Appunti Biologia molecolare

RAGGI X E RAGGI Y (RADIAZIONI IONIZZANTI)

Doppio filamento (DSB)possono direttamente attaccare (ionizzare) il desossiribosio dello scheletro del DNA

durante la replicazione ,ma si appaiano in modo non accurato portando a frequenti errori di replicazione.

AGENTI INTERCALANTI: Sono molecole piace caratterizzate da diversi anelli policiclici capace di legarsi

come le basi (che hanno anche loro una struttura piatta ) al dna.

-> inserzione: si infilano tra le basi dello stampo portando all’aggiunta di un nucleotide .

->delezione : un interlocutore forma una distorsione del filamento che porta la polimerasi a saltare un

nucleotide.

RIPARAZIONE DEL DNA

RIPARAZIONE DIRETTA: riparazione di errori senza rimozione.

FOTORIATTIVAZIONE: l’enzima dna fotorilasi cattura l’energia necessariadal sole per rompere i legami

covalenti che uniscono piramidone adiacenti . Le basi danneggiate vengono subito riparate.

RIMOZIONE DEL METILE DALLA GUANINA: una metiltransferasi rimuove il gruppo metilico della o6-

metilguanina e lo trasferisce su uno dei suoi residui di cisterna ,una volta accettato la metiltransferasi non

può più funzionare e va verso il suicidio cellulare .

RIPARAZIONE INDIRETTA: riparazione di errori rimuovendo basi o segmenti.

ESCISSIONE DI BASI: la glicosilasi(enzima) ribalta la base danneggiata verso l’esterno dell’elica essa entra

nella tasca enzimatica e viene rimossa con l’idrolisi del suo legame glicosidico.

Interviene la ENDO AP che riconosce lo zucchero basico tagliando in 3’oh aprendo il sito per la pol I,essa

riconoscendo l’assenza di base e crea un nick in 3’ OH. Poi interviene l’esonucleasi che idrolizza fino a 5’

oh eliminando lo zucchero e il fosfato. In fine la pol I mette un nuovo nucleotide.

ESCISSIONE PER NUCLEOTIDI commesso UVR riconosce le distorsioni .

Un complesso di 2 UVRA e 2 UVRB fonde il dna formando una bolla di denaturaizone ,e recluta UVR C( 2

subunita unite nel reclutare una delle due uvrb esce dalla bolla ) uvr c crea due incisioni prima e dopo la

lesione . Il filamento con la lesione viene rimosso da UVRD (che è una dna elicasica) .

Uvr C esce assieme a uvr d e il segmento. La dna pol I e la dna ligas intervengono a sostituire i filamento.

SINTESI TRANSLESIONE: introduce con alta probabilità delle mutazioni che possono essere riparate in

seguito ,evita che la cellula rimanga con un cromosoma con completamente replicato.

La dna pol che sta replicando incontra una lesione non riparata che crea un ostacolo . Essa si blocca e

richiama un complesso di proteine dna pol particolari che sintetizzano il dia passando oltre il punto di

lesione.

RICOMBINAZIONE:

NON OMOLOGA: se unn cromosoma non ancora replicato subisce una rottura; non è presente alcun

cromosoma fratello che possa fungere da stampo. La sequenza originaria non viene mantenuta perche c’è

la perdita di qualche base, e il processo è mutageno . Le due estremità rotte che protrudono vengono

modificate dalla dna nucleasi a singol strand e vengono cosi appaiati tra di loro e in fine la dna pol termina

riempiendo i vuoti rimasti.

OMOLOGA : DBS

I allineamento di due molecole di dna omologhe: due sequenze con una regione di almeno un centinaio di

coppie di basi.

II introduzione di rotture nel dna : dopo la formazione di rotture le loro estremità vengono ulteriormente

tagliate per produrre regioni di dna a filamento singolo.

III invasione di filamento: una regione di dna a singolo filamento si appaia con il filamento complementare di

dna omologo,si ha la formazione di una molecoola a doppio filamento che spesso contiene delle basi

appaiate male. (dna eteroduplex)

IV formazione della giunzione di holiday : in seguito all’invasione del filamento le due molecole sono

connesse dai filamenti che si incrociano (struttura a croce , giunzione di holiday). A ogni movimento si ha la

rottura sulla molecola di dna e di ricombinazione (migrazione di chiasma)

V risoluzione della giunzione di holiday: 2 modi :

-> taglio di due filamenti che forma due duplex separati _crossing over

_prodotto a toppa (non si ha riassortimento)

->convergenza\collasso

Proteine per la ricombinazione omologa:

->RECBCD : processa le molecole di dna rotte per generare regioni a singolo filamento e favorisce il

caricamento di recA.

-RecB usa l’idrolisi dell’atp elicasi 3’-5’ con attività dna nucleasica che digerisce il dna mentre separa i due

filamenti.

-RecD usa l’idrolisi dell’atp elicasi 3’-5’

-RecC unisce il complesso e riconosce i siti Chi (x)

REC BCD scorre sui filamenti separandoli, solo che ReCB e più lenta di RECD ed essa forma un’ansa

nell’estremità 3’.

Quando il complesso riconosce la sequenza chi si ferma per pochi secondi cambiando l’attività (prima

l’ansa viene riavvolta parzialmente da recB e RecB diventa il principale motore del complesso;

Secondo RecD subisce un disaccoppiamento

Terza tappa l’attività nucleasica viene modificata.

Quando il complesso riparte ha una velocità dimezzata rispetto a quella iniziale e trasforma il doppio

filamento in una coda a singolo filamento 3’ che termina con la sequenza chi.

