DNA sono presenti elementi virali, plasmidi e trasponibili. Nel corso dell'evoluzione, nel cromosoma e plasmide, sono andati a intrigarsi altri genomi di altri microrganismi o di virus.

Gli elementi trasponibili sono sequenze di DNA che hanno la capacità di saltare da una parte all'altra del cromosoma batterico. Sono sequenze che si inseriscono in un punto del cromosoma batterico ma con la capacità di spostarsi e inserirsi in altri punti del genoma batterico. L'inserzione di essi ha un certo effetto che dipende da dove si inserisce: se si inserisce in un gene che codifica un enzima utile per la biosintesi di un amminoacido, esso viene inattivato perché si perde il frame di lettura formando una proteina diversa dall'enzima originale. Quindi vengono usati per ottenere mutanti, provocando l'inattivazione di un gene.

Ci sono elementi trasponibili semplici e complessi, ma il core di informazione deve essere rappresentato da almeno un enzima capace di trasporre questo elemento: trasposasi. Al gene che codifica la trasposasi sono associati geni con altre funzioni, come geni che codificano la resistenza agli antibiotici. Se questo elemento trasponibile è responsabile della resistenza ad un antibiotico, il fatto che possa essere trasferito a qualche altro batterio è responsabile dell'acquisizione della resistenza a quell'antibiotico.

Se l'elemento trasponibile è sul plasmide, ci sono plasmidi che possono essere trasferiti da una cellula all'altra.

Elementi virali

Gli elementi virali sono parti o genomi interi del virus integrati nel genoma della cellula batterica o anche nei plasmidi. Possiamo distinguere un gruppo di geni che formano il nucleo genico. Sono tutti geni ritenuti essenziali per la vitalità della cellula stessa. Il nucleo genico cromosomale determina le funzioni in figura.

Sul cromosoma e plasmide sono presenti altri geni non essenziali per la sua vitalità ma se le possiede acquisisce qualche fenotipo. Se confrontassimo un genoma di un ceppo di E. coli non patogeno con uno patogeno, il secondo ha un insieme di geni che il primo non ha, che sono un insieme di prodotti genici che lo rendono patogeno. Questa è chiamata isola di patogenicità.

Il fatto di possedere geni che conferiscono resistenza agli antibiotici offre un vantaggio selettivo per il batterio che li possiede nel caso di un ambiente che contenga antibiotici. In condizioni normali però non gli conferisce un vantaggio particolare. I geni della resistenza sono sui plasmidi.

Molti prodotti genici coinvolti nella fissazione dell'azoto hanno geni corrispondenti localizzati sul plasmide. Se perdessero il plasmide, perdono la capacità di fissare l'azoto e quindi la simbiosi con la pianta, ma non muoiono. I geni che codificano enzimi degradativi sono sui plasmidi. Se lo perdessero, non degraderà più idrocarburi, ma vive ancora.

Metabolismo batterico

Il metabolismo primario è quell'insieme di processi metabolici necessari alla cellula per duplicarsi (biosintesi nucleotidi, amminoacidi, proteine, ecc.). È molto attivo quando la coltura della cellula batterica è in fase esponenziale. Con l'esaurirsi dei nutrienti, la curva entra in fase stazionaria. Nei batteri produttori di antibiotici, la produzione di queste molecole inizia quando siamo in fase stazionaria. Tutti gli enzimi coinvolti nella sintesi di antibiotici, i geni corrispondenti sono sui plasmidi. La produzione di antibiotici rientra nel metabolismo secondario perché non è essenziale per la vitalità della cellula e subentra quando c'è un rallentamento del metabolismo primario.

Il DNA batterico è situato nel nucleoide che non è separato dal citoplasma dalla membrana nucleare. La cellula batterica ha una lunghezza di 1.5-2 μm. Se misurassimo la lunghezza del suo cromosoma è 1.5 mm. Quindi è chiaro che il DNA cromosomale deve essere molto compattato.

Nel citoplasma abbiamo ribosomi ma anche altre proteine coinvolte in vari processi: fattori entropici che aiutano a compattare il DNA. Anche negli eucarioti abbiamo qualcosa di simile: le principali proteine che permettono la compattazione del DNA sono gli istoni. Nei batteri non esistono, ma negli archea sì.

