Appunti del corso di Fondamenti di biologia molecolare

CARATTERISTICHE COMUNI DEL T-RNA

- Tutti i t-RNA possono entrare nel

sito A (sito amminoacidico del ribosoma)

che nel sito P (sito peptidico del ribosoma),

tutti tranne uno, ovvero il t-RNA iniziatore

che può entrare solo nel sito P, e non nel

sito A.

- Sono tutti riconosciuti dal fattore di

allungamento ETF (elongation factor T)

tranne il t-RNA iniziatore che è l’unico ad

essere riconosciuto dal fattore di inizio IF2

- I t-RNA che caricano lo stesso

amminoacido (quindi sono t-RNA affini)

vengono detti isoaccettori. Esistono 20 classi di isoaccettori e ciascuna classe carica uno specifico amminoacido.

Esistono 20 classi di enzimi che caricano l’amminoacido sulla specifica classe di t-RNA isoaccettore e sono detti

amminoacil -t-RNA sintetasi

STRUTTURA DEL T-RNA

Nella struttura secondaria possiamo rilevare una serie di bracci che si formano per complementarità intra-catena.

1. il primo braccio è detto braccio accettore perché all’ultima adenosina che ha l’estremità 3’OH libera, si lega

l’amminoacido. In questo braccio ci sono delle basi appaiate e una piccola sporgenza che è l’estremità 3’ del t-RNA in

cui c’è una tripletta presente in tutti i t-RNA che è ACC. Il legame dell’amminoacido al t-RNA avviene in 3’, ma è

sempre in equilibrio con la posizione 2’, quindi potrebbe passare dalla posizione 3’ a 2’

2. braccio D: presenta una diidrouridina, una base insolita. In questa regione ci sono basi appaiate per complementarità

intra-catena ed è anche presente un loop/ansa piccola a singolo filamento

3. braccio dell’anticodone: in cui ci sono delle basi appaiate che formano lo stelo della forcina ed è poi presente un loop

di basi non appaiate che continente la tripletta dell’anticodone che poi si appaierà con il codone del trascritto

4. Una regione chiamata “braccio extra” che può avere dimensioni diverse, da 3 nucleotidi fino ad arrivare anche a 20

nucleotidi. In base alla lunghezza di questa regione i tRNA vengono raggruppati in due classi differenti:

• Classe 1: braccio extra piccolo di 3/5 ribonucleotidi 75% dei t-RNA

• Classe 2: braccio extra di 13/21 ribonucleotidi.

5. nella sequenza di t-RNA, alcune posizioni sono altamente conservate quindi nel 90-95% dei t-RNA sequenziali si

ritrova quella base in quella posizione. Altre sono semi-conservate detto PU e indicano che in quella posizione può

trovarsi una delle due purine (A, G) o PY (una delle due pirimidine C, U).

6. più a valle del braccio extra abbiamo il braccio della TΨC: è una tripletta particolare perché c’è una timidina che non

dovrebbe esserci nell’RNA e c’è anche un’altra base insolita, ovvero la pseudouridina

7. I t-RNA sono caratterizzati da una serie di basi insolite, di solito queste vengono modificate e rese insolite per una

modificazione post-trascrizionale. Quindi il trascritto ha basi normali, alcune di queste vengono modificate

Le basi insolite servono per farlo ripiegare: l’info per le strutture secondarie e terziarie risiede sempre nella sequenza, e vale

anche per le proteine, per la quale risiede nella sequenza amminoacidica. La stessa cosa vale per gli acidi nucleici, possono

assumere strutture particolari grazie alla sequenza nucleotidica.

Oltre alla struttura secondaria abbiamo quella terziaria che forma una “L capovolta”. In questa struttura

• Braccio accettore (per l’amminoacido)→ all’estremità di un braccio

• Braccio dell’anticodone (che dovrà interagire con il codone)→ all’estremità dell’altro braccio

Quando il tRNA si localizza nel ribosoma il braccio dell’anticodone deve

essere vicino al codone mentre il braccio accettore deve essere in

prossimità della subunità ribosomiale grande, perché l’enzima che catalizza

la formazione del legame peptidico o carbo-ammidico risiede proprio nella

subunità ribosomiale grande, quindi la struttura terziaria comunque fa sì

che i due siti importanti per la sintesi proteica (braccio anticodone e

braccio accettore) siano da parti opposte perché devono interagire con siti

catalitici diversi (uno localizzato verso la sub piccola e l’altro verso la

grande).

Nella struttura secondaria si formeranno legami H detti secondari; nella

terziaria quando si ripiega la catena su sé stessa, si formeranno legami H

terziari. Le basi coinvolte sono basi altamente conservate o semi-

conservate. Altrimenti non potrebbero avere simili strutture tutti i t-RNA.

Punti di contatto dell’enzima amminoacil -t-tRNA-sintetasi con il t-tRNA:

1. Gambo accettore

2. Gambo anticodone (che si trova dalla parte opposta)

3. Gambo D

I t-RNA isoaccettori vengono riconosciuti dallo stesso enzima, ovvero dalla stessa amminoacil t-RNA sintetasi e che

costituiscono 20 classi, per ogni classe c’è un enzima specifico.

