Appunti esame Oncologia molecolare

Oncologia molecolare

I tumori derivano da cellule normali che hanno perso la capacità di creare tessuti di forma e funzione normali. I tumori benigni crescono a livello locale. I tumori maligni invadono tessuti limitrofi e generano metastasi. I carcinomi sono i tumori più frequenti e riguardano le cellule epiteliali di rivestimento (pancreas, polmoni, fegato, mammella) o le cellule mucosali (bocca, esofago, intestino). I sarcomi sono tumori che interessano i tessuti connettivali e coinvolgono cellule mesenchimali (fibroblasti, adipociti, osteoblasti e miociti). I tumori emopoietici portano allo sviluppo di linfomi e di leucemie (plasmacellule, linfociti B e T). I tumori neuroectodermici interessano diverse componenti del sistema nervoso (neuroblastoma, glioma, glioblastoma, medulloblastomi).

Come si originano i tumori?

Durante una prima fase detta di iniziazione, mutazioni casuali o alterazioni epigenetiche in geni chiave trasformano una cellula normale in una cellula neoplastica latente. Lo stimolo cancerogeno iniziale produce quindi un’alterazione della cellula dovuta a un danno al DNA. La cellula può riparare il danno oppure fissare il danno che si traduce in una mutazione somatica. La traduzione del danno in mutazione è di solito legata all’entrata della cellula in mitosi prima che il danno venga riparato. La cellula ha a questo punto acquisito solo il potenziale di diventare una cellula cancerosa. Il tumore non è ancora clinicamente evidente.

Durante la fase di promozione si accumulano ulteriori danni genomici e/o stimoli proliferativi e compare una massa tumorale localizzata. Durante la fase di progressione, ulteriori mutazioni di geni chiave faranno sì che la cellula manifesti il fenotipo metastatico; il tumore diventa quindi maligno. La cancerogenesi è quindi un processo multifasico.

Caratteristiche delle cellule tumorali

Nel 2000, Hanahan e Weinberg hanno pubblicato un lavoro in cui descrissero 6 principali caratteristiche condivise da tutte le cellule tumorali:

• Acquisizione della capacità di proliferare in maniera incontrollata e sostenuta nel tempo. La maggior parte delle cellule decidono se dividersi o no solamente in risposta a segnali provenienti da cellule circostanti. Molte cellule tumorali producono loro stesse i propri segnali di stimolazione;
• Capacità di evadere i segnali che bloccano la proliferazione. Le cellule tumorali diventano insensibili a segnali negativi;
• Resistenza alla morte cellulare. Le cellule normali muoiono quando sono private dei fattori di crescita o quando sono esposte ad agenti che le danneggiano, come per esempio tossine e raggi X. L’apoptosi viene attivata dall’espressione di certi geni nella cellula. Poiché impedisce alle cellule di proliferare quando non dovrebbero ed elimina cellule molto danneggiate, l’apoptosi è probabilmente una salvaguardia contro gli stadi precoci del cancro. Molte cellule tumorali sono molto più resistenti delle cellule normali alla morte cellulare programmata;
• Capacità di formare metastasi. Le cellule normali restano all’interno di confini rigidamente definiti. Le cellule tumorali, invece, acquisiscono spesso la capacità di invadere tessuti circostanti e anche di viaggiare attraverso la circolazione sanguigna, per colonizzare tessuti distanti. La formazione di metastasi (invasioni di nuovi tessuti) è un comportamento complicato che richiede molti cambiamenti genetici;
• Acquisizione di potenziale replicativo illimitato. Molte delle cellule normali (con l’eccezione delle cellule staminali) muoiono spontaneamente dopo un preciso numero di divisioni cellulari. Le cellule tumorali, invece, si possono dividere indefinitamente in quanto esprimono la telomerasi responsabile della protezione dei telomeri;
• Angiogenesi. Una volta che il corpo umano adulto si è sviluppato, non si formano nuovi vasi sanguigni, con l’eccezione della cicatrizzazione delle ferite. Le cellule tumorali, tuttavia, secernono una sostanza che fa crescere i vasi sanguigni verso di loro. I nuovi vasi sanguigni servono come vie di alimentazione, attraverso cui il tumore può procurarsi nuove fonti di nutrimento; i nuovi vasi servono anche come uscite d’emergenza attraverso cui il tumore può metastatizzare.