• SMC (proteine che garantiscono la struttura del cromosoma). Sono comuni agli eucarioti anche se non sono esattamente la stessa cosa, rientrano nella famiglia.
• NAP (proteine associate al nucleoide). Le principali proteine importanti sono diverse come il Dps, Fis, H-NS, HIJ, IHF, Lrp.

Per compattarlo è importante anche la topologia del DNA, ossia che la molecola di DNA batterico può essere in uno stato di equilibrio tra la forma rilassata e superavvolta. Gli enzimi coinvolti nel superavvolgimento sono le Topoisomerasi tipo I e II come la DNA girasi responsabile del superavvolgimento. Altre topoiosmerasi rilassano il DNA. Le DNA girasi sono essenziali per la cellula batterica e quindi sono ottimi bersagli dagli antibiotici (fluorochinoloni sono bersagli delle DNA girasi).

Le proteine SMC hanno due estremità globulari e ogni subunità globulare idrolizza l'ATP. Sono unite da una cerniera che permette a queste proteine di assumere una struttura lineare o ripiegata. Le proteine per condensare il DNA si legano in punti diversi del DNA e piegandosi a livello di questa cerniera compattano il DNA.

Genoma batterico

Come si è fatto a capire che il genoma di E. coli è circolare? Si usò la timina triziata marcata aggiunta al terreno di coltura con E. coli il quale incorpora nel DNA neosintetizzato la timina marcata radioattivamente. Estraendo il DNA, si è potuto visualizzare il DNA. Il meccanismo di duplicazione del DNA batterico è chiamato Teta perché ricorda la lettera greca.

Il DNA è in equilibrio tra rilassato e superavvolto. Con studi successivi è stato dimostrato che quando si superavvolge si creano domini di superavvolgimento separati l'uno dall'altro. Se introduciamo un taglio in un singolo dominio, sarà solo quello che perde lo stato di superavvolto. Il numero di cromosomi varia a seconda della fase di crescita, ambiente, ecc. (in esponenziale è più elevato che in stazionaria).

Sono necessarie due regioni particolari per la duplicazione del DNA. Abbiamo regioni Ori per dire che è l'origine di replicazione. L'altra è Ter ossia sito di terminazione della duplicazione del DNA. L'insieme di queste regioni si spostano durante le fasi di replicazione di DNA. La distribuzione e l'ordine con cui i geni si susseguono nel DNA seguono una certa logica. I geni più vicini all'O sono quelli replicati per primi.

E. coli è un batterio che ha un cromosoma circolare con plasmidi. A volte ci sono eccezioni rappresentati dagli acidi nucleici presenti in una specie batterica patogena. Contiene un cromosoma che è lineare e tutta una serie di plasmidi sia circolari sia lineari molto variabili in dimensioni e l'insieme del materiale genetico è il genoma della specie Borrelia burgorferi responsabile della sindrome di Lyme, che è una patologia che insorge nell'uomo a seguito di batteri vettoriati dagli animali.

I plasmidi possono essere piccoli (1-2 kbp) o molto grandi (160-200 kbp). Possono variare tra i plasmidi anche il numero di copie: a basso numero (4-5) o alto numero (fino a 100). Nei batteri possiamo avere uno o più cromosomi e possono essere circolari o lineari o entrambi insieme. Se sono insieme nella cellula, entrambe le tipologie sono necessarie per la vitalità della cellula perché contengono geni fondamentali. Le dimensioni possono essere piccole o grandi.

Il genoma batterico e quello eucariotico hanno differenza: il 90% di DNA batterico è codificante, nell'eucariotico la maggior parte non lo è. E. coli ha una dimensione di circa 6.000 kbp o 6 Mbp. Nel micoplasma hanno dimensioni del genoma di 1/10 di E. coli (500 kbp). Specie del genere Mycoplasma sono batteri intracellulari e quindi nell'evoluzione hanno perso tutta la parte del genoma che serve per entrare nella cellula ospite perché sono già dentro.

Ricordiamo gli pseudogeni: sequenza che nel corso dell'evoluzione ha perso la sua capacità codificante. Se all'interno del gene subentrano mutazioni puntiformi (sostituzioni base con un'altra), l'introduzione di sostituzione provoca la formazione dei codoni di stop. Quindi la proteina verrà sintetizzata tronca e quindi perde la funzione. Sono riconducibili a sequenze che in passato erano codificanti. Con le ultime tecniche, si dimostrò la presenza di pseudogeni nei batteri.

