Appunti di Microbiologia

Università degli studi di Pisa

Corso di laurea in scienze infermieristiche A.A. 2017/2018

Polo didattico di Lucca – Santa Maria a Colle

Appunti di microbiologia e microbiologia clinica

(Prof.ssa Giulia Freer)

Introduzione allo studio della microbiologia

La microbiologia è la scienza che studia i microrganismi, esseri viventi di piccole dimensioni non osservabili ad occhio nudo. Dei microrganismi fanno parte i batteri, i funghi microscopici, i protozoi, le alghe microscopiche e le entità non cellulari come virus e prioni.

La teoria della generazione spontanea della vita dalla materia non vivente risale ad Aristotele (350 a.C.), e rimase indiscutibile per più di duemila anni; tale teoria fu un freno allo sviluppo della microbiologia fino al 1600, grazie agli studi di Francesco Redi e all’invenzione del primo microscopio. Francesco Redi tentò di studiare il fenomeno della comparsa di larve di mosca sulla carne marcia; Redi pose della carne avariata in una serie di recipienti, alcuni chiusi, altri aperti, e dimostrò che le larve nascevano solo dove le mosche avevano potuto depositare le uova. L’intuizione di Francesco Redi, ovvero che le larve non generassero direttamente dalla carne marcia, mise in discussione per la prima volta la teoria della generazione spontanea.

Il primo microscopio ad immersione, realizzato da Antoni Van Leeuwenhoek, un commerciante di stoffe, permise l’osservazione dei globuli rossi e la scoperta dei vasi capillari e degli “animaletti”, piccolissimi esseri viventi (i batteri) rilevati in una serie di osservazioni sperimentali condotte sui liquidi più diversi.

L'età d'oro della microbiologia

Tuttavia, gli studi che diedero vita all’età d’oro della microbiologia furono quelli di Louis Pasteur a metà dell’Ottocento. Pasteur dimostra definitivamente sbagliata la teoria della generazione spontanea (effettuando esperimenti su brodo bollito con un contenitore con collo di cigno), identifica gli agenti responsabili della fermentazione (lieviti) e della decomposizione (batteri) dei cibi, e sviluppa la tecnica della pastorizzazione. Inoltre, porta alcune prove a sostegno dell’origine microbica delle malattie infettive, formulando la teoria del germe: “Le malattie infettive originano dai germi. Così come il mosto fermenta o marcisce a causa di batteri, anche le nostre ferite si sanano o vanno in necrosi a causa di batteri”.

Parallelamente alle scoperte di Pasteur, Edward Jenner (1749-1823), un medico britannico, inizia i suoi studi sulla vaccinazione. Jenner verificò che le mungitrici non contraevano il vaiolo umano, ma il vaiolo vaccino, medinate il contatto con le mammelle della mucca. L’agente eziologico del vaiolo vaccino fungeva da vaccino contro il vaiolo umano. Jenner vaccinò un bambino con vaiolo vaccino, per poi inoculare in esso materiale derivante da pustole infette umane, osservando che non contraeva la malattia. Le scoperte di Jenner diedero il via allo studio e alla somministrazione dei vaccini, che già dalla fine dell’Ottocento venivano somministrati per contrastare rabbia, peste e vaiolo.

Teorie e scoperte microbiologiche

Tutte le teorie di Louis Pasteur furono confermate, alla fine dell’Ottocento, da Robert Koch, il medico che definì la relazione diretta tra uno specifico microrganismo e una determinata malattia attraverso una serie di fasi sperimentali note come “postulati di Koch”.

Secondo i postulati di Koch il microrganismo sospetto deve trovarsi in tutti i casi di malattia ed essere assente in animali sani (osservazione microscopica) e deve essere isolato e poter crescere in coltura pura (coltivazione in vitro); il microrganismo isolato e coltivato deve indurre la stessa malattia in animali sani (esperimento in vivo) e infine, deve poter essere nuovamente isolato dalla nuova vittima e se ne deve poter dimostrare l’identità con l’originale (isolamento colturale in vivo). Grazie a queste fasi sperimentali, Koch isolò per la prima volta l’agente eziologico del carbonchio e della tubercolosi.

Scoperta di molecole antimicrobiche

Una volta stabilita la relazione tra microrganismi e malattie, la ricerca si è rivolta alla scoperta e alla sintesi di molecole, antibiotici e chemioterapici antimicrobici in grado di contrastare la moltiplicazione microbica senza danneggiare l’ospite.

