Appunti di Biochimica applicata - laboratori

Dosaggio del glucosio nel siero tramite un saggio end-point enzimatico accoppiato di tipo

Nella reazione primaria il glucosio è presente nel siero --> dobbiamo monitorare l'aumento di assorbanza a 340 nm (spettro UV) dovuto alla produzione di NADPH.

Dovremo preparare alcuni reagenti, mentre altri sono già pronti ed aliquotati.

Prepariamo un tampone poiché le reazioni devono avvenire ad un pH di 7.5 --> dobbiamo preparare il TRIS, una base --> bisogna calcolare quanti grammi mettere in una soluzione 1 molare da 100 mL. Bisognerà portare la soluzione a pH 7.5 aggiungendo acido cloridrico. Bisogna calibrare il pHametro nel range di pH desiderato utilizzando delle soluzioni campione.

NB: Non bisogna sciogliere subito il Tris-HCl nella soluzione --> la quantità di polvere la sciogliamo in 70 mL, aggiungiamo l'acido cloridrico e poi alla fine aggiungiamo acqua per portare a volume.

Poi prepariamo una soluzione di glucosio concentrata per 3

soluzioniServono per la retta di taratura finale.

Allestiremo 5 provette, ognuna delle quali conterrà 2 mL di mix di reazione--> prepariamo subito i 10 mL, che poi separiamo nelle 5 provette.

Si aggiungeranno poi 20 microlitri di altre sostanze.

Dopo 10 minuti di incubazione si va a misurare l'assorbanza --> dovremmeaumentare di 0.4 circa. Se dopo 10 minuti non continua ad aumentare, vuoldire che tutti il glucosio è stato fosforilato.

Dosaggio della creatin chinasi tramite un saggio enzimaticoend-pointaccoppiato di tipo

In questo caso misuriamo l'attività dell'enzima, non la quantità di sostanzapresente nel siero --> il saggio è lo stesso, ma le misurazioni vanno fatte contempistiche molto precise, dopo 5 e 10 minuti.

In questo caso si preparano 5 mL di mix di reazione.

Laboratorio 2: analisi dell'attività della lattico deidrogenasisu gel di agarosio

Lab 3: Valutazione del potere antiossidante degli alimenti