Nell'uomo la percentuale di sequenze non condificanti è elevatissima, al contrario di E. coli o Mycoplasma pulmonis.

DNA accessorio

Il ceppo di E. coli patogeno contiene sequenze nel suo cromosoma che giustificano il fatto della sua patogenicità. Esso ha sequenze specifiche che lo identificano nei confronti di un ceppo di E. coli non patogeno. Hanno diversi geni in comune. Nell'isola di patogenicità abbiamo fattori di virulenza posseduti dai ceppi batterici patogeni:

• Adesine che sono proteine che permettono al batterio di aderire alla superficie della cellula ospite;
• Invasine sono fattori che gli permettono di entrare nella cellula ospite.

La perdita di isole di patogenicità porta nel corso della crescita del batterio a ottenere un derivato del ceppo non patogeno ma capace di stimolare il sistema immunitario. Quindi posso usarlo come vaccino perché non è patogeno avendo perso tutte le sequenze coinvolte nella patogenesi e lo posso usare per difendere l'individuo.

Perde le sequenze casualmente quando il batterio entra in contatto con la cellula ospite. Oggi si usa il Mycobacterium bovis e attraverso una serie di passaggi su terreni in vitro ha perso la sua capacità. Una volta individuata la regione che contenga geni si può eliminare e inattivare quelle regioni così da renderli non virulenti e usarli per produrre vaccini. Esistono altre isole che favoriscono la colonizzazione in un certo ambiente naturale (isole ecologiche), ecc.

Quando si sequenzia il genoma batterico si cerca di individuare certi geni. Confrontando la sequenza nucleotidica di due batteri, si cerca di capire quali geni sono responsabili nel metabolismo primario perché codificano enzimi che fanno tutte la stessa funzione e quindi la sequenza nucleotidica è conservata (omologia a livello di basi). Ma ci sono geni unici oppure comuni a numerosi batteri ma per i quali non si è ancora capita la funzione.

Per risalire alla funzione del gene si deve inattivare il gene e capire cosa comporta per il gene. Se fornisco quel prodotto genico in un plasmide e questo lo inserisco in una cellula che sottopongo a un trattamento metagenico per inattivare il gene, il mutante vive perché il prodotto genico è presente sul plasmide. Mutanti letali condizionali: mutante che vive a 20°C ma non a 37°C perché serve un certo prodotto genico per vivere ma che è stato inattivato a quella temperatura.

Le barre blu indicano i geni che non si sanno a cosa servono. 103 di quei 170, qualunque cosa facciano, non sono essenziali per la crescita della cellula stessa. Si dimostrò questo utilizzando i trasposoni. Prendiamo una coltura del ceppo e trasforiamo le cellule con un plasmide con questo trasposone che si inserisce casualmente nella cellula batterica che essendo codificante si inserisce in uno di questi geni. Ottengo colonie aventi cellula batterica col trasposone inserito in un certo punto. Se sono riuscito a ottenere colonie mutanti allora i geni bloccati non erano essenziali. Conoscendone l'ordine e la sequenza nucleotidica io posso sapere dove si è inserito il trasposone. Viene usato per ottenere mutanti.

Per cercarli si cercano mutanti spontanei. Per trovarli io prendo un'elevata concentrazione di cellule e seminarla su un terreno contenenti antibiotico 10 volte superiore alla quantità minima di antibiotico che uccide la cellula sensibile. Se crescono delle colonie sono resistenti perché la presenza dell'antibiotico a quella concentrazione ha selezionato tra le varie cellule che ho inoculato, una cellula avente mutazione che gli conferì resistenza all'antibiotico.

Se confrontassimo il genoma del ceppo batterico 1 piuttosto che 2, vediamo che tra i due genomi avremo un nucleo di geni conservato (coinvolti nel metabolismo primario) e una serie di geni caratteristici di uno e dell'altra specie batterica. Il numero minimo di geni essenziali per la vita deriva da Mycoplasma pneumoniae (genoma piccolissimo 580 kbasi).

