Appunti Farmacologia

Con architettura del dosaggio immunologico s’intende il

processo attraverso cui si evidenzia l’analita, ovvero

l’Ag, che si lega all’Ab. In particolare, possiamo definire

se il tracciante è legato all’Ab piuttosto che all’Ag,

quanti tipi di Ab vengono utilizzati per riconoscere i

diversi epitopi dell’Ag e che relazione c’è tra il segnale

analitico misurato e la concentrazione degli anticorpi.

Possiamo così definire dosaggi competitivi, dosaggi non

competitivi, dosaggi in fase eterogenea e dosaggi in

fase omogenea.

I metodi competitivi possono essere definiti, oltre che in

difetto di Ab o in eccesso di Ag, anche come metodi di

spiazzamento o di saturazione. Il dosaggio competitivo

è basato sulla competizione tra un Ag non marcato e un

antigene marcato, che indicheremo come Ag*, per i siti

di legami degli Ab presenti in concentrazione costante.

L’Ag , ovvero l’analita, da misurare sarà presente in

quantità variabili nel campione, mentre l’Ag marcato

sarà aggiunto in quantità costante, comunque inferiore

alla quantità totale di Ab presente. In questo modo, in

assenza dell’analita, soltanto una parte di Ag* marcato

si legherà agli Ab.

Il dosaggio competitivo richiede diverse fasi: in una

prima fase vengono aggiunti i diversi reattivi, che

possono essere aggiunti tutti assieme oppure in fasi

successive: ad esempio prima gli Ag* e poi gli Ag liberi,

ovvero gli analiti da analizzare. Abbiamo quindi una fase

di incubazione in cui i reattivi hanno tempo di interagire

tra di loro per formare i legami Ag-Ab.

Seguirà una fase di lavaggio in cui dovranno essere

eliminati tutti i reattivi rimasti liberi. In questo caso

saranno eliminati tutti gli Ag e gli Ag* che non si sono

legati agli Ab.

Nel caso in cui il tracciante sia un enzima, avremo un

ulteriore fase in cui sarà aggiunto un substrato

specifico. Viceversa se il tracciante è un radioattivo o

una molecola fluorescente questo passaggio sarà

omesso. Infine avremo l’ultima fase in cui sarà misurato

il segnale analitico emesso dal tracciante. Nel caso in

cui il tracciante sia costituito da un enzima, il substrato

aggiunto sarà metabolizzato dando origine ad una

molecola colorata che potrà essere quantizzata.

Nei metodi competitivi la quantità di segnale prodotto

diminuirà all’aumentare della concentrazione

dell’analita, infatti maggiore sarà la quantità dell’analita

presente nel campione minore sarà la quantità di Ag

marcato che si legherà all’Ab. Spesso nelle curve dei

saggi competitivi le concentrazioni degli analiti vengono

espresse in forma logaritmica.

Il principale vantaggio dei metodi competitivi è che

possono riconoscere qualsiasi Ag, anche quelli più

piccoli e gli apteni con un solo epitopo.

Tuttavia per poter rilevare basse concentrazioni di

analiti, i dosaggi competitivi necessitano di Ab ad alta

affinità e dei traccianti con attività specifica molto

elevata. Inoltre, per poter ottenere un’ottima ripetibilità

è necessario che la quantità di Ab presente nei diversi

saggi sia sempre costante. Poiché nei saggi competitivi

l’Ag è riconosciuto dall’Ab attraverso un solo epitopo,

eventuali frammenti o metaboliti dello stesso Ag

presenti nel campione possono essere riconosciuti

dall’Ab, sovrastimando di conseguenza la

concentrazione dell’Ag.

Passiamo ora ad analizzare i metodi non competitivi, o

metodi ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay. I

metodi non competitivi possono essere di tipo indiretto

o a sandwich, che necessitano di un secondo Ab, o

metodi non competitivi diretti in cui si usa un solo Ab. I

metodi non competitivi, a differenza dei metodi

competitivi, funzionano in eccesso di Ab, ovvero in

difetto di Ag. Sono stati sviluppati a partire dagli anni 80

e sono i metodi maggiormente usati per determinare le

concentrazioni degli analiti ad alto peso molecolare. I

metodi non competitivi in diretti sono caratterizzati

dall’uso di sue anticorpi che riconoscono due epitopi

diversi presenti sull’Ag.

Nell’architettura dei saggi non competitivi in fase

eterogenea, vedremo tra poco le differenze tra fase

eterogenea ed omogenea, il primo Ab, denominato Ab

di legame o di cattura, è generalmente fissato a dei

supporti solidi, che possono essere delle piaste, delle

biglie o particelle di natura diversa. Il secondo Ab

invece, detto di rilevazione, è libero ed è coniugato con

il tracciante. Gli Ab sia di cattura che di segnale

dovranno essere in concentrazioni superiori all’analita, o

al calibratore, da misurare. Gli Ab di segnale possono

essere aggiunti insieme all’analita, oppure

successivamente, dopo una fase di incubazione e

lavaggio.

Come per i metodi competitivi, anche nei metodi non

competitivi se il tracciante è un enzima le ultime fase

saranno l’aggiunta di un substrato che sarà

metabolizzato dall’enzima in un prodotto colorato che

sarà il segnale da misurare.

