Appunti di Bionanotecnologie 2024 - Biomems

GAP-LIGASE

Una variante della LCR è la Gap Ligase, che utilizza sonde più corte. In questo caso, le

sonde riescono a legarsi solo parzialmente con la ligasi, lasciando una parte scoperta che

viene completata dalla DNA polimerasi. Questo processo combina la selettività della LCR

con la precisione della PCR, permettendo di ottenere un'analisi ancora più dettagliata e

specifica del DNA target.

ELETTROFORESI SU GEL

L'elettroforesi su gel è un metodo fondamentale per la separazione delle molecole

biologiche, come il DNA, l'RNA e le proteine. Questo metodo sfrutta un mezzo poroso,

solitamente costituito da agarosio (naturale) o da acrilammide (sintetico), che agisce come

una sorta di setaccio molecolare.

Come si misura il DNA?? In bp ovvero base pairs (coppie di basi).

Procedimento:

1. Preparazione del Gel: Il gel viene preparato sciogliendo agarosio o acrilammide in

un tampone, che stabilizza il pH desiderato per la separazione.

2. Caricamento del Campione: Il DNA viene caricato in pozzetti situati vicino

all'elettrodo negativo (catodo).

3. Applicazione della Corrente: Sotto l'influenza di un campo elettrico, le molecole di

DNA, che sono cariche negativamente, migrano verso l'elettrodo positivo (catodo).

4. Separazione delle Molecole: Le molecole più piccole, che incontrano meno

resistenza nel gel, migrano più velocemente rispetto a quelle più grandi. Questo

permette di separare le molecole in base alla loro dimensione.

5. Rilevazione dei risultati: alla fine si ottengono delle bande che si evidenziano con

dei coloranti o con dei marcatori radioattivi

SOUTHERN BLOTTING

Il Southern blotting è una tecnica che combina l'elettroforesi su gel con la trasferimento del

DNA su una membrana, seguita dalla rilevazione specifica delle sequenze di DNA.

Procedimento:

1. Separazione del DNA: Il DNA viene separato tramite enzimi di restrizione in pezzi

più piccoli

2. Elettroforesi su gel: separazione in base al peso molecolare

3. Trasferimento su Membrana: Il DNA viene trasferito dal gel a una membrana di

nylon o nitrocellulosa.

4. Ibridazione con Sonda: Delle sonde radioattive o marcate a fluorescenza vengono

inserite nella membrana (di solito sono un frammento di DNA complementare) e

vengono utilizzate per identificare specifiche sequenze di DNA sulla membrana.

5. Rilevazione: La sonda marcata permette di visualizzare le bande di DNA

corrispondenti alla sequenza di interesse.

NORTHEN E WESTERN BLOTTING

l’identificazione dell’RNA; metodo, l’RNA cellulare

Northern blotting: usato per in questo

totale è estratto e separato mediante elettroforesi su gel in base alle sue dimensioni. Anche

caso, l’RNA viene trasferito

in questo su fogli e marcato con sonde

usato per l’identificazione

Western blotting: di proteine; le proteine presenti sugli estratti

cellulari sono dapprima separate in accordo con le dimensioni secondo la tecnica di

elettroforesi su gel di poliacrilammide.Le proteine ottenute vengono trasferite a un filtro il

l’anticorpo e successivamente si rileva l’anticorpo attraverso

quale viene fatto reagire con

diverse tecniche (es.chemiluminescenza).

METODI DI RILEVAZIONE

SENSORI con rilevatori adatti a dispositivi miniaturizzati.

Ci sono 3 modalità di analisi:

-rilevazione meccanica

-rilevazione ottica

-rilevazione elettrica

L’ottica è la più usata ma la meccanica ha delle potenzialità maggiori.

1. RILEVAZIONE MECCANICA

• La rilevazione meccanica di entità e reazioni biochimiche è realizzata tramite l’uso alla

micro e nano scala di sensori inseriti su cantilever

• Il maggiore vantaggio nell’uso dei sistemi meccanici per il riconoscimento di molecole

consiste nel fatto che la rilevazione sfrutta semplicemente la variazione di oscillazione o il



bending (piegamento) del Cantilever profilometria della superficie ricostruita su

un’immagine.

• Si possono avere due modi d’uso:

I. Rilevazione della variazione di massa sul cantilever

II. Rilevazione di una reazione biochimica sul cantilever

I.VARIAZIONE DI MASSA

 Il cantilever viene eccitato meccanicamente, usando, ad esempio, un meccanismo

esterno oppure il rumore ambientale, e vibra alla sua frequenza di risonanza.

 Quest’ultima viene misurata utilizzando metodi elettrici oppure ottici e confrontata con

di risonanza del cantilever dopo che un’entità biologica è stata catturata.

la frequenza

 Il cambiamento di massa può essere rivelato valutando lo shift nella frequenza di

risonanza (si assume che la costante elastica resti invariata).

 La cattura di entità di maggiori dimensioni, come cellule o virus, si valuta con questo

metodo

II. REAZIONE BIOCHIMICA

La rilevazione meccanica di entità e reazioni biochimiche è realizzata tramite l’uso alla micro

e nano scala di sensori inseriti su cantilever.

• Viene fatta avvenire una reazione biochimica selettivamente su un lato del cantilever.

• Un cambiamento nell’energia libera di superficie risulta in un cambiamento dello stress

superficiale, che comporta un piegamento (bending) misurabile del cantilever.

• Il bending è misurabile otticamente con un laser (come nella microscopia a forza atomica,

posizionato all’estremità fissa del

AFM) oppure elettricamente con un piezo-resistore

cantilever.

