Appunti di Patologia clinica 2024, (2 moduli)

-DHPLC

-HRM

Queste consentono non solo di andar a effettuare degli screening di SNP, ma anche analisi epigenetiche dopo

trattamento con Bisulfito e Valutazione di Zigosità di un allele.

Tuttavia, non sono informativi sul tipo di mutazioni esatte, né definitive sulla natura delle mutazioni che

vengono individuate e pertanto una volta individuata una anomalia deve essere sempre eseguita l’analisi

precisa della sequenza nucleotidiche. Infatti, i test che possono caratterizzare con precisione la natura delle

mutazioni sono attualmente essenzialmente due: sequenziamento di Sanger e Sequenziamento massivo

parallelo

DHPLC: Denaturant High Perfomance Liquid Cromatography

(cromatografia liquida ad alte prestazioni eseguita in condizioni denaturanti)

La DHPLC è una tecnica sviluppata per la rivelazione di mutazioni/alterazioni di sequenza nel DNA.

Si basa sull’analisi di prodotti di PCR, tramite l’HPLC. Per tale tipo di analisi si usano delle colonne

particolari, con delle basi alchiliche che possono legare i duplex del DNA e si usano due fasi mobili.

Tale tecnica si basa quindi sulla differente velocità di migrazione, nella matrice della colonna per gli

omoduplex e per gli eteroduplex, ossia i frammenti di DNA appaiati perfettamente o contenenti

mismatch.

In genere la fase stazionaria è su base alchilica (es. octadecilsilano - C18), in grado di legare il DNA

e le fasi mobili sono due: una è costituita da acetonitrile (solvente organico) e da un agente

accoppiante come il TEAA (trietilammonio acetato) e l’altra costituita solo da TEAA. Infine, la

colonna cromatografica è inserita in un fornetto e controlla la temperatura costante: questo è

garantire che l’analisi venga svolta in condizioni denaturanti. In questo modo si ha

fondamentale per

una condizione differenziale dei prodotti di PCR in base alla presenza o meno di alterazione di

sequenza.

DHPLC WORKFLOW

un’amplificazione

In primo luogo, si fa di una

porzione di DNA che contiene la sequenza nella quale

si vuole valutare la presenza di mutazioni. In un’altra

provetta, si allestisce la stessa PCR utilizzando un

campione di riferimento wild-type. Si mescolano in

un'unica provetta i due amplificati in un'unica provetta.

Successivamente avviene la denaturazione: prima si

scalda la provetta a 95° e poi la si lascia a temperatura

ambiente. Le doppie eliche degli ampliconi del

campione di riferimento e del campione da testare si

denaturano, quindi si separano e quando si ri-naturano,

mescolandosi tra loro in modo tale da avere 3 tipi di

duplex:

-Omoduplex Wild type,

“mutante”

-Omoduplex

-Eteroduplex tra filamento wild e filamento del paziente.

Sarà proprio questa miscela che verrà iniettata nella colonna cromatografica.

Se il campione testato ha un’alterazione di sequenza rispetto al campione di riferimento, si

avranno dei

mismatch, quindi si avranno dei duplex/eteroduplex non perfettamente appaiati lungo tutta la

sequenza.

A questo punto, si caricano i duplex sulla DHPLC e il tempo di eluizione sarà dato dalla funzione

della sequenza di ciascun duplex. Gli eteroduplex hanno un legame meno stabile con il supporto

della colonna ed eluiscono più velocemente, gli omoduplex eluiscono più tardivamente perché

hanno un legame più forte con il supporto alchilico della colonna.

l’assorbanza

Gli eluati vengono poi rilevati da un detector, si misura (200 nm) dei prodotti eluiti (si

valuteranno i picchi ottenuti nel cromatogramma): se la sequenza è wild-type, sarà presente solo

l’omoduplex, corrispondente all’eteroduplex.

se la sequenza è mutante, comparirà un picco

Se si noteranno delle mutazioni, si potranno poi condurre ulteriori indagini aggiuntive.

Durante la cromatografia la temperatura data dal fornetto non è sempre uguale ma si deve

determinare: è detta temperatura di ‘quasi denaturazione’. Infine, è importante sottolineare che, la

“quasi denaturazione”

temperatura di deve essere determinata sperimentalmente per ciascun

amplicone: gli eteroduplex hanno tempi di ritenzione minori rispetto omoduplex se separati ad una

temperatura in cui gli omoduplex non sono denaturati e gli eteroduplex lo sono parzialmente. A

questa temperatura, i filamenti che sono non

perfettamente appaiati (Eteroduplex) risulteranno

instabili e avranno un tempo di eluizione diverso dagli

omoduplex proprio per questo.

Questa tecnica si può realizzare anche con tanti

pazienti contemporaneamente. Se tutti sono wild type,

determino il genotipo wild type per tanti pazienti

contemporaneamente (1 solo picco), ma se almeno 1 ha

alterazione di sequenze, genererà un picco aggiuntivo,

quindi dovrò riprendere il DNA dei paziente e farli

separatamente per determinare quali tra quei campioni

mostra la sequenza alterata.

HRM: High Resolution Melting

La HRM è una tecnica recente per l’individuazione preliminare delle mutazioni che viene svolta

mediante Real time PCR. Si basa sulla diversa temperatura di melting che caratterizza sequenze

diverse e sulle capacità di alcuni coloranti fluorescenti (intercalanti) di marcare SOLO il DNA a

“saturanti” di nuova generazione come, ad

doppio filamento (Sybr green I o coloranti esempio, LC

Green o EVA Green).

