Appunti delle lezioni di Laboratorio di micro e nano strutture

La formazione del personale e degli operatori è fondamentale

R=D*PÈ fondamentale la formazione del personale e degli operatori che ne sono responsabili. L’insieme di procedure, tecniche ed accorgimenti da attuare per eliminare o ridurre al massimo l’esposizione ad agenti biologici è il contenimento: “ i lavoratori in generale acquisiscono il ruolo di artefici e diretti responsabili della sicurezza e non dimeri beneficiari passivi, in quanto viene loro richiesto profonda conoscenza e controllo del sistema lavorativo in cui si opera, oltre che cooperazione ed attiva compartecipazione di tutti i soggetti nella attuazione delle misure di sicurezza”

Contenimento primario; Protezione del lavoratore o del personale situato nelle immediate vicinanze della possibile sorgente di esposizione. Costituisce la prima linea di difesa nella gestione di agenti patogeni. Tramite:

• Procedure tecniche e operative: riguardano più da vicino l’operatore e devono essere conosciute. Presuppongono la valutazione e la

conoscenza dei rischi e l'esistenza di manuali dedicati. Le procedure prevedono che si lavori sempre con una barriera interposta tra agente infettivo e l'ambiente/lavoratore. Fungono da barriera le cappe, i tappi, i filtri etc.

Attrezzature specifiche: cappa di sicurezza biologica, centrifughe con chiusure a tenuta, contenitori, filtri, strumenti etc.

Dispositivi di protezione: Se l'integrità della barriera viene a mancare intervengono i dispositivi di protezione individuale guanti, camici, occhiali o calzari

Altre misure, come vaccinazioni

Contenimento secondario: protezione dell'ambiente esterno (aria, rifiuti liquidi o solidi). Si usano misure costruttive e procedure. I livelli di contenimento in termini di misure progettuali e costruttive (incluse costruzione e dotazioni (precauzioni ed attrezzature) di sicurezza dipendono ovviamente dal tipo di agenti manipolati. Anche i laboratori vengono classificati:

Livello di biosicurezza

Gruppo di rischio dei microrganismi: 1

Addestramento di base

Buona tecnica microbiologica

Attrezzature di sicurezza: nessuna

Livello di biosicurezza 2 (quello nostro di Biocell)

Gruppo di rischio dei microrganismi: 2

Buona tecnica microbiologica; indumenti protettivi; simbolo del rischio biologico sulla porta

Attrezzature di sicurezza: cappa di sicurezza biologica classe I o II

Livello di biosicurezza 3

Gruppo di rischio dei microrganismi: 3 o grandi volumi ed alte concentrazioni 2

Indumenti speciali; accesso controllato;

Attrezzature di sicurezza: Cappa di sicurezza biologica classe II o III; altri mezzi primari di contenimento per tutte le attività; aria filtrata in ingresso ed in uscita

Livello di biosicurezza 4 (di massima sicurezza)

Gruppo di rischio dei microrganismi: 4

Unità di lavoro con patogeni pericolosi Ingressi con camera a tenuta; doccia obbligatoria all’uscita;

Attrezzature di sicurezza: Cappa di sicurezza biologica classe III; tute

pressurizzate; autoclavi adoppia apertura; aria filtrata in ingresso ed in uscita

Buona pratica di Laboratorio: insieme di regole riguardanti le procedure e le condizioni con cui, sono programmate, eseguite, controllate, registrate e archiviate le ricerche di laboratorio (non necessariamente con agenti biologici). Il fine delle norme di Buona Pratica è la promozione della qualità della sperimentazione "non clinica" e la produzione di dati sperimentali affidabili per garantire il mutuo riconoscimento dei risultati ottenuti a livello internazionale. Include gli aspetti legati all'esecuzione di prove in sicurezza per gli operatori, ed insieme a norme più specifiche, anche norme di base

Norme generali:

• Organizzazione spazi di lavoro: l'ambiente di lavoro deve essere conservato pulito e decontaminato. Le superfici di lavoro, gli arredi e le attrezzature devono esser opportunamente e regolarmente decontaminati.
• Abbigliamento e DPI: idoneo

utilizzo di guanti e altri DPI. I guanti e il camice vanno rimossi al di fuori dellaboratorio e i guanti mai usati per toccare oggetti che voi o altri potrebbero usare senza (inclusi telefonicellulari). Norme di igiene: frequente lavaggio delle mani. Fare attenzione a non toccare faccia e capelli quando si indossano i guanti. Gestione taglienti: gli oggetti taglienti vanno smaltiti nei contenitori appositi. Gli aghi non devono mai essere ricappucciati. Non raccogliere mai i vetri rotti con le mani. Etichettatura idonea Laboratorio di Biocell Biocompatibilità: è l'abilità di un biomateriale di svolgere la sua funzione desiderata nel rispetto di una terapia medica, senza causare effetti locali o sistemici indesiderati nel ricevente della terapia ma sviluppando la più appropriata e benefica risposta cellulare o tissutale in una specifica situazione e ottimizzando il risultato clinico di quella terapia. In realtà la

biocompatibilità è un fenomeno complicato, in cui intervengono diversi fattori che dipendono dal materiale ma anche dalla forma, dimensione, proprietà fisiche, chimiche e meccaniche, durabilità, eventuale degradazione, sito di impianto, specie e anche singolo soggetto. Nel laboratorio di Biocell si caratterizzano nuovi materiali, soprattutto dal punto di vista della citotossicità.

