Appunti di Genetica forense

Scienze forensi

Le scienze forensi sono discipline basate su metodi scientifici che hanno la funzione di aiutare i giudici e le giurie nel prendere delle decisioni per risolvere questioni legali, siano esse legate a crimini o controversie civili. Oltre alla genetica forense, si parla anche di:

• Balistica forense: fisica meccanica che studia il moto del proiettile.
• Audio analisi forense.
• Informatica forense.
• Antropologia forense: studio dei resti umani.
• Chimica merceologica forense: studio della natura, proprietà, qualità, provenienza e conservazione di qualsiasi tipo di merce commerciale.
• Entomologia forense: studia gli insetti che colonizzano il cadavere dopo la morte.
• Botanica forense: studia piante e pollini su soggetti connessi a reati.

L'importanza della genetica forense

L'importanza della genetica forense si è notevolmente accresciuta negli ultimi anni, grazie all'evoluzione delle conoscenze sul genoma umano e delle tecnologie analitiche. La scoperta del DNA in una scena del crimine è la prova regina, l'unica prova identificativa di un individuo nella scena (anche con l'antropologia forense la persona può essere identificata, ma bisogna avere un calco dentale da confrontare).

La genetica forense viene quindi applicata per l'identificazione personale: è possibile ottenere da una traccia di materiale biologico (sangue, saliva, pelle, frammenti di ossa, capelli, …) un profilo genetico proprio di un individuo. Il profilo ottenuto andrà quindi confrontato con quello di sospettati (che hanno commesso il crimine); per identificare vittime di calamità di massa partendo dal DNA delle famiglie dei desaparecidos o analizzando i resti umani; definizione di profili ignoti che hanno compiuto omicidi/stupri seriali; scagionare persone che sono accusate erroneamente.

La genetica forense permette anche di compiere test di paternità/maternità o di parentela in generale. La genetica forense viene anche applicata nella medicina veterinaria per l'identificazione di DNA appartenente a specie a rischio di estinzione in crimini legati al loro contrabbando o abuso.

Applicazioni future della genetica forense

La genetica forense è in continua evoluzione, infatti, le applicazioni future consistono in:

• Predire la popolazione di origine di un DNA: si sequenziano genomi e si compiono studi di popolazione usando specifici marcatori comunemente presenti in etnie specifiche. Si estraggono gli SNP più significativi e si crea un algoritmo al contrario che identifica l'origine dell'individuo a partire dal suo DNA. Essendo tecniche nuove e non validate, esse non sempre possono essere usate come prove in un processo; il risultato non sempre può essere correlato al fenotipo dell'individuo.
• Ottenere informazioni su caratteristiche antropometriche di chi ha depositato la traccia biologica: il DNA quindi permette di predire delle caratteristiche fisiche della persona, creando quindi un identikit genetico, come colore occhi, capelli, corporatura e, in generale, tutti quei caratteri, anche multifattoriali, che hanno una ridotta componente ambientale e principalmente genetica (forma del viso, degli occhi, presenza di lentiggini e fossette e pure l'età biologica, questo in base alla metilazione età-dipendente di alcuni loci).

Storia della genetica forense e variabilità genetica

Le scienze forensi sono discipline estremamente recenti: fino agli inizi del 900 erano materia trattata solo da studiosi, ma non venivano integrate nelle analisi di polizia perché non validate e standardizzate dalle autorità di tutti i paesi. Le prime tecniche forensi sviluppate appartengono a dei chimici, in passato le uccisioni avvenivano per avvelenamento e non potevano essere riconosciute.

Nel 1880 sono state sviluppate le prime tecniche che si basavano sul matching delle impronte digitali, mentre le prime tecniche di balistica forense nascono nel 1835. Il padre delle scienze forensi è Edmond Locard, nel 1910 fonda il primo laboratorio di medicina legale che funziona come il primo laboratorio RIS; il principio di scambio suo afferma che "ogni criminale lascia una traccia di sé sulla scena del crimine e porta via su di sé una traccia".

