Biologia molecolare delle cellule staminali - Appunti

Cellule Staminali

• Cellule a un "bivio" tra auto-rinnovamento e processo differenziativo (→ cellula specializzata).

• Il termine "stem cell" coniato per la prima volta da Haeckel nel 1868 riferendosi ad un antenato unicellulare degli organismi multicellulari (←) uovo fecondato che dà vita a cellule dell'organismo.
• Fine '800 (1893): Weismann e la teoria del plasma germinale, Boveri e Hacker hanno adattato la definizione di cellula staminale a tutte le cellule di una linea germinale.
• 1905 → ematologi definiscono ed evidenziano cellula staminale come la intendiamo oggi. Alcuni ematologi pensavano che midollo e linfonodi fossero due linee con cellule progenitrici diverse, altri invece pensavano che cellula ancestrale fosse unica → isolata cellula staminale in grado di differenziarsi.

• Cellula staminale è in grado di auto-rinnovarsi in maniera illimitata con capacità di differenziarsi.

• Cellule staminali non sono soggette al limite di Hayflick, ovvero il numero massimo di divisioni cui vanno incontro le cellule normali prima di smettere di replicarsi → cellule sono soggette al fenomeno della "senescenza replicativa" per via dell'accorciamento dei telomeri.

Cellule Staminali

• Adulte (somatiche / tessuto-specifiche)
• Embrionali
• (Cancerose)

• Cellule staminali adulte sono presenti in tessuti sviluppati e hanno capacità di rinnovamento limitata al loro tessuto. Tale capacità è necessaria per riparare danni e per sostituire cellule morte.
• Cellula staminale ematopoietica (HSC) si trova nel midollo osseo, componente delle ossa bave, che costituisce la nicchia delle cellule staminali (→ "nicchia" intende ambiente circolare per sviluppo cellula staminale, fornisce segnali e influenza capacità di auto-rinnovamento e differenziamento).
• Nel midollo osseo, oltre a HSC, sono presenti altri tipi cellulari che "comunicano" con la HSC.
• "Nicchia" è necessaria a modulare il comportamento della cellula staminale e se cellula staminale non fosse "controllata" ci potrebbe essere squilibrio tra auto-rinnovamento e differenziamento → scelta che deve essere finemente regolata → microambiente estremamente complesso.

• ISCs (Intestinal Stem Cells) risiedono nella cripta intestinale e sono caratterizzate dall'espressione del recettore LGR5; cellule di Paneth forniscono segnali WnT determinando auto-rinnovamento ISC (cellule Paneth sono derivate da ISC ma LGR5-). Cellule mesenchimali, invece, forniscono segnali BMP a ISC determinandone il loro differenziamento (cellule mesenchimali non derivano da ISC).

Cellule staminali embrionali derivano dallo stadio di blastocisti dell'embrione.

Il potenziale differenziativo di queste cellule decresce con l'età.

• Totipotenza: capacità della cellula di generare un individuo.
• Pluripotenza: cellule a stadio di blastocisti, non possono generare l'individuo ma solo derivati dei foglietti embrionali.
• Queste staminali embrionali mantengono tale capacità.

Differenti cellule staminali nel nostro corpo si localizzano nelle nicchie staminali: microambiente costituito da altri tipi cellulari che determinano comportamento della staminale.

• Funzioni principali delle staminali adulte: rigenerazione tessutale e mantenimento dell'omeostasi.

Medicina rigenerativa si basa su utilizzo staminali per rigenerare tessuti/organi in seguito a danno/patologia. Ad oggi, esistono pochi esempi in ambito terapeutico:

1. Cellula staminale ematopoietica (multipotente) che consente la rigenerazione del sistema ematopoietico (multilineare di cellule in stesso sistema).
2. Cellule staminali limbal che permettono la rigenerazione dell'occhio (cornea deve essere costantemente rigenerata) si trovano alle estremità e differenziano procedendo verso il centro della cornea.

Cellule limbal sono circondate dalla "nicchia" e tali cellule staminali limbal sono unipotenti (possono rigenerare solo cornea):

• Se presenti danni alla cornea (o ustioni), tessuto adiacente, la congiuntiva, invade cornea e forma strato che non consente la visione.
• M. De Luca e G. Pellegrini hanno ideato un trattamento con cellule staminali limbal che, insieme a supporto biochimico, rimuove tessuto della congiuntiva e ripristina visione.
• In tali pazienti, trapianto di tale cellule staminali limbal dove garantire auto-rinnovamento illimitato in caso di ulteriori danni (saggio funzionale).

