Appunti Microbiologia - terza parte

BINARIA?

Questo tempo è chiamato tempo medio di generazione perché la cellula durante la sua fase di vita non cresce sempre in modo

costante, lo fa soltanto nella cosiddetta fase esponenziale (v costante) all’interno della quale possiamo considerare e calcolare quel

tempo medio di generazione: viene indicato con g minuscolo e rappresenta il tempo indicato per avere un raddoppio (g=t/n).

g può essere molto diverso per i vari microorg e anche per lo stesso microorg può variare in funzione delle condizioni di crescita.

Ovviamente più ci si avvicina alle condizioni ottimali di crescita per quel microorganismo, più g sarà basso.

IN QUANTO TEMPO SI RIPRODUCE UN BATTERIO? Ca. 20/30min, 1h (a seconda del batterio)

 Crescita esponenziale, per questo nell’arco di tempo si ha una crescita notevole di cellule microbiche.

Lieviti e muffe (pluricellulari) hanno bisogno di un tempo maggiore per riprodursi (lieviti sono eucarioti quindi devono riprodurre

strutture più complesse, muffe devono sviluppare micelio vegetativo e aereo). g delle muffe è ancora maggiore rispetto ai lieviti.

QUANTO TEMPO DOBBIAMO INCUBARE PER AVERE UNA RESA CELLULARE ELEVATA?

Batteri 8h/max 1 notte, lieviti 1gg, muffe 2-3gg.

Costante di velocità di crescita K = n° di raddoppiamenti che quel microorganismo riesce a compiere per unità di tempo (1h)

esprimo velocità di crescita come una costante e valuto come varia per paragonare crescita tra un microorg e un altro o crescita

dello stesso microorg ma cambiando alcuni parametri di crescita.

K si calcola come n/t o 1/g (inverso del tempo medio di generazione).

Questo vale solo per i batteri perché solo essi riescono a dividersi in maniera costante per scissione binaria; lieviti possono fare più

blastospore per ogni cellula madre (non si può prevedere quante blastospore ogni singola cellula madre sarà in grado di produrre);

muffe essendo pluricellulari e allungando i filamenti che costituiscono micelio vegetativo e aereo, non c’è possibilità di valutarle

(possiamo valutarle misurando peso secco oppure preparando una sospensione di spore funginee con le quali predisporre

determinati studi, ma non possiamo avere un’espressione della crescita).

CURVA DI CRESCITA BATTERICA

A questo punto si può seguire la crescita di un microorganismo all’interno di un terreno: curva di crescita.

Curva di crescita batterica considerata in un sistema chiuso (piastra/provetta) dove la fase attiva di crescita ad un certo punto

cesserà, perché verrà a mancare qualche fonte necessaria, consumata dai microorganismi che si riproducono e aumentano di

numero e nel contempo si andranno ad accumulare prodotti di rifiuto.

Ascisse: tempo di incubazione 

Ordinate: (log del) n° di cellule che vengono a formarsi nel tempo log perché così è più

facile costruire il grafico esponenziale senza dover usare una carta logaritmica

NB! Se eseguo conta totale avrò in ordinata (log del) n° di cellule, se eseguo carica vitale

avrò (log dell’) UFC per grammo o ml.

Prima fase di crescita (latenza) piuttosto corta, qui la velocità di crescita è uguale a zero

 fase di latenza è una fase di adattamento delle cellule inoculate in un dato terreno

prima di riuscire a duplicarsi a velocità costante.

Ultima fase (morte) sarà più o meno evidente in base al metodo di conta usato, perciò importante indicare il metodo di conta usato

per seguire intero andamento.

Come si fa a costruire la curva di crescita batterica?

Si parte dal trapianto di mantenimento; solitamente si misura in un terreno liquido perché più facile.

Prelevo poca patina dal trapianto di mantenimento e faccio un passaggio in terreno liquido per rivitalizzare al meglio le

cellule(trapianti di mantenimento vengono tenuti almeno una settimana prima del trapianto successivo quindi le cellule potrebbero

essersi inattivate).

Da qui preparo preinoculo cioè un’aliquota di questo passaggio serve per inoculare una provetta contenente il terreno nel quale io

decido di valutare la curva di crescita del batterio. Si chiama preinoculo perché è la sospensione cellulare che deve essere preparata

fresca e che servirà per iniziare l’esperimento, inoculando contemporaneamente una serie di provette con lo stesso volume di

sospensione cellulare in modo tale che al tempo zero tutte le provette che inoculo contengano lo stesso numero iniziale di cellule;

queste provette(inoculate con la stessa q di sospensione cellulare del preincoulo) andranno incubate alla T richiesta.

Preparo tante provette inoculate quanti sono i tempi che voglio valutare come crescita: per un batterio i tempi sono solitamente 2-

4-8-12-24h -> tempi che permettono di costruire una curva di crescita in cui posso osservare tutte le fasi (latenza, esponenziale,

stazionaria).

Fase di morte mi interessa poco perché solitamente quando voglio studiare un microorganismo farò in modo di non utilizzarlo mai

come inoculo o preinoculo se è già presente nella fase stazionaria perché è già una fase in cui la crescita si è arrestata = cellule non



sono attive effettuo prelievo quando le cellule sono nella fase esponenziale = reale fase attiva di crescita.