Vantaggi: Questa tecnica è semplice, infatti non prevede strumentazioni sofisticate, si effettua in

maniera rapida, consentendo allo stesso tempo una accuratezza dei risultati, e di genotipizzare i

campioni in parallelo.

I coloranti si legano specificamente al DNA a doppia elica e quando sono legati emettono

fluorescenza. Quindi, se il DNA è a singolo filamento, i fluorofori non saranno in grado di legarvisi.

In assenza di DNA, non emettono fluorescenza. Per risultati accurati e ripetibili, le condizioni di

PCR devono essere ottimizzate per garantire una amplificazione con un'elevata specificità e un

bias minimo tra le varianti di sequenza. Dopo la PCR, la curva di melting (TMelting), parte da 50°-

55° viene in genere eseguita su un ampio intervallo di temperature in piccoli incrementi (~ 0,3 ° C)

l’equilibrio

che sono abbastanza lunghi (~ 10 secondi) affinché il DNA raggiunga ad ogni passaggio

di temperatura. Ad ogni ciclo di PCR, il campione si denatura e la fluorescenza emessa e rilevata

dallo strumento cala piano, fino ad arrivare a 0 (ovvero quando il campione è completamente

denaturato).

È oltremodo bene ricordare che la TMelting è un parametro altamente dipendente dalla sequenza di

→

DNA che si sta valutando questo implica che anche solo la minima variazione di un nucleotide, fa

si che vi sia un cambiamento della TMelting, fattore che quindi viene sfruttato in questa tecnica.

All’inizio c’è

dell'analisi HRM un alto livello di

fluorescenza nel campione a causa dei miliardi di copie

dell'amplicone. Ma quando il campione viene riscaldato e i

due filamenti del DNA si denaturano, la presenza di DNA a

doppia elica diminuisce e quindi la fluorescenza si riduce.

La macchina HRM ha una telecamera che osserva questo

processo misurando la fluorescenza. Quindi traccia

semplicemente questi dati come un grafico noto come curva

di melting, che mostra il livello di fluorescenza rispetto alla temperatura.

‐ Se il campione è wild-type, la curva di Melting parte da 100 perchè il DNA è totalmente

appaiato, fino ad arrivare a 0 con una curva sigmoide, in corrispondenza della sua TMelting.

‐ Se il campione è mutante (una base della sequenza sostituita con una diversa coppia di basi),

la curva di Melting è diversa perché la sequenza nucleotidica è diversa, permettendo la

discriminazione.

Questa tecnica si presta anche ad

evidenziare mutanti in eterozigosi. Le

varianti alleliche omozigoti possono

essere caratterizzate da uno

spostamento della temperatura sulla

curva di melting. In confronto, gli

eterozigoti sono caratterizzati da

cambiamenti nella forma della

curva di melting (non è una sigmoide

perfetta e tipicamente avrà una gobba

nella curva che la rende

assolutamente caratteristica). Ciò è dell’annealing

dovuto al mismatch delle coppie di basi generato a seguito dell'eteroduplex di

filamenti wild-type e mutanti. l’utilizzo

Un altro aspetto da sottolineare è che posso scegliere il fluoroforo da utilizzare. Durante di

questa tecnica per aumentarne la specificità, è consigliato utilizzare fluorofori saturanti, cioè

l’intercalante si lega al DNA in tutti i siti disponibili, così da non avere più modo di riattaccarsi

dopo denaturazione. I Syber green sono fluorofori non saturanti e si legano al DNA a doppio

filamento ma non sono in grado di saturare tutti i siti di legame disponibili. Quindi, quando il DNA

comincia a denaturarsi anche in maniera parziale, il SYBR green si stacca, ma si riattacca in altri siti

liberi, quindi la quantità di fluorescenza non sarà diversa dalla quantità di fluorescenza iniziale.

EVA Green è invece un fluoroforo saturante. È importante l’utilizzo di fluorofori saturanti: quando

si ha il calo della fluorescenza indica che è avvenuta una parziale denaturazione e corrisponde alla

minor presenza di duplex all’interno del campione. Il Syber green, non satura tutti i siti di legame e

quindi, pur avendo una parziale denaturazione del campione, a questa potrebbe non corrispondere un

calo della fluorescenza.

Utilizzo di HRM e DHPLC

• Analisi di SNP

• Analisi epigenetiche, in particolare per la ricerca di siti metilati (dopo trattamento con bisulfito,

ovvero un composto che è in grado di modificare una citosina metilata in uracile. Quindi, è in grado

di trasformare una sequenza di DNA con una metilazione, in una sequenza diversa, che può essere

facilmente identificata.)

• Valutazione di zigosità di un allele

Tutti questi test, tuttavia, non danno informazioni né esatte né definitive sulla natura delle mutazioni

che vengono individuate e pertanto una volta individuata un’anomalia deve essere sempre eseguita

una successiva analisi precisa della sequenza nucleotidica. I test che possono caratterizzare con

precisione la natura delle mutazioni sono attualmente essenzialmente:

• il sequenziamento del DNA secondo Sanger

• il sequenziamento massivo parallelo

Patologia Clinica Mod. 2

Lezione 6 - 2024

Prof.ssa Marianna Penzo

5- test genetici indiretti

Test genetici (parte tre): approcci molecolari indiretti

Cosa sono i test indiretti? Sono tutti quegli approcci molecolari che di fatto non vanno a ricercare la

presenza di una certa mutazione a carico di un gene conosciuto perché causa una cert