L’alterazione di base in una cellula cancerosa consiste in una modifica della struttura o dell’espressione di uno o più geni. Tutti i cancerogeni chimici, fisici e virali agiscono producendo alterazioni della struttura o dell’espressione genica. I tumori si generano quindi in seguito a mutazioni in geni chiave. I geni che vengono alterati sono:

• Proto-oncogeni, codificano per proteine cellulari che nella forma WT sono coinvolte nella regolazione della normale crescita cellulare in risposta a fattori di crescita mentre nella forma mutata si attivano in maniera costitutiva inducendo una risposta proliferativa incontrollata. Attivano quindi il ciclo cellulare;
• Onco-soppressori, arrestano il ciclo cellulare o inducono apoptosi;
• Geni coinvolti direttamente in meccanismi di riparazione del DNA;
• Geni coinvolti nella regolazione del processo apoptotico, necrotico o autofagico;
• Geni coinvolti nella regolazione dell’adesione cellulare. L’adesione cellulare è un meccanismo di inibizione della risposta proliferativa. Dunque, in seguito a mutazioni, si viene a perdere l’inibizione da contatto e la cellula inizia a proliferare.

Oncogeni e oncosoppressori

Gli oncogeni sono geni che codificano per proteine che sono direttamente coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare. Gli oncogeni possono essere divisi in classi:

• Fattori di crescita come EGF (epidermal growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), TGFα (tumor growth factor α) (in genere i fattori di crescita non sono mai mutati ma aumenta la loro produzione);
• Recettori dei fattori di crescita come EGFR, FLT3 (che sono recettori tirosin chinasici);
• Proteine di trasduzione del segnale come RAS, SRC e PI3K (in genere mutano);
• Proteine che controllano il ciclo cellulare (cicline e CDK);
• Proteine coinvolte nella regolazione della morte cellulare (Bcl-2 e TRAIL);
• Fattori di trascrizione che regolano il ciclo cellulare come myc e NF-kB (in genere aumenta la loro attività o la loro quantità).

Gli oncosoppressori hanno un effetto opposto. Normalmente, nelle cellule, questi geni codificano per enzimi che bloccano la crescita cellulare. I gatekeeper genes sono tutti quei geni che codificano per proteine che regolano non soltanto in negativo il ciclo cellulare (Rb, p53, APC) ma possono anche attivare l’apoptosi (PTEN, p53). L’inattivazione di questi geni può avvenire per mutazioni missenso, delezioni, inserzioni e silenziamento epigenetico.

Altre caratteristiche delle cellule tumorali

Successivamente, sono state identificate altre 4 caratteristiche relative a tutte le cellule tumorali:

• Tutti i tumori hanno un metabolismo deregolato (una cellula tumorale che prolifera velocemente e che si deve dividere continuamente ha la necessità di rimodulare il suo metabolismo e quindi cercherà di abbassare il suo metabolismo attivando i processi anabolici);
• Tutti i tumori evadono la risposta immunitaria (il tumore viene riconosciuto sia dal sistema innato che adattativo; all’inizio il sistema immunitario è in grado di riconoscere il tumore però, a lungo andare, la pressione della risposta immunitaria indurrà ulteriori modifiche del tumore e la selezione darwiniana favorirà quelle cellule tumorali che mostrano un vantaggio selettivo);
• Tutti i tumori vengono sostenuti e promossi dall’infiammazione;
• Tutti i tumori acquisiscono instabilità genomica e sono più proni a subire mutazioni (ciò è dovuto a deregolazione dei sistemi di riparo del DNA).

Quando il tumore si sviluppa, va a creare un microambiente attraverso la deposizione e la produzione di sostanze che a lungo andare inficiano la funzionalità del tessuto stesso. Gli oncogeni vennero identificati già negli anni ’60 all’interno del genoma di retrovirus. Una volta infettata la cellula, i retrovirus retrotrascrivono il loro RNA in DNA. Grazie alle sequenze LTR, questo DNA viene ricombinato con il DNA della cellula ospite. Quindi, i retrovirus integrano il loro genoma all’interno del genoma della cellula ospite. Questa integrazione può avvenire in qualsiasi sito, è quindi casuale. Una volta che è terminato il periodo di latenza, il virus si riattiva. Il suo RNA verrà quindi di nuovo trascritto e potrà portarsi dietro parte del materiale genetico della cellula ospite. Solo più tardi si scoprì che questi geni non erano altro che geni cellulari che erano stati incorporati nel genoma dei retrovirus e che poi avevano subito delle mutazioni e di conseguenza avevano acquisito questo potere trasformante (dovuto allo loro attivazione costitutiva). La maggior parte degli oncogeni è stata identificata in retrovirus aviani o di roditori. Gli oncogeni sono quindi geni cellulari mutati incorporati all’interno del genoma virale.