Nell'evoluzione alcune specie batteriche hanno perso parte del loro genoma. Nella Buchnera vive in simbiosi con gli afidi, nutrendosi di essi. Il batterio è favorito dal fatto che l'afide fornisce i nutrienti. Molti dei geni che codificano per amminoacidi sono localizzati sui plasmidi oltre che sul genoma. Dato che ci sono copie aggiuntive di geni che codificano questi amminoacidi vuol dire che avremo più prodotti finali.

Fenotipi conferiti all'ospite batterico da plasmidi

• Resistenza da antibiotici o da altri farmaci (antiseptici o disinfettanti)
• Sintesi enzimi catabolici (degradazioni idrocarburi, toluene, ecc.)
• Sintesi di antagonisti per lo sviluppo di altri microrganismi (plasmidi che formano i geni biosintetici degli antibiotici). Alcuni sono usati per formare antitumorali.
• Sintesi di prodotti che consentano l'interazione con organismi
• Sintesi di enzimi della replicazione e riparazione del danno da UV e DNA
• Induzioni della proliferazione tumorale, in simbiosi con le piante (Agrobacterium tumefaciens).

All'interno di questo plasmide TI abbiamo un t-DNA che è una porzione del plasmide che si integra nel genoma della cellula vegetale provocandone il tumore. Si sostituisce alla regione T-DNA il gene che voglio introdurre nel genoma della pianta. Così infettando la pianta con la resistenza all'erbicida, la pianta lo integra diventando resistenza all'erbicida dando un vantaggio economico. Il plasmide si chiama TI. Se i plasmidi sono trasferibili da una specie all'altra, la specie che non aveva quei plasmidi acquisisce una caratteristica fenotipica.

I batteri che appartengono al genere Rhyzobium formano i nodi radicali nelle piante, importanti per la fissazione dell'azoto. Alcuni batteri sono coniugabili ossia una certa caratteristica batterica può essere trasferita attraverso la coniugazione. La pericolosità dei plasmidi è legata al fatto che possono portare più di un gene per la resistenza agli antibiotici (ceppo multiresistenti) e se sono coniugabili è facile la diffusione e l'aumento alla resistenza per diversi ceppi. Molti sono resistenti ai metalli pesanti.

Alcune cellule possono contenere più di un plasmide, ma essi sono divisi in gruppi di incompatibilità. Se i due plasmidi appartengono allo stesso gruppo di incompatibilità, la cellula batterica con uno di questi plasmidi ne mantiene solo uno. Se la trasformo con due ceppi appartenenti a due diversi gruppi di incompatibilità, la cellula li tiene entrambi. L'incompatibilità dipende dal meccanismo di replicazione: se coinvolte gli stessi enzimi sono incompatibili, se sono diversi stanno nella cellula. La distribuzione di plasmidi nelle cellule figlie è chiamata segregazione. Un ruolo importante lo giocano quelle proteine che appartengono al citoscheletro batterico che oltre a contribuire alla forma, sono importanti nella segregazione batterica.

Nel genoma del Vibrio cholerae (gram -) il cromosoma è suddiviso in due cromosomi ed entrambi contengono geni che sono essenziali per la vitalità della cellula batterica. Per dimostrare che un battere ha i plasmidi si lisa la cellula così da liberare DNA cromosomale e plasmidico. Trattando con lisozima che rompe la parete e vari detergenti che alterano la membrana cellulare, si frammenta anche il DNA cromosomale. Il lisato viene ultracentrifugato caricando la miscela su una superficie di cloruro di cesio.

Mentre preparo il gradiente aggiungo il bromuro di etidio (agente chimico che si intercala tra le basi di DNA). Esponendo a una fonte di radiazione UV, il DNA emette fluorescenza rosa. Il bromuro di etidio si intercala tra le basi in modo maggiore nella lineare. Le molecole di DNA si mettono nel gradiente ad un'altezza che corrisponde a quello che è al loro peso. Quelle più pesanti stanno sul basso, quelle più leggere in alto. Alla fine illumino con UV e vedo anello rosa in alto e eventualmente anello rosa in basso. Con una siringa buco la provetta nell'anello basso e aspiro. Questo è il DNA plasmidico.

I plasmidi lineari hanno estremità circolari oppure aperte. La duplicazione del plasmide può essere a teta o a cerchio rotante. Il plasmide F è implicato nella coniugazione per la formazione del pilus. La regione TRA del plasmide ha geni che codificano per il trasferimento.