Paul Ehrlich (1854-1915) fu un microbiologo tedesco, fondatore della chemioterapia, cioè della terapia mediante particolari composti chimici (i chemioterapici) in grado di agire specificamente contro microbi apportatori di malattie infettive. Viene detto chemioterapico un farmaco antibatterico prodotto per sintesi, mentre è chiamato antibiotico un farmaco antibatterico presente in natura.

Ehrlich sviluppò, all’inizio del Novecento, l’idea del proiettile magico, una sostanza in grado di colpire parassiti e tossine esterne all’organismo senza danneggiare o danneggiando solo minimamente le strutture dell’ospite. I suoi studi si focalizzarono principalmente sui coloranti chimici: mediante l'iniezione di tinture, infatti, è possibile osservare come il colore si distribuisca a livello sia macroscopico che microscopico, a seconda della sua composizione, e dunque quali zone cellulari e tissutali rispondano specificamente al contatto con la tintura; in altre parole, in quali zone del corpo le tinture diano reazioni con le sostanze cellulari, suscitandone la colorazione. In definitiva, ciò che colorava i batteri ma non il tessuto circostante poteva essere impiegato per curare la malattia causata dal batterio stesso. Attraverso la sperimentazione è stato possibile dunque distinguere tra coloranti che agissero come proiettili magici massimamente contro parassiti e tossine esterne, danneggiando quanto meno possibile gli organi. Ehrlich scoprì che il composto 606, a cui fu dato in seguito il nome di "Salvarsan" (un arsenobenzolo), era efficace contro il Treponema pallidum, agente della sifilide. Il Salvarsan fu il primo agente chemioterapico conosciuto.

Per proiettile magico si intende, anche oggi, un farmaco specifico contro i batteri che non agisce sulle cellule umane, colpendo strutture presenti esclusivamente nei procarioti, come ad esempio la parete batterica.

Scoperte di Sir Alexander Fleming

Sir Alexander Fleming (1881-1955) è stato un medico e biologo britannico, universalmente noto per avere scoperto l'enzima lisozima nel 1922 e la penicillina nel 1928, risultato che gli valse il premio Nobel per la medicina nel 1945.

Alexander Fleming nel 1928, con grande fortuna, si imbatté in una capsula di Petri particolare: era macchiata di muffa come tante altre nel suo laboratorio, ma attorno a essa le colonie batteriche di stafilococchi si erano dissolte. L'efficacia del fungo fu provata su vari tipi di batteri e i risultati furono più che soddisfacenti sia per range di efficacia (distruggeva gli streptococchi, gli stafilococchi, i bacilli della difterite e del carbonchio, ma era inefficace sui batteri del tifo) sia per forza (avevano effetto soluzioni diluite fino a 1/500). La muffa miracolosa fu identificata come Penicillium notatum; da qui il nome penicillina. Nonostante lo straordinario potere di antibiosi della penicillina, essa presentava un grande problema: era difficile da produrre e, se vi si riusciva, le quantità erano scarse. Con l'avvento dei sulfamidici, la penicillina venne “messa da parte”: avrebbe avuto la sua rivalsa solo qualche anno più tardi, grazie agli studi di alcuni ricercatori di Oxford.

Gerhard Domagk e la chemioterapia antibatterica

Gerhard Domagk (1895-1964) è stato un biochimico e medico tedesco, fondatore della chemioterapia antibatterica mediante sulfamidici, che gli valse il Premio Nobel per la Medicina nel 1939.

Nel 1932, continuando le ricerche avviate da Paul Ehrlich, Domagk scoprì che un colorante, il Prontosil rosso (o sulfocrisoidina), era dotato di proprietà antibatteriche, ossia in grado di distruggere microbi infettivi, in particolare gli streptococchi. Successivamente, Federico Nitti, medico e farmacologo italiano, precisò che l'azione antibiotica proveniva dalla sulfanilamide contenuta nel Prontosil. La scoperta di Domagk concentrò l’attenzione su una classe di chemioterapici detti sulfamidici, in grado di combattere e guarire una estesa varietà di infezioni, e aprì la via alla loro produzione.

Successivamente ai sulfamidici, fu la volta della streptomicina. La streptomicina, il primo antibiotico che si riscontrò essere efficace contro la TBC, fu isolata per la prima volta nel 1943, da Albert Schatz, nel laboratorio di Selman Abraham Waksman alla Rutgers University.

Classificazione dei microrganismi e loro osservazioni

I microrganismi patogeni possono essere classificati in acellulati e cellulati. Del primo gruppo fanno parte esclusivamente i virus, mentre il secondo gruppo comprende i procarioti e gli eucarioti. Del gruppo dei procarioti fanno parte i batteri, mentre sono eucarioti i funghi e i protozoi.