Fattori di crescita

Parliamo della prima classe di oncogeni ossia dei fattori di crescita. Il primo fattore di crescita venne identificato nel 1952. Si tratta dell’NGF (nerve growth factor). Nel 1962 venne identificato anche l’EGF (epidermal growth factor). Si tratta di 2 fattori di crescita che, quando vengono prodotti in quantità eccessiva, sono in grado di indurre trasformazione tumorale. La scoperta di questi 2 fattori ha permesso a Rita Levi-Montalcini e al suo allievo Cohen di vincere il premio Nobel nel 1986. In realtà non ci sono mutazioni che riguardano i fattori di crescita. Infatti, si è visto che i fattori di crescita sono over-espressi e over-prodotti dalle stesse cellule tumorali. Una volta trasformate, le cellule tumorali acquisiscono la capacità di produrre da sole grandi quantità di fattori di crescita, i quali promuoveranno la proliferazione.

Recettori per i fattori di crescita

La seconda classe di oncogeni è rappresentata dai recettori per i fattori di crescita. La maggior parte dei recettori per i fattori di crescita appartiene alla famiglia dei recettori tirosin chinasici. Questi recettori, in seguito all’interazione con lo specifico fattore di crescita, dimerizzano. La dimerizzazione permette l’attivazione del dominio catalitico del recettore. In particolare, questi recettori hanno un’attività tirosin chinasica grazie alla quale fosforilano residui di tirosina del recettore stesso. I domini extracellulari sono diversi tra un recettore e l’altro. Segue un dominio transmembrana che permette l’ancoraggio alla membrana. Infine, tutti questi recettori condividono un dominio intracitoplasmatico che è il dominio che possiede l’attività tirosin chinasica: ha un sito catalitico che lega l’ATP e che è in grado di trasferire questo ATP a residui di tirosina, i quali sono essi stessi contenuti nel dominio intracitoplasmatico. I residui di tirosina fosforilati sono molto importanti in quanto rappresentano l’ancoraggio in membrana per tutti gli enzimi citoplasmatici che devono essere reclutati e che sono poi importanti per trasdurre il segnale dalla membrana al citosol fino ad arrivare ai fattori di trascrizione.

La famiglia EGFR

La famiglia EGFR comprende 4 membri:

• EGFR, detto anche HER1 o ErbB1, è un recettore espresso su tutte le cellule epiteliali e ha un’alta affinità di legame sia per l’EGF sia per il TGFα;
• HER2, chiamato anche neu o ErbB2, non lega i fattori di crescita ma è in grado di dimerizzare con gli altri membri della famiglia EGFR (può infatti formare dimeri con HER1 e contribuire alla sua attivazione);
• HER3, chiamato anche ErbB3, ha diversi ligandi ma non ha attività enzimatica, però può aiutare gli altri recettori ad interagire formando dimeri;
• HER4, chiamato anche ErbB4, ha diversi ligandi ma non ha attività enzimatica, però può aiutare gli altri recettori ad interagire formando dimeri.