La genetica forense non era molto sviluppata; la struttura del DNA è stata scoperta verso la metà del '900, ma c'erano comunque già alcuni elementi che permettevano di capire come nel patrimonio genetico ci fossero degli elementi di diversità interindividuale. Il primo elemento era, ad esempio, il sistema dei gruppi sanguigni (AB0):

Il sistema degli antigeni gruppo-ematici è stato scoperto agli inizi del '900. La scoperta degli antigeni AB0 pose le basi immunologiche per la comprensione delle reazioni trasfunzionali. Tutti i mammiferi presentano sulla membrana plasmatica dei globuli rossi l'antigene 0, un glicano (galattosio, N-acetilglucosamina e galattosio). Questa struttura viene modificata da delle glicosiltransferasi che aggiungono residui glucidici per formare i diversi antigeni. Gli individui del gruppo 0 sono sprovvisti di tale enzima.

L'analisi del sistema del gruppo sanguigno era utile per discriminare gli individui e valutare anche la compatibilità della paternità, ad esempio; poteva essere usato come marcatore. Il locus AB0 è dato da tre alleli: A, B e 0. I genotipi possibili sono 6, posso ottenere il valore attraverso la formula (n(n-1))/2 dove n è il numero di alleli. I fenotipi possibili invece sono 4, al numero di genotipi non corrispondono i fenotipi. Nella popolazione europea la distribuzione dei vari alleli è molto disomogenea:

• A: 40%
• B: 10-15%
• AB: 5%
• 0: 40%

Caratteristiche del DNA come marcatore genetico

In generale, un marcatore genetico deve essere facile da genotipizzare, altamente variabile e facile da identificare da un punto di vista di dominanza, si è quindi capito che bisognava passare dall'analisi dei polimorfismi proteici ai polimorfismi del DNA, questo perché:

• Il DNA è personale di ogni individuo ed è presente in ogni cellula; questo dogma viene accettato in maniera cellulare, ma esistono cellule prive di DNA e cellule con DNA mutato, mutazioni somatiche che discriminano due linee cellulari differenti.
• Il profilo del DNA rimane uguale per tutta la vita; anche questo dogma viene accettato in generale, ma possono esserci mutazioni che fanno variare il profilo del DNA dell'individuo nel corso del tempo.
• Il profilo del DNA è unico per ogni individuo, eccezione fatta per i gemelli monozigoti, che hanno un profilo identico.

Variabilità genetica umana

Il genoma nucleare è dato da 3200 Mbasi suddivise in 22 cromosomi e due cromosomi sessuali. Ciascuno di noi è geneticamente differente da ogni uomo comparso sulla terra per crossing over, assortimento indipendente dei cromosomi e formazione di mutazioni. L'eccezione sono i gemelli monozigoti, ma si differenziano per diverse modificazioni epigenetiche e per la formazione di mutazioni somatiche.

Bisognerebbe quindi andare a valutare anche le mutazioni somatiche dei due gemelli per poterli distinguere; tale analisi non va compiuta nel pool di marcatori forensi, ma bisognerebbe compiere l'analisi dell'esoma completo. In presenza di gemelli monozigoti l'analisi genetica non è valida in ambito forense. Una delle differenze tra due gemelli monozigoti è data dalle impronte digitali; sono un carattere multifattoriale la cui componente ambientale è data da come il feto abbia toccato la parete uterina, che quindi modifica le creste dei polpastrelli.

In generale, la sequenza del genoma di due individui presi a caso nella popolazione è identica al 99.9%; bisogna identificare i punti di diversità che compongono lo 0.01% della diversità:

• Polimorfismi di singolo nucleotide (SNPs).
• Copy Numbers Variations (CNV): ripetizioni in tandem di sequenze di dimensioni maggiori di 1 kb, spesso osservate a frequenze polimorfiche nelle popolazioni.
• Sequenze ripetute intersperse: SINEs, LINEs, LTR, trasposoni a DNA, elementi trasponibili che si posizionano con ordine differente di persona in persona, possono quindi definire pattern di diversità tra i soggetti.
• Sequenze ripetute in tandem: DNA satellite nei centromeri dei cromosomi. Ha delle ripetizioni variabili tra le 5 pb e le 170 pb. DNA minisatellite: si parla di DNA telomerico e DNA ipervariabile. Il DNA telomerico è costituito da 10-15 kb di unità esanucleotidiche ripetute in tandem, che vengono aggiunte dalla telomerasi. È anch'esso polimorfo e dipende dall'attività della polimerasi e del tipo di cellula che analizziamo; la lunghezza del telomero è influenzata da età, stato di salute della persona e tipo di cellula che viene analizzata.
• DNA ipervariabile è dato da schieramenti di corte unità ripetute in tandem localizzate nelle regioni subtelomeriche. Hanno dimensioni molto variabili, ma mantengono sempre un core centrale costante. Agiscono come punti caldi di ricombinazione omologa.
• DNA microsatellite: piccoli schieramenti di ripetizioni in tandem (10-20 moduli ripetuti di 1-4 nucleotidi). Si trovano lungo tutto il genoma, spesso sono ripetizioni dinucleotidiche di CA.

