Appunti di Chimica analitica applicata - parte 3

ELETTROFORESI Principi generali dell elettroforesi L elettroforesi è una tecnica di laboratorio utilizzata per separare molecole cariche, come acidi nucleici e proteine, sfruttando un campo elettrico. Le molecole migrano nel gel in direzione dell elettrodo di carica opposta (anodo o catodo), a seconda della loro carica. Questa tecnica è molto usata in biochimica e biologia molecolare perché è economica, veloce e molto versatile. E = campo elettrico q = carica della particella f = forze frizionali La velocità di migrazione è data da: Le forze frizionali dipendono dalla viscosità del mezzo: f = 6πrη Un parametro fondamentale è la mobilità elettroforetica, che si calcola come µ = v/E, e indica l efficienza con cui una molecola si muove nel campo elettrico. Fattori che influenzano la migrazione Durante un esperimento di elettroforesi, la migrazione delle molecole è influenzata da tre categorie di fattori principali: • CAMPIONE: le molecole differiscono per carica, dimensione e forma. Per esempio, molecole più piccole o con carica maggiore si muovono più velocemente. • TAMPONE: è la soluzione conduttrice che stabilizza il pH. Tamponi diversi possono modificare la velocità di migrazione. La forza ionica del tampone influenza la produzione di calore (più è alta, più calore si genera). Il pH è fondamentale per molecole anfolitiche, come gli amminoacidi, poiché ne condiziona la carica e quindi la direzione di migrazione. • SUPPORTO: è il materiale su cui avviene la corsa (cellulosa, agarosio, poliacrilammide, ecc.). Oltre a trattenere il campione, può anche influenzare la corsa con effetti di adsorbimento o filtrazione. Il supporto può essere: • cellulosa, • acetato di cellulosa, • silice, • amido (gel), • agarosio (gel), • poliacrilammide (gel) • Sephadex (gel) Elettroforesi su gel di agarosio L elettroforesi su gel permette la separazione di frammenti di DNA e RNA da una miscela complessa. L elettroforesi può essere analitica, per l analisi, o preparativa, per la purificazione degli acidi nucleici. DNA e RNA sono acidi nucleici formati da nucelotidi che contengono uno zucchero a 5 atomi di C, una base azotata e un gruppo fosfato. Nel DNA lo zucchero è il deossiribosio, nell RNA è il ribosio, anche le basi azotate sono diverse, nel DNA si ha la guanina che nell RNA è sostituita dall Uracile. L agarosio è un polisaccaride che, una volta sciolto e solidificato, forma una matrice porosa. Le molecole si muovono nel gel in base alla loro dimensione: più sono piccole, più velocemente migrano. Esiste una relazione inversa tra la velocità di migrazione e il logaritmo del peso molecolare (effetto setaccio). Questo significa che frammenti di DNA più lunghi si muovono lentamente, mentre quelli corti si muovono rapidamente. Anche la concentrazione di agarosio nel gel ha un ruolo chiave: gel più concentrati permettono una migliore separazione dei frammenti piccoli, mentre gel meno densi sono miglior