->RECA haun’interazione diretta proteina-proteina con recB. Catalizza l’appaiamento tra molecole di dna

omologhe,ricerca le sequenze equivalenti tra due molecole e ne permettono il loro appaiamento. RecA si

attacca sul filamento in direzione 5’-3’ per favorire la copertura del filamento 3’-

RecA ha un sito primario legato al 3’ della molecola da appaiare e un sito secondario che può essere

occupato da una molceola a doppio filamento ,può legare enormi porzioni per verificare rapidamente la

complementarietà. Il dna legato al siro secondario viene temporaneamente aperto e valutato per la sua

complementarietà; una volta individuata una regione complementare (almeno 15 basi) Rec A promuove la

formazione di un complesso stabile con una serie di legami idrogeno.

RNA POLIMERASI

Il core enzimatico è in grado di sintetizzare l’Rna ed è composto da due copie della subunità alfa , da una

beta, beta primo e omega. Le parti interne dell’enzima sono coinvolte nella sintesi dell’rna su un substrato

di DNA e molte regioni periferiche sono coinvolte in interazioni con altre proteine.

La forma è a chela (simile alla mano della dna pol) e le pinze sono formate da beta e beta ‘.

Il sito attivo funziona con un meccanismo simile a quello catailico a cationi bivalenti per l’aggiunta di

nucleotidi . Nel sito attivo si ha solo MG2+ strettamente legato,il secondo mg2+ viene introdotto con un

nuoco nucleotide in ogni ciclo di sintesi e rilascio con il pirofosfato . Ha anche 5 canali per l’entrata di

nucleotidi e l’uscita di RNA.

TRASCRIZIONE NEI PROCARITI

La regolazione dell’espressione puo avvenire in numerosi livelli. Il meccanismo più importante della

regolazione dell’espressione genica soprattutto nei batteri passa attraverso la regolazione della trascrizione

perche se si bloccasse fin da subito la sintesi dell’mRNA non si potrà avere una proteina e non si avrà

consumo di energia,se invece ne avete bisogno ci sarà la trascrizione e quindi traduzione e tutto ne

consegue,quindi tanto prima il meccanismo di regolazione interviene, tanto più più virtuoso in termini

energetici è. Questo meccanismo di regolazione passa attraverso il gioco tra elementi in cis ed elementi in

trans: tutti gli elementi in cis sono elementi di sequenza, tutti gli elementi in trans sono esterni alla

sequenza. Se ci sono ulteriori elementi di sequenza che regolano l’attivita del promotore questo elemento x

è un elemtno in cis perchè attaccato alla sua stessa sequenza nucleotidica del gene. La proteina che serve

a riconoscere l’elemento in cis siccome non è un elemento di sequenza,si dice in trans, tutte le volte che un

elemento è in trans significa che non fa parte di quell’elelmento .

Qualunque siano gli elementi , cioè le proteine specifiche che noi abbiamo ci sono un gruppo di proteine

che agisce da attivatori della trascrizione e un gruppo di proteine da repressori e se parliamo della

traduzione saranno dello splicing e i meccanismi con cui essi agiscono saranno di diversa natura.

Il meccanismo più semplice che ha il repressore per agire è quello per impedire il legame della DNA

polimerasi perchè forma ingombro sterico sulla regione.

Un esempio è cio che accade nel lac operon: c’è l’rna polimerasi con la particella sigma che deve

riconoscere il promotore ma vi è anche un elemento di sequenza in cis che può essere riconosciuto da un

repressore e quindi vi è una competizione fra rna pol, sigma 70 e il repressore, il quale si lega con più

affinità. Se si lega il repressore con più affinità,la Rna pol non può attacarsi in quanto e sequenze sono

‘’mascherate ‘’ , perciò viene inibita la trascrizione. Gli elementi attivatori in genere riconoscono sequenze

non sovrapposte a quelle alla quale si leha la polimerasi ,perchè altrimenti andrebbero in competizione

difatti gli attivatori si attaccano a sequenze vicine spazialmente al punto di inizio della trascrizione (possono

essere anche distanti ma comunque li raggiungono attraverso dei loop presenti nel dna) . Le proteine

attivatrici che si legano a queste sequenze possono aiutare a rendere più saldo il legame tra RNA POL e

ATTIVATORE. Le sequenze regolatrici possono essere più distanti rispetto al promotore e questo caso lo

vedremo negli eucarioti in cui le sequenze sono molto molto lontane rispetto al promotore.

TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI

L’arsenale di RNAp delle cellule eucariotiche è composto da tre differenti complessi,che includono tre

diversi sottotipi di RNAp. Esse si distinguono per il tipo di rna che producono:

- RNAp I : sintetizza rna ribosomiale (rRNA) tutte le cellule hanno bisogno di ribosomi per sintetizzare le

proteine; i geni per gli lrna ribosomiali dovranno essere trascritti a prescindere dalla tipologia di cellula

(retina,fibroblasto,osteocita)

- RNAp II : sintetizza rna messaggero (mRNA) questa polimerasi e i geni da essa trascritti sono quelli più

finemente regolati poichè non tutte le cellule esprimono tutti i geni codificanti proteine.

- RNAp III : sintetizza RNA transfer (tRNA) tutte le cellule necessitano di RNA transfer altrimenti non

riuscirebbero a produrre proteine.

Il core catalitico delle RNA polimerasi, sebbene le polimerasi siano differenti tra di loro per la loro funzione, è

pressocche mantenuto sia negli eucarioti (I-II-III) sia nei procarioti (nei batteri sono presenti due beta due

alfa e un omega) : le proteine prodotte da eucarioti e procarioti dunque sono omologhe. Cio che le

differenzia sono le svariate subunit&agrav