L’osservazione dei microrganismi avviene mediante microscopio ottico, con un potere di risoluzione di 0,2 um, e microscopio elettronico, con un potere di risoluzione di circa 0,5 nm. Per mettere in evidenza la morfologia dei microrganismi si possono utilizzare colorazioni semplici e differenziali. Le colorazioni semplici comportano l’utilizzo di un solo colorante in soluzione alcolica o acquosa, mentre le colorazioni differenziali prevedono l’impiego di due coloranti, utilizzati in tempi successive. Le colorazioni differenziali maggiormente utilizzate in ambito batteriologico sono la colorazione di Gram e la colorazione di Ziehl-Neelsen.

La colorazione di Gram

La colorazione di Gram consente la classificazione dei batteri in due grandi gruppi: Gram-positivi e Gram-negativi. I Gram-positivi, che trattengono il colorante violetto di Genziana, o cristalvioletto, presentano una parete batterica più spessa e l’assenza di membrana esterna, mentre i Gram-negativi, che non trattengono il cristalvioletto e si decolorano, possiedono una parete batterica sottile e una membrana esterna di lipopolisaccaride.

Per effettuare la colorazione di Gram si strisciano i batteri su un vetrino e si fissano al calore; si ricopre poi il preparato con cristal-violetto, e si lascia agire per due minuti. Si elimina l’eccesso di colorante risciacquando con acqua e si ricopre il preparato di liquido di Lugol, che funge da mordenzante (fissaggio del colore), lasciando agire per un minuto. Si fa scivolare l’eccesso di Lugol dal vetrino e si decolora il preparato con etanolo: la parte esterna dei Gram-, costituita dalla membrana esterna di lipopolisaccaride e legata al colorante, verrà solvatata dall’etanolo, lasciando lo strato di peptidoglicano sottostante (parete batterica). La parete dei Gram+, invece, formata da uno spesso strato di peptidoglicano, non verrà solvatata e rimarrà legata al cristal-violetto. Infine si effettua una colorazione di contrasto con safranina per un minuto. La safranina colora in rosa le componenti acide rimaste libere dei Gram-, mentre non può legarsi ai componenti molecolari dei Gram+, impegnati nel legame con violetto di Genziana. Sciacquare infine il vetrino e farlo asciugare all’aria o mediante becco Bunsen.

La colorazione di Ziehl-Neelsen

La colorazione di Ziehl-Neelsen è un esame di laboratorio che consente di riconoscere la presenza dei micobatteri in un campione sfruttando la caratteristica alcool-acidoresistenza di tali microrganismi. I micobatteri, per la particolare struttura e composizione della parete cellulare, hanno la capacità di trattenere la colorazione della fucsina basica di Ziehl anche quando trattati con decoloranti come l'alcool o gli acidi minerali.

Per effettuare la colorazione di Ziehl-Neelsen si striscia il campione in esame su un vetrino e si fissa al calore. Si applica poi una colorazione mediante gocce di carbofucsina e si flamba il vetrino. Si risciacqua poi il vetrino e si decolora con una soluzione alcool-acido per circa due minuti, fino alla sparizione del colorante. Si esegue poi la colorazione di contrasto mediante blu di metilene per circa due minuti e si risciacqua, facendo poi asciugare il preparato. I micobatteri, essendo alcool-acidoresistenti, trattengono la fucsina e appaiono colorati in rosso su uno sfondo blu pallido, dato dal blu di metilene. La presenza di eventuali altri batteri, non resistenti alla decolorazione, è evidenziata dall’assunzione marcata del blu di metilene, con classico colore blu scuro.

La struttura dei batteri

I batteri sono cellule procariote, organismi semplici, unicellulari e di piccole dimensioni. Analizzandone la struttura si possono riconoscere alcuni componenti fondamentali presenti in tutti i batteri e necessari alla loro sopravvivenza.