Gli isoaccettori possono avere:

• Lo stesso anticodone: ed essere diversi in altre regioni della stessa sequenza oppure

• Anticodoni diversi: questo serve a riconoscere, pur avendo lo stesso aa, codoni simili (famiglie di codoni che

possono essere a 6,4 o 2 codoni che codificano per lo stesso aa)

Ci sono alcuni codoni leggermente differenti gli uni con gli altri, che differiscono solo per la terza posizione; questi

costituiscono le famiglie di codoni che codificano per lo stesso amminoacido, ma essendo leggermente diversi possono

appaiarsi con tRNA che hanno anticodoni differenti in modo da stabilire un appaiamento specifico. Esistono 61 codoni diversi

che codificano per i 20 amminoacidi; quindi, dovrebbero esserci anche 61 tRNA con anticodoni specifici per ogni codone. In

realtà nel citosol ci sono solo 32 tRNA perché per l’ipotesi del “vacillamento” è possibile che l’estremità 5’ dell’anticodone del

tRNA riconosca diversi tipi di codoni.

Base base del codone ipotesi di vacillamento: base 5’ anticodone può appaiarsi in modo meno

dell’anticodone specifico con base 3’ codone

G U o G

C G In 5’ appaiamenti permessi: hanno distanze ribosio-ribosio vicine a quelle

In 3’ U A o G standard

A U

I (inosina)- Posizione A, U o C

di vacillamento

Grazie a questi appaiamenti (quelli non specifici riportati in tabella) e soprattutto agli appaiamenti non specifici sono sufficienti

solo 32 tRNA per decodificare i 61 possibili codoni.

COME VIENE CARICATO L’AMMINOACIDO SUL T-RNA

L’enzima lega 3 strati

1. ATP

2. t-RNA

3. amminoacido

Vi sono varie classi di enzima che differiscono nella struttura:

• Alcuni sono costituiti da una sola subunità e quindi sono dei monomeri

• altri sono formati da due subunità e quindi sono dei dimeri, altri sono costituiti da 4 subunità e quindi sono

dei tetrameri

• altri sono costituiti da due diverse subunità e quindi sono degli eteromultimeri

per far avvenire il caricamento dell’amminoacido sul t-RNA

1. L’aa deve essere attivato, e quindi reagisce con una molecola di ATP formando amminocil -adenilato

→

Recap: aa + ATP amminocil-adenilato

perché il gruppo carbossilico dell’amminoacido compie un attacco nucleofilo sul fosfato in alpha dell’ATP formando

un legame fosfo-anidridico

2. L’amminoacil-adenilato a questo punto deve agire grazie all’enzima con il t-RNA. Quindi viene trasferito sulla

posizione 3’ dell’ultimo ribonucleotide del t-RNA che è una adenosina (tripletta ACC) viene trasferito l’aa quindi si

rompe il legame con l’AMP e tutto il gruppo si rompe e si trasferisce sull’estremità 3’OH; il legame tra t-RNA e aa è un

legame estereo perché c’è il gruppo carbossilico: si forma amminoacil-t-RNA con liberazione di AMP

Per caricare l’amminoacido sul tRNA è necessario rompere 2 legami energetici:

• Il legame tra alpha e beta

• Il legame nel pirofosfato

In questo modo si forma un legame estereo che si romperà solo quando l’amminoacido dovrà formare un legame

carboamidico CO-NH tra il proprio gruppo carbossilico e il gruppo ammidico di un altro amminoacido. Quando si romperà il

legame estereo per formare il legame carboamidico non sarà necessario fornire energia al sistema perché il legame

carboamidico è un legame più stabile rispetto a quello estereo

COME SONO TRASCRITTI I T-RNA

I t-RNA sono trascritti nella forma di un grande RNA precursore che può contenere fino a 7 molecole di t-RNA diversi che però

necessita di essere processato, infatti subirà un processing. Già nel precursore i t-RNA assumono la loro struttura secondaria.

Esiste già la complementarità intra-catena. Quindi già nel momento in cui vengono trascritti si forma la struttura secondaria

tipica a quadrifoglio.

• Nel processing interviene un enzima detto RNAasi P che taglia tutte queste molecole di t-RNA a livello di

→

ogni estremità 5’ ci sono 7 RNA e quindi avvengono 7 tagli in 5’ del t-RNA. RNAasi P è particolare:

ha 1 piccolo RNA di circa 400 nucleotidi e una proteina di circa 20.000 dalton. Si è capito che l’attività

catalitica di questo enzima, non risiede nella proteina che ha solo funzione di supporto, ma risiede proprio

nel piccolo RNA. Quindi questo enzima è stato chiamato ribozima perché l’attività catalitica risiede nel RNA.

• Una volta tagliata l’estremità 5’, otterremo una serie di frammenti. Ciascun frammento subisce un’altra

degradazione partendo dall’estremità 3’ da parte di un altro enzima detto RNAasi D che inizia a degradare

partendo dall’estremità 3’ finché non incontra la tripletta ACC e lì si ferma perché tutti i t-RNA hanno alla loro

estremità 3’ la tripletta ACC. - Nel momento in cui la tripletta dovesse essere mangiata dall’RNAasi D,

interviene un enzima detto nucleotidil-ACC-transferasi che ha il compito di ripristinare la tripletta ACC

all’estremità 3’ del RNA.

IL CODICE GENETICO

Esperimenti cha hanno portato alla decodificazione del codice genetico :

I primi esperimenti per decodificare il codice genetico si sono svolti grazie a molecole di RNA e un enzima chiamato

polinucleotide-fosforilasi che in presenza di fosfato degrada l’RNA in ribonucleotidi-difosfato NDP. Questa reazione di

degradazione è anche reversibile; agendo sulle concentrazioni dei ribonucleotidi-difosfato è possibile andare verso la sintesi di

RNA. A seconda dei nucleotidi-difosfato che sono presenti nell’ambiente di reazione si ottengono catene di RNA costituite da

nucleotidi diversi. Ad esempio:

• Partendo da ADP