La quantità dei reagenti da utilizzare nei metodi non

competitivi vanno determinati accuratamente, in base

alle concentrazioni di analita da misurare. Infatti se le

concentrazioni dell’analita dovessero essere vicine, o

addirittura superare le concentrazioni degli Ab, ci si

troverebbe in una situazione di difetto di Ab in cui la

relazione tra segnale e concentrazione dell’analita

raggiungerebbe un livello di saturazione, un livello di

plateau. Viceversa, concentrazioni troppo elevate di Ab*

marcato, o troppo basse di analita, potrebbe avere un

rumore di fondo, un segnale aspecifico, molto alto.

A differenza dei metodi competitivi, nei metodi non

competitivi il segnale aumenta all’aumentare della

concentrazione dell’analita. Il grafico che rappresenta il

segnale rilevato è una curva sigmoide. Abbiamo una

fase lineare in cui il seganle aumenta

proporzionalmente all’aumentare dell’analita. Nella

parte inferiore e superiore del grafico la quantità di

segnale misurato non è proporzionale alla

concentrazione dell’analita, e quindi non sono

attendibile per le misurazioni. Nella parte bassa, il

segnale rilevato sarà scarso e facilmente influenzato dal

rumore di fondo, viceversa nella parte alta della curva,

il sistema raggiungerà un livello di saturazione e non

sarà più possibile rilevare ulteriori aumenti di segnale

all’aumentare della concentrazione dell’analità. Nel

caso in cui le concentrazioni dell’analita fossero elevate,

nel range dei valori di saturazione della curva, per poter

quantificare correttamente la concentrazione

dell’analità sarà necessario eseguire delle diluizioni, in

modo da portare le concentrazioni dell’analita nella

regione lineare della curva. I metodi non competitivi,

come già detto, sono i metodi maggiormente utilizzati

per misurare analiti con peso molecolare elevato. Tra i

principali vantaggi di questi metodi troviamo una

maggiore specificità e una maggiore sensibilità. A

differenza dei metodi non competitivi, dove l’analità è

riconosciuto da un solo, la maggiore specificità dei

metodi non competitivi è dovuta all’utilizzo di due Ab

distinti che riconoscono due epitopi diversi dell’analita.

L’utilizzo di due Ab che riconoscono epitopi diversi

permette infatti di discriminare tra molecole che

presentano omologie molto elevate, come ad esempio

gli ormoni ipofisari. I metodi non competitivi sono molto

più sensibili perché c’è una proporzionalità diretta tra le

concentrazioni di Ag e il segnale analitico emesso.

La maggior limitazione dei metodi non competitivi è

data dal fatto che non possono essere usati per

misurare molecole di piccole dimensioni, come gli

apteni, perché gli Ag devono presentare almeno due

epitopi distinti. Inoltre si corre il rischio sottostimare le

concentrazioni estremamente elevate di analita per

effetto gancio o effetto hook. L’effetto gancio è un

effetto paradosso per cui in campioni con

concentrazioni estremamente elevate di Ag vengono

misurati livelli falsamente bassi. Una possibile

spiegazione dell’effetto gancio potrebbe essere che un

elevata concentrazione di Ag saturerebbe tutti i siti di

legame disponibili degli Ab reagenti impedendo la

formazione del sandwich e causando letture

sottostimate.

Vediamo ora la differenza tra i metodi in fase omogenea e

quelli in fase non omogenea.

Per metodi in fase eterogenea si intendono quei

procedimenti in cui è necessario separare il complesso

Ag-Ab dal complesso Ag*-Ab, o Ag-Ab*, prima di

eseguire la misurazione del segnale, in quanto il

segnale emesso dall’Ag*, o dall’Ab*, è indipendente dal

fatto che gli Ag e gli Ab siano legati tra di loro. Dato che

sia gli Ag* liberi, o gli Ab* liberi, sia quelli legati sono in

grado di emettere un segnale, la separazione dei

reattivi liberi da quelli legati dovrebbe essere la più

efficiente possibile, in modo da non sovrastimare le

concentrazioni dell’analita. Inoltre, la separazione

libero-legato, dovrebbe essere rapida, poco costosa,

non dovrebbe influenzare le interazioni Ag-Ab e non

dovrebbe essere influenzata da fattori esterni.

Viceversa nei dosaggi in fase omogenea la rilevazione

dei complessi Ag-Ab non richiede la separazione fisica

delle frazioni libere e legate.

Nel tempo sono stati sviluppati diversi sistemi per

separare le frazioni libere da quelle legate. Alcuni

metodi, ad esempio, sfruttano le diverse dimensioni

molecolari della frazione libera dell’Ag da quelle

maggiori del complesso Ag-Ab. Ad esempio, il

complesso Ag-Ab può essere separato tramite

precipitazione chimica. La precipitazione si ottiene

aggiungendo agenti precipitanti quali, solfato

d’ammonio, etanolo, politilenglicole che favoriscono la

precipitazione del complesso Ag-Ab.

La maggior dimensione dei complessi Ag-Ab può essere

sfruttata per la separazione fisica dei complessi. In

questo caso si utilizzano materiali come il carbone , la

silice o le resine a scambio ionico, che sono in grado di

trattenere soltanto le molecole di piccole dimensioni.

Praticamente funzionano come dei setacci molecolari.

Altri metodi di separazione utilizzati sfruttano invece

l’utilizzo di un secondo anticorpo, della proteina A o del

sistema avidina biotina. Questi sistemi possono essere

sfruttati per creare complessi insolubili oppure possono

essere lega