Il citoplasma rappresenta il materiale racchiuso all’interno della membrana citoplasmatica. È costituito all'80% da acqua e contiene proteine, carboidrati, lipidi, ioni organici. Le strutture principali del citoplasma sono la zona nucleare, detta nucleoide, dove è localizzato il DNA, i ribosomi, e i depositi di riserve detti inclusioni. Il nucleoide è composto da un’unica molecola di DNA circolare a doppio filamento, che costituisce il cromosoma batterico. Oltre al cromosoma, sono presenti piccole molecole di DNA circolare a doppio filamento dette plasmidi, che si replicano indipendentemente dal DNA cromosomico e che veicolano geni che codificano per particolari tossine, enzimi o fattori di resistenza alle sostanze antimicrobiche. I plasmidi rappresentano un veicolo di informazioni genetiche, in quanto possono essere trasferiti da una cellula all’altra. I ribosomi hanno un coefficiente di sedimentazione diverso da quello degli eucarioti, pari a 70 Svedberg, ma sono formati anch’essi da due subunità. La differenza strutturale tra i ribosomi procariotici ed eucariotici è alla base dell’azione selettiva di alcuni antibiotici, poiché ci consente di inibire la sintesi proteica batterica senza portare danno alle cellule eucariotiche circostanti. Le inclusioni citoplasmatiche rappresentano depositi di riserva contenenti accumuli di nutrienti. Sono granuli presenti in molte specie batteriche, ma alcuni di essi sono caratteristici di poche specie, e ne consentono dunque l’identificazione (è il caso dei granuli metacromatici e polisaccaridici, evidenziabili con specifici coloranti).

La membrana citoplasmatica, o plasmalemma, è composta da un doppio strato fosfolipidico e proteine ed è priva di steroli. Costituisce una barriera selettiva che permette il passaggio, per diffusione passiva, di acqua e piccole molecole idrofobiche, e per diffusione attiva di molecole di maggiori dimensioni. Nei procarioti, il plasmalemma è responsabile della produzione di ATP, essendo sede di citocromi e di generazione e accumulo della forza protone motrice. Svolge inoltre un ruolo fondamentale nella fase di replicazione, intervenendo nel processo di segregazione dei cromosomi e alla formazione del setto divisorio tra le cellule figlie (invaginazione dei mesosomi). A livello della membrana sono presenti enzimi quali la carbossipeptidasi e la transpeptidasi deputati alla sintesi e all’assemblaggio della parete cellulare.

La parete cellulare o batterica è situata all’esterno del plasmalemma ed è responsabile della forma e della rigidità dei batteri. La funzione principale della parete batterica è quella di evitare la lisi del batterio quando la pressione osmotica del citoplasma è maggiore rispetto a quella dell’ambiente esterno, condizione provocata da ipotonicità e che comporta un eccessivo ingresso di acqua. La parete batterica è formata da un polimero macromolecolare chiamato peptidoglicano. Esso è composto da una porzione glicanica, costituita da una ripetizione di N-acetilglucosamina (NAG) e di acido N-acetilmuramico (NAM) a formare lunghe catene (catene del glicano), e da una porzione peptidica, deputata alla formazione di legami crociati tra le catene del glicano, fondamentali per fornire rigidità alla parete stessa. La porzione peptidica è formata da tetrapeptidi legati all’acido N-acetilmuramico, che si intersecano tra le catene e si legano tra loro, mediante legami crociati.

In base alle differenze strutturali della parete batterica, evidenziabili mediante colorazione di Gram, i batteri si classificano in Gram-positivi e Gram-negativi. La parete batterica dei batteri Gram-positivi è formata da numerosi strati di peptidoglicano (mureina) che formano una struttura spessa e rigida. In essa troviamo acidi teicoici e lipoteicoici; i primi, carichi negativamente, protrudono verso l’esterno e sono i principali antigeni di superficie, mentre i secondi, attraversando lo strato di peptidoglicano, lo ancorano alla membrana citoplasmatica. La parete batterica dei Gram-negativi è caratterizzata da uno o pochi strati di mureina, circondati esternamente da un’ulteriore membrana, chiamata membrana esterna. Per la sua struttura la parete batterica è detta anche sacculo.

La membrana esterna è una membrana asimmetrica, formata internamente da fosfolipidi ed esternamente da un complesso lipidico-polisaccaridico, detto lipopolisaccaride (LPS) o endotossina. Tale membrana è legata alla parete batterica sottostante mediante lipoproteine. Il lipopolisaccaride è responsabile dell’alta tossicità della membrana esterna e la sua struttura è comune a tutti i batteri Gram-negativi. Il lipopolissaccaride è formato dal lipide A, composto da acidi grassi a lunga catena legati ad un disaccaride, da un core, costituito da zuccheri a sette atomi di carbonio, e da una porzione polisaccaridica, chiamata antigene O, rivolta verso l’esterno, che rappresenta il principale antigene di superficie dei batteri Gram-negativi. La tossicità della membrana esterna è data in particolare dal lipide A, un’endotossina che viene rilasciata esclusivamente a seguito di lisi batterica. La lisi del batterio Gram-negativo porta al disassemblamento del lipopolisaccaride, che legandosi alla LPS binding protein, è presentato a recettori di riconoscimento propri dei macrofagi CD14.