RILEVAZIONE MECCANICA-ESEMPI

1.RILEVAZIONE DI DNA

Sul cantilever sono presenti i monofilamenti di DNA. Ad essi si attaccheranno solo i filamenti

complementari (la cui presenza vuole essere rilevata). Quando il filamento complementare

(se presente nella soluzione di analisi) si lega ai monofilamenti immobilizzati sul cantilever

(ibridazione) produrrà una variazione di massa che farà piegare il cantilever. Questo verrà

rilevato, con conseguente quantificazione, stabilendo una correlazione tra quantità di analita

rilevato e bending (piegamento) del cantilever.



Possibile struttura:micro-array unione di più cuntilever per visualizzare reazioni chimiche

su più porzione di DNA

3. RILEVAZIONE DEI MARKER TUMORALI

In questo caso non viene usato un DNA, ma il legame dualico delle proteine

ovvero anticorpo-antigene.

Esempio classico: PSA (antigene prostatico) tipico di infiammazioni e tumori alla prostata

L’inclusione del cantilever all’interno di un dispositivo di diagnostica può permettere un

riconoscimento rapido dei marker tumorali.

 immobilizzazione dell’anticorpo su una superficie d’oro sul cuntilever + spaziatore (

consente più mobilità).

 Nel sangue ci sono diverse proteine e non solo l’antigene che potrebbero legarsi

all’anticorpo per assorbimento e quindi spostare il cuntilever

 Metodo di rilevazione:

 Creazione della linea di base: il raggio ottico colpisce la punta del cuntilever

con fotodiodo e la misura correlabile sarà lo zero

si avrà l’assorbimento e quindi il cuntilever si sarà spostato insieme al

 fotodiodo e sarà colpito in un altro punto rispetto a primacalcolo quindi la

deflessione cioè lo scostamento dalla linea di base

2. RILEVAZIONE OTTICA

La più comune tecnica di rilevazione usata in biologia ed il segnale che si va a studiare è di

fluorescenza o chemiluminescenza.

assorbimento molecolare dell’energia incidente

FLUORESCENZA: (fotone) ad una certa

lunghezza d’onda e la sua riemissione ad un’altra lunghezza d’onda.

L’elettrone sta nell’orbitale più basso(HOMO). Quando è irradiato con una radiazione di

energia hν, si trasferisce grazie all’energia assorbita su un orbitale eccitato a più alta energia

(LUMO), assorbendone l’energia che gli viene irradiata. Quando poi la molecola si rilassa e

tende a tornare nello stato fondamentale, l’elettrone decade. Questo è un decadimento non

radiativo (si è nell’orbitale Sπ), cioè non emette energia. Arrivato sull’ultimo orbitale,

completa il suo rilassamento tornando allo stato fondamentale emettendo energia, a una

frequenza ν1 < ν, perché E1 < E; al contrario, la lunghezza d’onda di emissione è maggiore

della lunghezza d’onda di eccitazione (λ1 > λ).

HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital):

Il HOMO è l'orbitale molecolare occupato con la più alta energia. In altre parole, è l'orbitale

in cui si trovano gli elettroni più energetici di una molecola nello stato fondamentale

LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital):

Il LUMO è l'orbitale molecolare non occupato con la più bassa energia. È l'orbitale in cui un

elettrone può essere promosso quando una molecola assorbe energia, come un fotone.

CHEMILUMINESCENZA: emissione di luce in seguito ad una reazione chimica.Richiesto

l’uso di molecole o enzimi che vanno a catalizzare (cioè amplificare) le reazioni che

producono luminescenza.È meno usata ed è sempre l’ unione di una proteina con un

anticorpo.

TIPI DI RILEVAZIONE OTTICA:

3. RILEVAZIONE DI UN FILAMENTO DI DNA

Sul layer ho delle catene singole di DNA a cui andrò a collegare il DNA marcato in

precedenza per essere fluorescente

4. RILEVAZIONE DI BIOMOLECOLE/PROTEINE

Sul layer le captube probes sono degli anticorpi e si legano le proteine con fluorescenza

5. RILEVAZIONE DI CELLULE

Layer con anticorpi selettivi per proteine extra membrana della cellula.Per marcare la cellula

fluorescente si usano anticorpi marcati fluorescenti. La cellula infatti dovrebbe avere degli

sia da una parte che dall’altra

antigeni da una parte gli antigeni si collegano agli anticorpi

del layer dall’altra agli anticorpi fluorescenti

IMMOBILIZZAZIONE DEI CAPTURE PROBES-TECNICA CHIMICA

 SUPERFICI RIVESTITE CON AMMINOSILANO

Quello che viene chiamato attachment layer è il rivestimento del chip in cui vado a mettere

delle funzionalità per collegare le molecole d’interesse.

Posso funzionalizzarlo con amminosilano che è formato da gruppi amminici quindi positivi

un’interazione

( a ph basso e che formano lo ione ammonio) così che crei elettrostatica

con un DNA in quanto questo presenta gruppi fosfato che sono negativi .

 SUPERFICI RIVESTITE CON ALDEIDI

Creazione di un legame più forte di tipo covalente.Si usano legami aldeidici sulla superficie

e il DNA che si vuole attaccare deve essere ammino-modificato. (reazione poco stabile in

quanto di equilibrio)

3. RILEVAZIONE ELETTRICA

Si basa su tre sensori:

1. Amperometricicorrente

2. Potenziometricidifferenza di potenziale



3. Conduttimetrici cambiamento