Appunti di Bionanotecnologie 2024 - Nanomedicina

 DIFFERENZA TRA SEMICONDUTTORE BULK E QUANTUM DOT

Nei bulk gli elettroni si trovano su due livelli:

-banda di valenza: vicino al nucleo

-banda di conduzione: più lontana

Alla NANOSCALA gli elettroni di valenza vengono confinati vicino al nucleo (struttura nano

dimensionata) e si allarga il gap con gli el. di conduzione.

che salta dalla valenza alla conduzione lascia una vacanza nella banda di

l’elettrone

valenza. Quando poi torna nella sua vacanza rilascia energia:

E=h*c/λ energia per minore lunghezza d’onda

maggiore

piccoli emettono più energia verso il blu mentre i più grandi emettono verso il

QDs

rosso.

VANTAGGI DEI QDs

 Sono circa 20 volte più luminosi

 Multi-imaging application: è possibile mettere più agenti di imaging

contemporaneamente

 Sono 10-100 volte più stabiliridotto si ha

PHOTOBLEANCHING: fenomeno per cui

la perdita di fluorescenza se il fluoruro viene esposto alla luce continua o intensa i

QDs hanno uno spettro di assorbimento più largo dei fluoruri tradizionali mentre uno

spettro di emissione in un range ben definito Questo significa che possono essere

eccitati efficacemente a una gamma più ampia di lunghezze d'onda, riducendo la

necessità di usare luce molto intensa per l'eccitazioneL'efficienza con cui

assorbono ed emettono luce riduce la probabilità di danni indotti da fotoni ad alta

energia, che possono causare photobleaching

Esempio:

Nella prima colonna:fluoruro normaledopo

 4 minuti perde fluorescenza

Seconda collona:QDs non perde fluorescenza(anche dopo 14 ore)

 Terza collona:sovrapposizione 1 e 2



DESIGN DEI QDs

1. SINTESI: sintetizzato ovvero decisa la distribuzione chimica, la dimensione,

l’architettura della superficie.

Si lavora con SOLVENTE ORGANICO ad alte temperature

 tri-octil-fosfina (TOP) o

trifosfinossido (TOPO)

Si abbassa la temperaturanucleazione

 dei cristalli

Extra-passaggio: aggiunto un semiconduttore

 solfuro di zincocreazione di un

secondo layerriduzione del photobleachingcore shell

sintetizzati in SOLVENTE ORGANICO: sospesi nel solvente così da non aggregarsi gli

uni con gli altri (dimensione=parametro critico per la lunghezza d’onda D’EMISSIONE)

QDs ha superficie idrofobica

2. CAMBIO DEL RIVESTIMENTO SUPERFICIALE: il QDs deve diventare idrofilico per

passare ad un SOLVENTE ACQUOSO in modo da poter trattare le CELLULE

Sostituzione del rivestimento

 Si aggiunge un altro rivestimento idrofilico (maschera)



3. FUNZIONALIZZAZIONE PER IMAGING IN VITRO: siccome si vuole fare imaging

delle cellule bisogna rendere i QDs specifici per quelle cellule modifico la superficie

con specifici LIGANDI (anticorpi,proteine,piccole molecole).

Metodi per l’attacco dei ligandi:

I. Legami covalenti stabili

II. Legamenti non covalenti (streptavidina-biotina)

III. Interazioni elettrostatiche

Risultato: strutture molto ripetibili e riproducibili con una microstruttura ordinata

ESEMPIO DI UTILIZZO QDs con LINKER o SPAZIATORE:

premessa: quando si lega un ligando a un QD questo ligando risulta poco mobile ovvero ha

meno possibilità di interazione con il suo recettore.Perciò si decide spesso di inserire tra QD

e ligando uno spaziatore o linker

1. QDs con struttura core shell con due layer: tellurio di cadmio e l’altro il solfuro di zinco

2. Superficie resa idrofilicaPEG che ha un gruppo terminale funzionale NH2 (gruppo

amminico)

3. Si lega il linker da una parte del PEG con un LEGAME COVALENTE tra il suo gruppo

carbossilico e il gruppo amminico del PEG

4. Si collega dall’altra parte un ligando al linkerRGD (sequenza peptidica:arginina-

clicina-acido aspartico) possiede un gruppo SH (gruppo TIOLO) che viene legato

COVALENTEMENTE con l’altro gruppo reattivo del linker(gruppo malammide)

APPLICAZIONI:

si vedono 2 esperimenti in vivo:



1. Modello di glioblastoma,tumore primario del cervello le cui cellule sono U87MG

frozen. Tumore estratto e sezionato. Viene esposto a una soluzione di QDs per fare

imaging il ligando RGDnon

QD705 (controllo) senza viene rilevato il tumore

QD705-RGDrileva il tumore

è possibile fare analisistaining

2. Si impianta un tumore in un topo(fianco) per via endovenosa dalla coda per poi

espiantarlo e prima di togliere il tumore viene impiantato il QDs.Si esegue

fluorescenza per 6 ore in vivo.

 QD705 (controllo) senza il ligando RGD rimangono in circolo per molto meno

in circolo per più tempo

QD705-RGDrimangono

n.b. si ricorda che essendo particelle piccole vengono smaltite velocemente

Guardando poi negli animali gli accumuli di fluorescenza si nota che c’è una distribuzione

non specifica delle particelle e che ci sono accumuli nel fegato,regi e organi intestinali che

sono i principali organi di accumulo e smaltimento veloce delle particelle perciò solo una

piccola parte arriva direttamente al tumore.

si vedono esperimenti in vitro:



si possono marcare diverse parti della cellula

-nucleo

-la superficie

-citoplasma

Infatti essendo modificati tramite un ligando ottengo una specificità per una determinata

parte della cellula in cui si vuole andare a fare imaging.