Analisi della variabilità

Il pioniere della genetica forense moderna è Alec Jeffrey, ha scoperto come discriminare i diversi individui. Stava studiando la mioglobina, uno dei primi geni umani ad essere identificati. Aveva scoperto che nell'introne del gene di diversi soggetti c'erano sequenze ripetute di lunghezze diverse; voleva capire se c'era associazione tra la gravità della malattia e la lunghezza della ripetizione. Compie analisi elettroforetica su gel e ottiene un pattern di bande; aveva caricato un trios familiare e poi DNA diversi di animali e piante. Ripetendo più volte il test si rende conto che il pattern rimane sempre identico, inoltre nel trio familiare si rende conto che il pattern del figlio è dato da elementi dei pattern dei genitori; il pattern aveva segregazione mendeliana. DNA minisatellite ipervariabile: casualmente, quindi, aveva sequenziato il numero di ripetizioni, che è altamente variabile nei diversi individui, ma è costante in ogni profilo individuale e segue un pattern di ereditarietà mendeliana. I risultati di Jeffrey erano caratterizzati da un grandissimo numero di bande per ogni individuo analizzato; ciò può essere spiegato dal fatto che, in maniera inconsapevole, era stata usata come sonda la sequenza core costante del minisatellite, di conseguenza, è riuscito a visualizzare tutte i minisatellite ipervariabili che presentavano lo stesso core costante; è il processo alla DNA fingerprinting con sonda multilocus RFLP VNTR base del quale una sonda interagisce con più marcatori.

La RFLP permette di ottenere specifici frammenti dati dalla presenza del sito di restrizione, ma, dato il microsatellite ipervariabile, ci saranno frammenti più o meno lunghi a seconda del numero di ripetizioni presenti in quella regione; per questo motivo ottengo tante bande di dimensioni diverse. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) indica che, a causa del numero variabile di ripetizioni, vengono creati dal taglio con un enzima di restrizione, frammenti di DNA di diverse dimensioni.

Southern Blot

Alla fine la tecnica che aveva utilizzato era quella del Southern Blot:

• Il DNA viene estratto e frammentato usando enzimi di restrizione (per avere tagli precisi ed ottenere frammenti di lunghezza specifici).
• I frammenti tagliati vengono denaturati (con un buffer fortemente alcalino) e fatti correre su gel di agarosio, poi si compie il trasferimento (blotting) su membrana di nitrocellulosa per capillarità; le bande di DNA si fissano e diventano facilmente gestibili. Questo procedimento permette di ottenere una copia del gel su una membrana immobilizzante, evitando la diffusione delle molecole e permettendo una rivelazione più rapida e comoda rispetto al gel.
• I siti della membrana devono essere saturati usando DNA esogeno (fase di pre-ibridazione), si compiono lavaggi ed infine si può compiere l'ibridazione con una sonda a ssDNA; il filtro è posto in una soluzione contenente la sonda marcata (DNA) e complementare al frammento da identificare. Se la sonda è a doppio filamento essa deve essere denaturata. L'interazione tra sonda e filamento complementare porterà alla formazione di legami idrogeno che permettono la formazione di una doppia elica. Si compiono nuovamente dei lavaggi per eliminare i riconoscimenti aspecifici tra sonda e membrana. Per aumentare la specificità del legame si lavora in specifiche condizioni di temperatura (alta temperatura) e concentrazione salina (abbasso la concentrazione salina per impedire la stabilizzazione dei legami aspecifici); c'è bisogno di maggiore stringenza per far sì che le sonde si leghino solo alle mie sequenze di interesse.
• A questo punto bisogna visualizzare i frammenti di DNA ibridati alle sonde e, per fare ciò, si possono usare due tecniche:
  • Autoradiografia: esposizione ad una lastra per raggi X se la sonda è radioattiva.
  • Reazione colorimetrica o chemiluminescente se la sonda non è radioattiva.

