Appunti Farmacologia

Architettura del dosaggio immunologico

Con architettura del dosaggio immunologico s'intende il processo attraverso cui si evidenzia l'analita, ovvero l'Ag, che si lega all'Ab. In particolare, possiamo definire se il tracciante è legato all'Ab piuttosto che all'Ag, quanti tipi di Ab vengono utilizzati per riconoscere i diversi epitopi dell'Ag e che relazione c'è tra il segnale analitico misurato e la concentrazione degli anticorpi. Possiamo così definire dosaggi competitivi, dosaggi non competitivi, dosaggi in fase eterogenea e dosaggi in fase omogenea.

Dosaggi competitivi

I metodi competitivi possono essere definiti, oltre che in difetto di Ab o in eccesso di Ag, anche come metodi di spiazzamento o di saturazione. Il dosaggio competitivo è basato sulla competizione tra un Ag non marcato e un antigene marcato, che indicheremo come Ag*, per i siti di legame degli Ab presenti in concentrazione costante. L'Ag, ovvero l'analita, da misurare sarà presente in quantità variabili nel campione, mentre l'Ag marcato sarà aggiunto in quantità costante, comunque inferiore alla quantità totale di Ab presente. In questo modo, in assenza dell'analita, soltanto una parte di Ag* marcato si legherà agli Ab.

Il dosaggio competitivo richiede diverse fasi: in una prima fase vengono aggiunti i diversi reattivi, che possono essere aggiunti tutti assieme oppure in fasi successive: ad esempio prima gli Ag* e poi gli Ag liberi, ovvero gli analiti da analizzare. Abbiamo quindi una fase di incubazione in cui i reattivi hanno tempo di interagire tra di loro per formare i legami Ag-Ab. Seguirà una fase di lavaggio in cui dovranno essere eliminati tutti i reattivi rimasti liberi. In questo caso saranno eliminati tutti gli Ag e gli Ag* che non si sono legati agli Ab.

Nel caso in cui il tracciante sia un enzima, avremo un'ulteriore fase in cui sarà aggiunto un substrato specifico. Viceversa, se il tracciante è un radioattivo o una molecola fluorescente, questo passaggio sarà omesso. Infine, avremo l'ultima fase in cui sarà misurato il segnale analitico emesso dal tracciante. Nel caso in cui il tracciante sia costituito da un enzima, il substrato aggiunto sarà metabolizzato dando origine a una molecola colorata che potrà essere quantizzata.

Nei metodi competitivi, la quantità di segnale prodotto diminuirà all'aumentare della concentrazione dell'analita. Infatti, maggiore sarà la quantità dell'analita presente nel campione, minore sarà la quantità di Ag marcato che si legherà all'Ab. Spesso nelle curve dei dosaggi competitivi, le concentrazioni degli analiti vengono espresse in forma logaritmica.

Il principale vantaggio dei metodi competitivi è che possono riconoscere qualsiasi Ag, anche quelli più piccoli e gli apteni con un solo epitopo. Tuttavia, per poter rilevare basse concentrazioni di analiti, i dosaggi competitivi necessitano di Ab ad alta affinità e di traccianti con attività specifica molto elevata. Inoltre, per poter ottenere un'ottima ripetibilità è necessario che la quantità di Ab presente nei diversi dosaggi sia sempre costante. Poiché nei saggi competitivi l'Ag è riconosciuto dall'Ab attraverso un solo epitopo, eventuali frammenti o metaboliti dello stesso Ag presenti nel campione possono essere riconosciuti dall'Ab, sovrastimando di conseguenza la concentrazione dell'Ag.

Metodi non competitivi

Passiamo ora ad analizzare i metodi non competitivi, o metodi ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). I metodi non competitivi possono essere di tipo indiretto o a sandwich, che necessitano di un secondo Ab, o metodi non competitivi diretti in cui si usa un solo Ab. I metodi non competitivi, a differenza dei metodi competitivi, funzionano in eccesso di Ab, ovvero in difetto di Ag. Sono stati sviluppati a partire dagli anni '80 e sono i metodi maggiormente usati per determinare le concentrazioni degli analiti ad alto peso molecolare. I metodi non competitivi indiretti sono caratterizzati dall'uso di due anticorpi che riconoscono due epitopi diversi presenti sull'Ag.

Nell'architettura dei saggi non competitivi in fase eterogenea, vedremo tra poco le differenze tra fase eterogenea ed omogenea, il primo Ab, denominato Ab di legame o di cattura, è generalmente fissato a dei supporti solidi, che possono essere delle piastre, delle biglie o particelle di natura diversa. Il secondo Ab invece, detto di rilevazione, è libero ed è coniugato con il tracciante. Gli Ab sia di cattura che di segnale dovranno essere in concentrazioni superiori all'analita, o al calibratore, da misurare. Gli Ab di segnale possono essere aggiunti insieme all'analita, oppure successivamente, dopo una fase di incubazione e lavaggio.