IN SINTESI: PASSAGGI PER COSTRUIRE LA CURVA

1. Prelievo da trapianto di mantenimento

2. Rivitalizzazione in terreno liquido

3. Preparazione preinoculo fresco (= un’aliquota prelevata dal terreno liquido con le cellule rivitalizzate)

2/3 9

4. Prelievo di aliquota uguale (=preinoculo) a inoculare serie di provette; partire con inoculo di [] 10 per arrivare ad una [] 10

5. Conta: provetta segnata come tempo zero va subito alla determinazione della carica (sia conta totale che vitale)

6. Incubazione: le altre provette verranno incubate alla T indicata dal saggio

7. Valutazione carica cellulare: ad intervalli prefissati ogni provetta verrà tolta dall’incubatore e valutata per quanto riguarda la

carica cellulare (tutte con lo stesso metodo di conta) – procedo almeno fino alle 24h (per i batteri)

I. FASE DI LATENZA – LAG

Non la troviamo sempre perché è una fase di adattamento dei microorganismi al mezzo di coltura; non è

una fase “utile” in termini applicativi dal momento che è una fase in cui non c’è crescita (non è una fase fruttuosa).

Fase lag si può anche eliminare se viene utilizzato il preinoculo fresco, che mi dà cellule già metabolicamente attive.

La presenza di questa fase è influenzata da

- stato fisiologico delle cellule: se prelevate in fase stazionaria, devono ripristinare il loro apparato metabolico

- tipo di terreno colturale: se ad esempio la fonte di carbonio è una fonte non prontamente assimilabile, le cellule devono

sintetizzare enzimi inducibili

-> influenzata da presenza di fonti di carbonio non prontamente assimilabili: bisogna dare il tempo al microorganismo di

produrre gli enzimi (=enzimi inducibili) necessari per assimilarle.

II. FASE ESPONENZIALE – LOG

Fase di crescita dei batteri alla velocità massima esponenziale: raddoppio della popolazione in una

coltura chiusa(es. interno di una beuta/provetta) a intervalli costanti di tempo.

È la fase in cui si ha la maggior resa cellulare.

Ad un determinato punto la crescita si interrompe perché nutriliti vengono consumati fino ad essere esauriti: fine fase di

crescita, si entra nella fase stazionaria.

È verso la fine della fase log che si ha accumulo di metaboliti primari = prodotti del metabolismo cellulare dei vari



microorganismi (per loro sono prodotti di scarto) probabile variazione di pH. Metaboliti primari vengono raccolti entro la

fase di crescita. (es. acido lattico può venire estratto e usato a livello industriale)

Termina per mancanza di nutriliti e per accumulo di metaboliti che possono variare il pH e quindi le condizioni ambientali.

NB! non bisogna esagerare con la concentrazione cellulare altrimenti troppa poca H O.

2

III. FASE STAZIONARIA

Crescita azzerata (v=0): le cellule non crescono più, non si riproducono ma sono ancora vitali

 in questa fase n° di cellule resta costante; sono in una condizione di stallo non trovandosi più nelle

condizioni ottimali. Se non arrivano tempi migliori vanno in contro alla morte.

Qui accumulo di metaboliti secondari = antibiotici: vengono prodotti solo in condizioni restrittive di

crescita, quando ambiente non è più favorevole. 

Chi è in grado, produce sostanze antibiotiche che espulse all’esterno possono uccidere le altre cellule condizione di

competizione per i pochi nutrienti rimasti per sopravvivere.

In questa fase avviene sporificazione dei batteri sporigeni: spore che si liberano non andranno alla fase di morte ma

sopravvivono; quando si troveranno in condizioni a loro gradite possono attuare il processo inverso e andare a ricreare il

batterio che le aveva prodotte.

IV. FASE DI MORTE

Consegue fase stazionaria: n° di cellule vitali decresce in modo esponenziale.

Curva diversa a seconda del metodo di conta usato: conta vitale A o totale B.

(B: fase stazionaria si prolunga nel tempo perché si vedono ancora cellule morte integre non lise).

!Fase in cui non bisogna fare prelievi per preinoculo.

CURVA DI CRESCITA FUNGINA Per i batteri posso preparare preinoculo per avere stessa carica

iniziale; per muffe preinoculo difficile perché non si riesce ad

avere un inoculo uguale al t=0 in quanto difficile prelievo

uniforme.

Come costruire una curva di crescita fungina?

Si fa crescere la muffa sulla superficie di terreno agarizzato per

6-7gg a far sviluppare micelio aereo colorato (=sporificato).

Viene preparata una soluzione fungina: spore prelevate con

spatola e diluite => soluzione fungina => preinoculo.

Prelevazione da coltura liquida.

x: tempo di incubazione y: peso secco delle cellule (no UCF)

FASE DI LATENZA: in caso di muffe avrò per forza questa fase perché devono ricreare il micelio.

FASE DI CRESCITA: no esponenziale, ma fase attiva di crescita.

FASE STAZIONARIA: più prolungata rispetto alla crescita batterica. Anche muffe producono antibiotici nella fase stazionaria.

FASE FINALE: la massa di micelio non può scomparire quindi non considero la fase di morte, anche perché con la produzione di

spore potrebbe essere possibile il ripristino della muffa originale.

Andamento uguale a curva batterica ma cambiano i parametri peso secco (invece che UCF), tempo (+lungo), preinoculo (diverso).

CRESCITA DIAUXICA

Microorganismo può trovarsi in condizioni di terreno ricche: es. 2 diverse fonti di carbonio entrambe assimilabili dal



microorganismo avrò 2 curve di crescita una sopra l’altra: prima viene utilizzata la fonte di C prontamente assimilabile e solo in

un secondo momento (quando glucosio viene a mancare) utilizzo de