Spesso si considera l’effetto del biomateriale sull’ambiente biologico ma non il viceversa; il corpo non è un ambiente favorevole ai materiali e contiene molte sostanze aggressive (cloruri su acciai), con la tendenza a eliminare elementi estranei. Gli effetti del biomateriale sull’ospite e dell’ospite sul materiale sono ciclici fino all’equilibrio o alla rimozione.

Anche se solo i testi clinici possono dare indicazioni quasi definitive, è ovviamente necessario sviluppare dei modelli di verifica di materiali e dispositivi. Il processo

Il regolatorio comprende test in silico, in vitro, in vivo o trial clinici. I test in silico sono un settore in espansione negli ultimi anni; più sono precisi, come quelli in vitro, migliori risultati si ottengono come rappresentazione della realtà. I test in vitro si usano per validare i materiali ma anche per studiare l'interazione degli stessi con le cellule e per i meccanismi cellule-tessuti. Sia FDA che ISO richiedono che i produttori di dispositivi impiantabili sottopongano i loro prodotti ad una serie di test preclinici sulla sicurezza del dispositivo. Il numero e il tipo di test richiesti dipendono dal dispositivo, dal materiale e dall'uso previsto. Le norme sono molto articolate e ogni parte considera diversi aspetti del fenomeno di biocompatibilità.

ISO 10993-1:2009 - Biological evaluation of medical devices Parti 1-20

• Parte 2 - Animal welfare requirements
• Parte 3 - Tests for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity

• Parte 4: Selection of tests for interactions with blood
• Parte 5: Tests for in vitro cytotoxicity
• Parte 6 - Tests for local effects after implantation
• Parte 7 - Ethylene oxide sterilization residuals
• Parte 9 - Framework for identification and quantification of potential degradation products
• Parte 10: Tests for irritation and delayed-type hypersensitivity
• Parti 13-15- Identification and quantification of degradation products from medical devices
• Parte 17: Establishment of allowable limits for leachable substances
• Parti 18-19 Chemical, physico-chemical, morphological and topographical characterization of materials

Di tutti i test, molti sono in vitro; alcuni di quelli più diffusi sono irritazione, infiammazione severa, tossicità locale e sistemica, pirogenicità, sensibilizzazione, infezione (adesione batterica), coagulazione, cancerogenicità e mutagenicità.

In vitro si possono anche testare e combinare.

materiali (dal punto di vista chimico), forma, dimensioni, morfologia superficiale, degradazione, stabilità, sito di impianto, specie e soggetto.

I test si eseguono con cellule animali o batteriche. Le cellule animali non sono in grado di sopravvivere autonomamente al di fuori del loro organismo. Le cellule isolate da organismi pluricellulari sono difficili da mantenere in vita, ma le condizioni per farlo sono state identificate per diverse tipologie cellulari e in molti casi sono abbastanza standard. Per garantire la sopravvivenza si deve:

• Somministrare tutte le sostanze necessarie (aminoacidi, zuccheri, lipidi, vitamine, ioni etc.)
• Controllare i parametri ambientali: temperatura, pH, concentrazione di O2 e CO2
• Usare un supporto di adesione adeguato (per la maggior parte delle tipologie cellulari)

Il terreno di coltura contiene sali inorganici che forniscono ioni necessari alle funzioni cellulari (Na+, Cl-, K+, Mg++...), glucosio (funzioni metaboliche),

amminoacidi (sintesi proteica), vitamine e siero (fonte di proteina e di fattori di crescita per la proliferazione). Questi sono gli elementi principali, poi ci possono essere delle variazioni a seconda della famiglia cellulare considerata; ci sono vere e proprio industrie che commercializzano i terreni di coltura che vengono venduti con le rispettive schede di descrizione. Il terreno è sempre tamponato perché contiene un indicatore visivo di PH (rosso fenolo) che varia da giallo (per acido) a rosso-viola (basico); il PH è circa di 7.4. Quando il terreno è fuori dall'incubatore, si vedrà sempre basico. L'incubatore mantiene delle condizioni costanti, in particolare la percentuale di anidride carbonica al 5% ma anche temperatura, umidità e concentrazione di altri gas. Alcuni puristi preferiscono non usare il rosso fenolo perché, seppure non abbia particolari effetti, comunque sicuramente modifica il terreno di coltura. Nella

La maggior parte delle colture, alle cellule in sospensione viene applicato un supporto; la maggior parte delle colture in vitro si fanno sul polistirene, un materiale comune, facile da lavorare e abbastanza idrofobico, per cui viene lavorato per essere più idrofilico (viene bagnato meglio quando si mettono le cellule), tramite metodi corona o plasma per incorporare ossigeno. Si chiama TCPS proprio per questo motivo; si trova in piastre di Petri di varie dimensioni, flasks (anche con tappo) o piastre multi-layers. Negli esperimenti, non si considerano le cellule adese al fondo perché possono essere compromesse. Ci sono anche sistemi di coltura specifici con stimolazioni dinamiche (meccaniche, elettriche...). Le cellule sono sempre un modello limitato rispetto a un tessuto/organo reali; la visione è sempre ridotta rispetto alla realtà e bisogna riconoscerne i limiti. Idealmente si usano cellule direttamente isolate dal tessuto, dette primarie; esse però.sono in grado di effettuare un numero limitato di divisioni in vitro e vanno velocemente incontro a senescenza (indipendentemente dalle adeguate condizioni di ambiente e di nutrizione). Questo limita la possibilità di avere b