Il DNA fingerprinting multilocus RFLP viene utilizzato sia per identificare tracce di sangue nella vittima sui vestiti di un sospettato (e viceversa), ma anche per fare un test di paternità.

Applicazione del DNA fingerprinting

Prima applicazione del DNA fingerprinting

Il primo esempio di applicazione della genetica forense riguardava la soluzione di un caso civile: "Ghana immigration case". In Inghilterra c'era una grandissima affluenza di immigrati dall'Africa con la scusa che fossero parenti stretti; bisognava controllare se queste persone erano effettivamente imparentate o meno. Viene quindi compiuto un Southern Blot con sonda multilocus per verificare, nello specifico, la parentela di una madre e di un ragazzo che lei affermava essere suo figlio ma che il paese non aveva permesso di entrare. Ottiene dei pattern di bande difficili da interpretare, perché anche avendo individui molto imparentati possono esserci bande in comune. Il problema principale era che il padre non era disponibile per l'analisi; non c'era modo per capire se le bande erano state effettivamente ereditate dai genitori o semplicemente in comune.

Si va quindi a compiere un'analisi con più sonde multilocus differenti, ma anche in questo caso i risultati non sono affidabili. Per renderle più affidabili dovrei andare ad analizzare anche molte altre persone provenienti dallo stesso paese per capire quanto comuni fossero le bande presenti negli individui. La fortuna ha voluto che la madre avesse anche tre figli (di cui si è certi della maternità biologica); di conseguenza si possono andare a valutare anche i loro pattern di bande; dall'analisi del pattern dei figli bisogna derivare quello paterno e, di conseguenza, capire se le bande del ragazzo non identificato hanno bande che dovrebbero appartenere al padre.

Se nel figlio B è presente una banda che è assente negli altri 3 fratelli, potrebbe essere che effettivamente essa appartenesse al padre ma non fosse stata ereditata dai 3 figli; dovrei calcolare la probabilità mendeliana di ereditare quel carattere e valutare se c'è una differenza statisticamente significativa. Bisogna quindi calcolare la probabilità della presenza di una banda non compatibile: semplicemente presuppongo che il padre sia eterozigote per ogni microsatellite (dato che la stragrande maggioranza della popolazione è eterozigote) e vado a calcolare la probabilità che tali caratteri vengano ereditati dai 4 figli; 1/8 delle bande poteva non essere compatibile e osservando il pattern di bande, tale statistica veniva mantenuta, quindi si può presupporre che il quarto ragazzo fosse effettivamente figlio della madre analizzata.

Limiti delle sonde multilocus

• È facile dimostrare la non compatibilità tra pattern, ma è difficile dimostrare la compatibilità tra due pattern. Per poterlo fare bisogna effettivamente sapere qual è la probabilità che due persone presentino lo stesso profilo; era difficile stimare le frequenze alleliche nelle popolazioni, per questo motivo il DNA fingerprinting non è mai stato applicato in un caso reale.
• Oggi sappiamo che la probabilità di ottenere un match con una sonda multilocus è pari a 3x10^-11; una persona ogni 33.3 miliardi può avere un genotipo simile a quello analizzato (quindi effettivamente con questa tecnica si può convincere una giuria, perché 33 miliardi è 5 volte la popolazione terrestre e, di conseguenza, difficilmente sul pianeta ci sarà qualcuno con lo stesso genotipo).
• Non posso capire se il DNA che ho analizzato appartiene ad una singola persona oppure è una miscela di DNA; il campione può essere contaminato da altre tracce di DNA, che non possono essere discriminate.

Per superare questi limiti Jeffrey cerca di cambiare approccio; ogni banda è un allele di un marcatore minisatellite, che può avere al massimo due bande nel caso dell'eterozigote. Quindi si domanda quali sono le bande del singolo marcatore; vuole riuscire a visualizzare un marcatore alla volta, in maniera tale da riconoscere l'eventuale contaminazione ed iniziare a compiere dettagliate analisi genetiche.