Appunti di Bionanotecnologie 2024- MODIFICHE SUPERFICIALI- Ciardelli

PARTICELLE DELL’ADESIONE CELLULARE

tre domini:

- intracellulare:che interagisce con il citoscheletro;

- transmembra:attraversa il doppio strato fosfolipidico

- extracellulare: interagisce con altre molecole di adesione dello stesso tipo (legame

omofilo) o di altro tipo piuttosto che con la ECM (legame eterofilo).

Appartengono a 4 famiglie proteiche:

Caderine: adesione cellula/cellula

Superfamiglia Immunoglobuline: interagiscono con porzioni idrofobiche a foglietto beta

Selectina/proteina glicosilata: solo nei vertebrati. Constano di un piccolo dominio

citoplasmatico, un singolo dominio transmembrana ed una serie di domini extracellulari.

Integrine: eterodimeri costituiti da una subunità alfa e una beta unite da legame non-

covalente. Legano proteine della ECM, entrano in gioco in interazioni cellula/cellula (ad es.

nei leucociti) ed interagiscono con la superfamiglia Ig.

MECCANISMI CHE REGOLANO L’ADESIONE CELLULARE

Concetti alla base:

-la membrana plasmatica è formata da fosfolipidi (gruppi fosfatonegativi) quindi ha carica

netta negativa repulsione di altre cellule



Carica netta negativa repulsione



Carica netta positiva attrae

L’adesione perciò è modulata da circa 100 tipi di recettori della superficie cellulare che si

legano alle sequenze peptidiche delle proteine dell’ ECM.--> LIGANDI

Oppure adesione di tipo ELETTROSTATICO regolata dalla tensione superficiale della

superficie in quanto la carica della membrana è negativa.

 

Regolazione della bagnabilità angolo di contatto superficie e acqua misurazione

elettrostatica

Fattori per controllare la forza delle interazioni:

- tensione superficiale;forze coesione tra due liquidi

di

- la carica superficiale aumenta l’adesione;presenza di cariche superf. materiale

- rugosità superficiale: AS (area specifica) più alta promuove l’adesione;

- chimica superficiale: ligandi di adesione (fibronectina, collagene, rivestimenti idrofilici) o

agenti

bloccanti (BSA –albumina da siero bovino-, eparina).

• possibile controllare anche vitalità e crescita cellulare.

• Le cellule diffondono sulla superficie. possiamo rivestire la superficie cellulare per

funzionalizzarla e indurre l’adesione cellulare

SPREADING CELLULARE

Fase immediatamente successiva all’adesione cellulareprocesso che unisce adesione

cellulare e rete contrattile cellulare (citoscheletro).

-la cellula messa su una superficie all’inizio è tondeggiante

-si formano punti focaliadesione

-cominciano a formarsi protusioni citoplasmatiche cellula cambia forma sfruttando la

la

mobilità del citoscheletrospreading

-quando incontra una cellula il processo si blocca

-se la superficie non piace alla cellula rimane tondeggiante e muore

FORMAZIONE DI PUNTI FOCALI

Adesione focale: adesione forte tramite i recettori delle proteine adesive.-->legame

LIGANDO-RECETTOREcambiamento dei recettori di membrana e conseguente risposta

biochimica

Formazione di punti focali ultimo processo dell’adesione cellulare

Superficie membrana(triangolini) rivestimento di FIBRONECTINA

INTEGRINA(forbici)cercano punti di aggancio

TALINA E VASCULINA (cerchi e bastoncini) ‘ integrina

proteine che si legano all

ACTINAformazione di CITOSCHELETRO+ MIOSINAsegnali al nucleo

Close contact siti meno forti intorno ai punti focali

Contatti con l’ECMlegami elettrostatici

Le adesioni focali evolvono:

-all’inizio si ha una RETE DI ACTINALAMELLIPODEin sposta,

questo modo la cellula si

trova il contatto e il citoscheletro si organizza trasmettendo il segnale che promuove

adesioni focali e stimola le integrine

-struttura matura: le integrine collegate a actina e miosina contrattili

Meccanosensore: trasforma una perturbazione meccanica in un segnale

-CELLULA TONDEGGIANTE: non sta bene in quella superficie bassa viabilità, non sta

migrando, non sta proliferando e non si sta differenziando (solo staminale)

-MEDIO SPREADING: variabilità alta, cellula che tende migrare e proliferare,no

differenziazione

-ALTO SPREADING: maggiore differenziamento, buona viabilità, ma meno migrazione e

proliferazione

FATTORI PER FAVORIRE PROCESSI DI ADESIONE

Si possono modulare 5 fattori:

1. CHIMICA SUPERFICIALEfunzionalizzazione della sequenza RGD*

2. CARICA SUPERFICIALE

3. IDROFILICITA’

4. TOPOGRAFIA SUPERFICIALE

5. RIGIDEZZA DEL SUBSTRATO

*RGD=la fibronectina ha queste sequenze RGD (arginina-glicina-aspartico) che sono

responsabili del legame con le integrine

1.CHIMICA SUPERFICIALE

I gruppi funzionali possono cambiare il meccanismo di adesione cellulare e in particolare

possono influenzare bagnabilità e carica superficiale.

ESEMPIO: CELLULE STAMINALI DELLA MATRICE OSSEA

Coltivate su stesso substrato,ma con gruppi funzionali diversi:

 Amminico NH2

 CarbossilicoCOOH

 MetilicoCH3

 OssidrilicoOH

Risultati:

Dopo 7 giorni di cultura si può vedere che l’adesione è avvenuta soprattutto con NH2 e OH

Ora vengono fatti studi confrontando con gruppo di controllo:

B e C analisi morfologiche

In B misura l’area complessiva della cellula nei vari casi gruppo ossidrilico e gruppo metilico si

hanno delle differenze significative.

In C, guardando la formula della cellula, si misurano anche i prolungamenti primari, secondari e

terziari della cellula e si confrontano con il controllo. il gruppo amminico ha una differenza

significativa rispetto al controllo.

D e E  analisi funzione molecolare

in D si vede l’espressione genica, ovvero quanto i geni vengono trascritti in mRNA e i geni che

si vanno a vedere sono geni caratteristici del fenotipo osteogenico (quindi quanto le cellule

staminali da polpa dentale umana si stanno trasformando in osteoblasti, ovvero cellule che

sintetizzano l’osso

In E si vanno a vedere le proteine attraverso il western blot, ovvero delle separazioni

elettroforetiche che poi vengono sviluppate con anticorpi specifici. In E l’intensità della banda

elettroforetica dice quanto beta-actina, ALP ecc, vengono prodotti dalle cellule come proteine.

2.CARICA SUPERFICIALE

Si può sfruttare l’interazione elettrostatica tra cariche positive e cariche negative della

membrana

ESPERIMENTO:

Sono riportate delle superfici a carica positiva crescente verso il basso, misurata con

misurazione di potenziale Zeta.

ore le cellule proliferano molto meglio sulla superficie carica positivamente

dopo 4

 dopo un giorno si vedono le cellule adese.

Inoltre, il lavoro complessivo dice anche che aumenta l’attività della fosfatasi alcalina nelle

cellule e l’espressione genica della chinasi di adesione focale e marker osteogenici.

3.BAGNABILITA’

Risultati migliori con superfici moderatamente bagnabili. angolo di contatto tra 70 ° e 80 °

Superfici idrofiliche e idrofobiche creano cellule troppo tondeggianti o appiattite.

4.TOPOGRAFIA SUPERFICIALE