Si può usare per vedere lo studio del processo cellulare in tempo realeinterazione

 tra un recettore EGFR (r=receptor) e il ligando EGF.Le cellule sono state modificate

per emettere fluorescenza in verde mentre i QD in giallopian interagisce

piano il QD

con la superficie e poi entra all’interno della cellula

Si può usare come recettore secondario (esempio del citoplasma) in quanto il tipo di

 marcatore dipende anche dalle caratteristiche fisiche della cellula

EFFETTO FRET

Def: è un TRASFERIMENTO DI ENERGIA da un fluoruro all’altro per effetto di

RISONANZA.

Può avvenire solo quando due fluoruri sono compatibili ovvero quando si trovano ad una

distanza inferiore di un certo valore critico chiamato RAGGIO DI FOSTER

Come avviene: bisogna avere 2 fluoruri: un donatore e un accettore.Si richiede che lo

spettro di emissione del fluoruro donatore sia anche parzialmente sovrapposto con lo spettro

d’eccitazione(d’assorbimento) del fluoruro accettore.A questo punto il donatore invece che

emettere fluorescenza se colpito dalla luce dona la sua energia all’accettore che la resituirà

nel suo spettro di emissione.

VANTAGGIO QD:hanno spettri di emissione stretti quindi sono ottimi da sfruttare per l’effetto

FRET inoltre possono essere messi IN SERIE cosa non possibile con in fluoruri organici.

Applicazioni:

Modifiche conformazionali delle proteine

 Monitoraggio dell’interazione tra proteine

 Monitoraggio di cellule in differenti compartimenti cellulari



Esempi di applicazioni:

1. Monitoraggio modifiche conformazionali di una proteina

Si vogliono monitorare le modifiche conformazionali di una proteina in quanto quest’ultime

hanno una struttura 3D complessa e quindi cambiano in funzione delle condizioni esterne

ad esempio il pH. fluoruri all’estremità di una proteinanon quanto la

si legano due c’è risonanza in

proteina è allungatasi rileva spettro di emissione del primo fluoruro(donatore)

una configurazione arrotolata strettasi verifica

si cambia il pHla proteina assume

l’effetto FRETsi rileva lo spettro di emissione del secondo fluoruro (accettore)

2. Rilevamento di un gene nel DNA TARGET

L’obiettivo era identificare un certo gene G d’interesse in un filamento di DNA.

Si utilizza un sensore basato su quantum dots modificato con streptavidina che permette

l’attacco di una sonda di cattura (il mio ligando) al QD tramite un legame streptavidina-

biotina.

Capture probe: filamento di DNA modificato con biotina,complementare AD UNA PARTE

del DNA TARGET

Il capture probe si lega al filamento di DNA e lo avvicina al QD.

Reporter probe:complementare alla sequenza G del DNA che è legata ad un fluoruro CY5

Viene utilizzata la reporter probe per identificare il gene sfruttando l’effetto FRET.

Questa infatti legandosi con il gene avvicina il QD e il fluoruro.

Le risposte che si possono avere in merito alla presenza del gene G sono:

-no,non presente,se si ha l’emissione solamente del QD(il nostro donatore)

-si è presente,se l’effetto FRET si è verificato è lo spettro di emissione rilevato è quello del

fluoruro(accettore)

RIPASSO:

MOLECULAR BEACONS

Strutture a forma di forcina che fungono da sonda a oligonucleotide che sfrutta l’effetto

FRET.

Struttura:

-loop: singola elica di DNA

-gambo: (più corto del loop) formato da un fluoruro e un quenchereffetto FRET quando

legati in quanto lo spettro di assorbimento del quencher si trova sullo spettro di emissione

del fluoruro e quindi ne assorbe tutta la fluorescenza.

nella configurazione chiusa non si ha fluorescenza

Come avviene la fluorescenza??

L’energia nel loop essendo meno stabile del gambo, fa mantenere il legame tra fluoruro e

quencher.

Il filamento di DNA con sequenza complementare al loop va ad ibridare con questo si

minimizza l’energia libera e si ha una struttura del loop che diventa più stabile per ragioni

termodinamiche si preferisce una struttura stabile e con minore energia fluoruro e

quencher si distaccano e il fluoruro inizia ad emettere.

APPLICAZIONE DEI MULECULAR BEACONS:PCR REAL TIME

Viene utilizzato il mulecular beacons per monitorare gli effetti della PCR in tempo reale

PCR: tecnica di amplificazione del DNA

La PCR avviene tramite:

-un filamento DNA

-un primer:sequenza di DNA artificiale complementare al DNA che si sta copiando

-DNA POLIMERASI

-NUCLEOTIDI

Si parte quindi denaturando il DNA e lasciandone un solo filamento e poi si collega il primer

che fa partire la reazione a questo si lega la DNA polimerasi che inizia a copiare grazie ai

nucleotidi.

Utilizzo dei mulecular beacons

Si crea il beacon con una piccola sequenza del DNA che si sta replicando.

 Durante la PCR, se la sequenza target è presente, la sonda si apre e la sequenza di

 anello si lega al DNA complementare.

Il mulecular beacon si lega quindi alla molecola target (il fluoruro si allontana ma la

 fluorescenza non è così forte)

Al passaggio della DNA polimerasi, quest’ultima va a estende il DNA e a staccare il

 fluoruro dal quencher che quindi emetterà fluorescenza

Ogni volta che una molecola di DNA viene copiata vengo liberate molecole di fluoruro

 che iniziano ad emettere

Rilevando l’intensità della fluorescenza è possibile rilevare quante copie del DNA sono

state fatte.