Ricerca cellule staminali si concentra su tipologie cellulari pluripotenti (blastocisti) o totipotenti. Potenziale cellule staminali decresce con l'età:

• Epiblasto (derivato blastocisti) è costituito da cellule multipotenti in grado di generare i tre foglietti embrionali.
• Zigote non è cellula staminale in quanto non c'è in grado di auto-rinnovarsi.
• In vivo non esistono cellule staminali pluripotenti.
• Le cellule restarte da blastocisti sono pluripotenti ma non staminali.
• Potenziale differenziativo non correla con staminalità.

In vitro: è possibile isolare cellule staminali embrionali (che in vivo esistono solo per periodo transiente) ma non tutte le staminali adulte possono essere mantenute in quanto non è possibile riprodurre la loro "nicchia" di appartenenza.

• Cellula staminale va incontro a divisione asimmetrica con formazione una cellula staminale (che rimane/rientra nella nicchia) e una cellula differenziata (che differenzia perché lascia la nicchia).
• Comunicazione tra nicchia e cellula staminale avviene attraverso pathway di segnalazione.

Alcuni miRNA possono indurre abbassamento di livelli della proteina ma anche del messaggero. Nelle cellule ci sono P-bodies nei quali si trovano alcune proteine negative dei miRNA. In tali compartimenti possono avvenire la co-traduzione e l'iniziata, successivamente potranno essere tradotti o degradati definitivamente.

GW182 può competere con la PABP tentando di aprire la struttura circolare della traduzione. Rottura di tale struttura diminuisce efficienza traduzione. GW182 richiama anche fattori di deadenilazione che alterano trascrizione/stabilità del messaggero.

Un miRNA può controllare più target mRNA. Ciascun messaggero può essere regolato da più miRNA. La mRNA di geni housekeeping hanno 3’UTR corti per escludere regolazione miRNA (non necessaria). Al contrario geni da regolare finemente hanno 3’UTR molto lunghi.

Ricerca miRNA può avvenire mediante genetica diretta Proprietaria. Nel caso immunoprecipito miRNA con proteine e utilizzo predizione computazionale per avere probabili miRNA che targettano miRNA (screening fatto selezionando specifici parametri — miRNA su tutto o gene specifico). Utilizzo analisi computazionali per studiare quali mRNA potessero regolare (screening per parametri) tentandomi casi dove verificare tramite saggio di luciferasi (+ immunoprecipitazioni) e mIR per analisi RNA.

miRNA possono avere come target anche fattori di trascrizione, in questo caso miRNA controlla direttamente tantissimi fattori (tutti quelli regolati da factor of trascrizione). Esistono analoghi circuiti feedback con miRNA inibisce fattore in trascrizione che ha permesso sua sintesi.

O Proteina FUS mutata (in SLA) è una RBP che regola processamento mRNA. FUS è proteina accessoria che aiuta microdissezione dosa RRM. Scusere mRNA mutazione FUS inibisce sintesi di miR.

miRNA-133b si trova all’interno di un gene e mina è elevata. Conferenza? Si lega a procrin impedendo riconoscimento miRNA. MiR lo HMR poco competente. Procrina ricostruita da Drosophila (nome in procrina). D’azione aumenta proliferazione (uniche cellule).

Molti microRNA coinvolti nell’insorgenza di tumori, in quanto regolano positivamente/negativamente soppressori di oncogeni, oncogeni. Insolito microRNA sono ne-regolanti il cancro (soprattutto quelli coinvolti nella proliferazione o differenziamento).

Nella leucemia promielocitica acuta (APL) staminale diventa precursore mieloide ma poi non riesce più a differenziarsi. Analisi NMR derivati precursore mieloide e di granulocita (indotto differenziamento in vitro a elevate dosi di acido retinoico). Trovati alcuni miRNA in particolare miR-223 e TALR miR guidano il differenziamento tramite analisi computazionale trovato NF1A come target e saggio di luciferasi mostra repressione NF1A indotta. MiR-223 aggiunto. miR-223 induce trascrizione di C/EBPα che ha siti target su NF1A come competizione con NF1A (che inibisce miR). Altri C/EBP pot. Trascrizione miR-223 con inibizione NF1A e differenziamento.

Se over-esprimo miR-223 in cellule leucemiche (con promotore indipendente da NF1A), acido retinoico e differenziamento in granulociti.