Come per i metodi competitivi, anche nei metodi non competitivi se il tracciante è un enzima, le ultime fasi saranno l'aggiunta di un substrato che sarà metabolizzato dall'enzima in un prodotto colorato che sarà il segnale da misurare. La quantità dei reagenti da utilizzare nei metodi non competitivi va determinata accuratamente, in base alle concentrazioni di analita da misurare. Infatti, se le concentrazioni dell'analita dovessero essere vicine, o addirittura superare le concentrazioni degli Ab, ci si troverebbe in una situazione di difetto di Ab in cui la relazione tra segnale e concentrazione dell'analita raggiungerebbe un livello di saturazione, un livello di plateau. Viceversa, concentrazioni troppo elevate di Ab marcato, o troppo basse di analita, potrebbero avere un rumore di fondo, un segnale aspecifico, molto alto.

A differenza dei metodi competitivi, nei metodi non competitivi il segnale aumenta all'aumentare della concentrazione dell'analita. Il grafico che rappresenta il segnale rilevato è una curva sigmoide. Abbiamo una fase lineare in cui il segnale aumenta proporzionalmente all'aumentare dell'analita. Nella parte inferiore e superiore del grafico la quantità di segnale misurato non è proporzionale alla concentrazione dell'analita, e quindi non è attendibile per le misurazioni. Nella parte bassa, il segnale rilevato sarà scarso e facilmente influenzato dal rumore di fondo; viceversa, nella parte alta della curva, il sistema raggiungerà un livello di saturazione e non sarà più possibile rilevare ulteriori aumenti di segnale all'aumentare della concentrazione dell'analita. Nel caso in cui le concentrazioni dell'analita fossero elevate, nel range dei valori di saturazione della curva, per poter quantificare correttamente la concentrazione dell'analita sarà necessario eseguire delle diluizioni, in modo da portare le concentrazioni dell'analita nella regione lineare della curva.

I metodi non competitivi, come già detto, sono i metodi maggiormente utilizzati per misurare analiti con peso molecolare elevato. Tra i principali vantaggi di questi metodi troviamo una maggiore specificità e una maggiore sensibilità. A differenza dei metodi competitivi, dove l'analita è riconosciuto da un solo Ab, la maggiore specificità dei metodi non competitivi è dovuta all'utilizzo di due Ab distinti che riconoscono due epitopi diversi dell'analita. L'utilizzo di due Ab che riconoscono epitopi diversi permette infatti di discriminare tra molecole che presentano omologie molto elevate, come ad esempio gli ormoni ipofisari. I metodi non competitivi sono molto più sensibili perché c'è una proporzionalità diretta tra le concentrazioni di Ag e il segnale analitico emesso.

La maggior limitazione dei metodi non competitivi è data dal fatto che non possono essere usati per misurare molecole di piccole dimensioni, come gli apteni, perché gli Ag devono presentare almeno due epitopi distinti. Inoltre, si corre il rischio di sottostimare le concentrazioni estremamente elevate di analita per effetto gancio o effetto hook. L'effetto gancio è un effetto paradosso per cui in campioni con concentrazioni estremamente elevate di Ag vengono misurati livelli falsamente bassi. Una possibile spiegazione dell'effetto gancio potrebbe essere che un'elevata concentrazione di Ag saturerebbe tutti i siti di legame disponibili degli Ab reagenti, impedendo la formazione del sandwich e causando letture sottostimate.

Metodi in fase omogenea e eterogenea

Vediamo ora la differenza tra i metodi in fase omogenea e quelli in fase non omogenea. Per metodi in fase eterogenea si intendono quei procedimenti in cui è necessario separare il complesso Ag-Ab dal complesso Ag*-Ab, o Ag-Ab*, prima di eseguire la misurazione del segnale, in quanto il segnale emesso dall'Ag*, o dall'Ab*, è indipendente dal fatto che gli Ag e gli Ab siano legati tra di loro. Dato che sia gli Ag* liberi, o gli Ab* liberi, sia quelli legati sono in grado di emettere un segnale, la separazione dei reattivi liberi da quelli legati dovrebbe essere la più efficiente possibile, in modo da non sovrastimare le concentrazioni dell'analita. Inoltre, la separazione libero-legato, dovrebbe essere rapida, poco costosa, non dovrebbe influenzare le interazioni Ag-Ab e non dovrebbe essere influenzata da fattori esterni. Viceversa, nei dosaggi in fase omogenea la rilevazione dei complessi Ag-Ab non richiede la separazione fisica delle frazioni libere e legate.

Nel tempo sono stati sviluppati diversi sistemi per separare le frazioni libere da quelle legate. Alcuni metodi, ad esempio, sfruttano le diverse dimensioni molecolari della frazione libera dell'Ag da quelle maggiori del complesso Ag-Ab. Ad esempio, il complesso Ag-Ab può essere separato tramite precipitazione chimica. La precipitazione si ottiene aggiungendo agenti precipitanti quali, solfato d'ammonio, etanolo, polietilenglicole che favoriscono la precipitazione del complesso Ag-Ab.

La maggior dimensione dei complessi Ag-Ab può essere sfruttata per la separazione fisica dei complessi. In questo caso si utilizzano materiali come il carbone, la silice o le resine a scambio ionico, che sono in grado di trattenere soltanto le molecole di piccole dimensioni. Praticamente funzionano come dei setacci molecolari. Altri metodi di separazione utilizzati sfruttano invece l'utilizzo di un secondo anticorpo, della proteina A o del sistema avidina-biotina. Questi sistemi possono essere sfruttati per creare complessi insolubili oppure possono essere lega...