La struttura degli EGFR è quella tipica dei recettori tirosin chinasici. È presente un dominio extracellulare che contiene dei motivi ricchi in leucina che permettono l’interazione con i fattori di crescita. Segue un dominio transmembrana. Infine, si ha il dominio intracitoplasmatico, dove risiede l’attività tirosin chinasica e dove sono contenute le tirosine che vengono poi fosforilate in seguito all’attivazione del dominio catalitico grazie all’interazione dell’EGFR con il fattore di crescita. Nelle cellule a riposo, in assenza di fattori di crescita, tutti gli EGFR sono monomerici e il dominio intracitoplasmatico è chiuso e inattivo. L’interazione dell’EGFR con il suo fattore di crescita induce dimerizzazione. Si possono formare omodimeri o eterodimeri. In genere, quando l’EGFR dimerizza, la dimerizzazione induce un cambiamento conformazionale che va a propagarsi dal dominio extracellulare fino a quello intracitoplasmatico. In questo modo si ha l’attivazione del dominio catalitico tirosin chinasico. La tirosin chinasi a questo punto va a fosforilare le tirosine che si trovano sull’EGFR stesso. In seguito alla fosforilazione delle tirosine, moltissimi complessi proteici si andranno a legare all’EGFR. Infatti, le tirosine che vengono fosforilate all’interno dell’EGFR sono contenute in motivi che legano dei domini SH2, SH3 e PH. I domini SH2 sono stati identificati la prima volta in Src. Si tratta di domini di interazione proteina-proteina di circa 100 amminoacidi strutturati in modo da legare le tirosine fosforilate contenute in questi motivi. I domini SH3 sono stati identificati la prima volta sempre in Src. Si tratta di domini di interazione proteina-proteina e legano sequenze ricche in prolina. Infine, i domini PH sono domini di interazione proteina-proteina che mediano l’interazione di proteine con i fosfolipidi di membrana. Il numero di proteine coinvolte nella trasduzione del segnale in seguito all’attivazione costitutiva di EGFR che vengono deregolate nei tumori è altissimo. Quando l’EGFR interagisce con il ligando, la tirosin chinasi si attiva, fosforila i residui di tirosina e verranno reclutati una serie di mediatori ed enzimi, i quali attiveranno dei fattori di trascrizione. Questi fattori di trascrizione traslocheranno nel nucleo inducendo l’espressione di geni coinvolti nella proliferazione, nella sopravvivenza, nella resistenza, nell’apoptosi e così via. Quando l’EGFR non è mutato allora la proliferazione sarà controllata. Infatti, il segnale verrà spento perché l’EGF viene consumato. Ma immaginiamo un EGFR mutato e quindi costitutivamente attivo. Questo continuerà a stimolare tutte queste vie portando a una proliferazione incontrollata. Gli studi eseguiti negli anni ’80 identificarono che nella maggior parte dei tumori epiteliali si osservava un aumento dell’espressione dell’EGFR. Da questi primi studi, seguirono poi altri studi di tipo molecolare. Si è identificata così la forma mutata più frequente dell’EGFR espressa in molti tumori aggressivi. Si tratta di una delezione degli esoni dal 2 al 7 del gene che codifica per l’EGFR. In particolare, questi primi esoni codificano per il dominio extracellulare ossia per il dominio che riconosce i fattori di crescita. L’EGFR risultante da questa delezione conserva la capacità di integrarsi nella membrana plasmatica ma quando si integra immediatamente dimerizza. Per cui, la perdita del dominio extracellulare rende l’EGFR costitutivamente attivo. Quindi, le tirosine verranno continuamente fosforilate e tutti i mediatori della trasduzione del segnale verranno stimolati, portando a un segnale continuativo di proliferazione che fa trasformare le cellule. Sapere qual è la mutazione dell’EGFR ci permette di capire quali trattamenti bisogna utilizzare.

HER2 nei tumori

Un altro dei membri della famiglia EGFR frequentemente over-espresso nei tumori mammari e ovarici è HER2. HER2 non è in grado di legare i fattori di crescita, ma dimerizza con HER1 e partecipa attivamente alla segnalazione, perché il suo dominio catalitico funziona bene. L’over-espressione di HER2 è il risultato di un’amplificazione genica. Tuttavia, circa il 30% di tumori presenta una mutazione di una sola tripletta che codifica per un singolo residuo amminoacidico. In particolare, la valina localizzata nel dominio idrofobico transmembrana viene trasformata in glutammina. Questa mutazione porta all’attivazione costitutiva di HER2 che, appena arriva in membrana, dimerizza e comincia ad inviare il segnale in modo continuativo indipendentemente dal fatto che ci sia o meno l’EGF.

Terapie mirate su EGFR e HER2

Sia HER2 che l’EGFR sono stati da tanti anni oggetto di studio per identificare delle terapie efficaci. Uno dei possibili approcci è rappresentato dalla produzione di anticorpi monoclonali. Questi anticorpi sono in grado di interagire con il dominio extracellulare e quindi bloccano l’interazione dell’EGFR con i fattori di crescita impedendo la dimerizzazione. Inoltre, inducono la down-regulation e quindi la degradazione dei recettori. Un altro approccio è invece rappresentato dall’identificazione di inibitori selettivi del dominio chinasico. Quindi, questi inibitori competono con l’ATP in modo da bloccare l’attività chinasica. Se è legato l’inibitore non può legarsi l’ATP. In questo modo, anche se la chinasi è attiva, non può trasferire l’ATP perché l’ATP non c’è.

FLT3 e la sua funzione

FLT3 (FMS-like tyrosine kinase 3) è un recettore tirosin chinasico, che viene espresso a livello dei progenitori ematopoietici sia linfoidi che mieloidi. Tutte le cellule del sangue vengono prodotte a partire da una cellula staminale multipotente presente nel midollo osseo. Da questa cellula staminale si differenziano dei progenitori per la linea mieloide e dei progenitori per la linea linfoide. Il progenitore mieloide, sotto l’effetto di una serie di fattori specifici e citochine, darà origine a piastrine, eritrociti, monociti (precursori dei macrofagi), cellule dendritiche e granulociti.