Appunti completi Tossicologia

Principi di tossicologia

La tossicologia è stata per secoli una scienza descrittiva che si occupava della valutazione degli effetti avversi causati da una serie di sostanze naturali e artificiali. Attualmente si focalizza sullo studio del meccanismo cellulare e molecolare alla base degli effetti avversi.

Occorre distinguere il concetto di rischio e quello di pericolo. Il pericolo è una caratteristica intrinseca di ogni sostanza che è funzione della sua tossicità, il rischio è invece la probabilità dell’incorrere nell’effetto tossico, esso dipende quindi dalla tossicità della sostanza ma anche dell’esposizione. Da ciò ne deriva che se non siamo direttamente esposti ad una sostanza, anche se estremamente pericolosa, per noi non rappresenta un rischio. La diossina (TCDD) ad esempio è una sostanza molto pericolosa, ma il rischio a cui noi siamo soggetti è basso; similmente, la lebbra è molto pericolosa perché ha quasi sempre esiti gravi, ma è poco rischiosa perché ha bassa contagiosità.

Il pericolo di una sostanza, ovvero la capacità intrinseca di causare effetti avversi, è strettamente legato alla dose e al bersaglio biologico. Per ogni sostanza può quindi essere definito un limite di sicurezza, indicato con NOAEL (No Observed Adverse Effect Level).

L’identificazione di una sostanza tossica oggi non viene più fatta mediante l’osservazione degli effetti avversi, ma viene fatta a priori con una serie di approcci differenti:

• Approccio in silico, ossia lo studio della relazione tra struttura e attività. Questo tipo di approccio, più che in tossicologia, è molto rilevante in farmacologia e in chimica farmaceutica, dove è già chiara l’interazione della sostanza con un recettore. Se una sostanza dal punto di vista farmacologico risponde molto bene ad uno studio struttura attività, allora sarà efficace. In tossicologia questo approccio è sconveniente, perché solitamente la sostanza tossica non va a colpire una particolare proteina, ma un insieme di proteine.
• Raccolta di dati tossicologici in vitro, questo approccio si basa su dati sperimentali ottenuti in vitro che forniscono informazioni basilari sui meccanismi d’azione della tossina. I dati ottenuti con questo approccio sono validi e possono quindi essere usati nelle prime fasi dell’identificazione del tossico, ma non sono particolarmente rilevanti da un punto di vista regolatorio.
• Studi tossicologici su modelli animali, questo approccio rappresenta un passaggio obbligatorio da un punto vista regolatorio. Nell’ambito sanitario, infatti, la sperimentazione sugli animali è richiesta da leggi internazionali per l’approvazione di farmaci, pesticidi e biocidi. Sono poche le categorie di sostanze che possono essere commercializzate senza sudi sugli animali, come i cosmetici.
• Dati ottenuti sulla popolazione, dove possibile (per esposizione inconsapevole, non riguarda sostanze sintetiche solitamente, può accadere con sostanze che non hanno seguito il corretto iter di sperimentazione).

Dopo aver identificato l’effetto avverso, con questi differenti approcci, sarà necessaria la caratterizzazione della molecola. Sarà quindi necessario capire dove agisce, a quale dose è attiva, l’effetto dose risposta, le differenze tra specie e magari le differenze di carattere cinetico all’interno di una stessa specie, quindi in generale si cercherà di capire il suo meccanismo d’azione.

Esposizione e rischio

Una volta ottenute tutte le informazioni necessarie, ci si occupa dell’esposizione, cioè della quantità di sostanza necessaria affinché si sviluppi l’effetto avverso. Ad esempio, parlando di un contaminante del grano, le popolazioni del Mediterraneo, che mangiano molto pane, pasta e pizza, saranno più esposte rispetto alla popolazione scandinava. È necessario anche tenere in considerazione l’effetto su una determinata parte della popolazione, in base alla fascia d’età, al sesso… oppure semplicemente il differente consumo o esposizione alla sostanza in base alla localizzazione. In base a tutte le informazioni raccolte su pericolo ed esposizione, si avrà una risposta in termine di rischio a cui la popolazione è esposta. Il pericolo è qualcosa di intrinseco alla sostanza mentre il rischio è strettamente legato all’esposizione.

È inoltre importante considerare quale è il tipo di sostanza, nel caso di farmaci o anti-tumorali si accetta il rischio di eventi avversi (gli anti-tumorali sono essi stessi cancerogeni).

In generale ricordiamo che il concetto di tossicità è estremamente legato al concetto di dose, come dice Paracelso infatti: “Tutto è veleno, e nulla esiste senza veleno. Solo la dose fa in modo che il veleno non faccia effetto”.

Classificazione delle sostanze tossiche

In tossicologia è molto importante distinguere il concetto di tossina da quello di sostanza tossica (tossico).

• Una tossina è una sostanza o un agente di origine naturale, cioè prodotto da animali, piante, miceti… che manifesta effetti tossici sull’uomo, in genere particolarmente marcati.
• Una sostanza tossica, o più semplicemente tossico, è invece una sostanza prodotta direttamente o indirettamente (non è la sostanza sintetica ma un suo metabolita) dall’uomo. Tra le sostanze tossiche vanno anche annoverate le sostanze naturali che vengono rese tossiche da parte dell’uomo per trasformazione. In questa fattispecie si fa riferimento ai metalli, componenti naturali della crosta terrestre con cui spesso si entra involontariamente in contatto.

Le sostanze tossiche possono anche essere classificate in funzione dello stato fisico, della classe chimica di appartenenza, del meccanismo d’azione, del target biologico. Quando parliamo di sostanze tossiche o di tossine dobbiamo tenere a mente che parliamo di sostanze a cui l’essere umano è esposto sin dalla nascita, e a cui sarà esposto per tutta la durata della sua vita. Le tossine fanno infatti parte della nostra vita quotidiana in quanto possono essere ritrovate negli agenti chimici industriali, nei pesticidi (agrofarmaci) e da essi negli alimenti. Altre sostanze tossiche con cui veniamo quotidianamente in contatto possono essere presenti in farmaci, cosmetici (trucchi, ma anche prodotti per l’igiene come saponi, creme…) e prodotti per la casa. Non dobbiamo poi dimenticare i tossici naturalmente presenti nell’ambiente che ci circonda, e quindi metalli pesanti, IPA, policlorobifenili… che possono derivare, ad esempio, dall’incendio di una foresta (da cui vengono prodotti e rilasciati nell’aria una serie di IPA e diossine).

Curva dose risposta

La definizione di una relazione tra dose ed effetto tossico è illustrata tramite la costruzione di curve dose risposta. Esse sono utili ad identificare la massima dose che non produce alcun effetto tossico e le varie dosi che, al contrario, hanno effetto tossico.

Da un punto di vista biologico, la curva sigmoidea è quella più diffusa, alcune volte però si può avere anche un andamento di tipo lineare, in cui l’aumento della dose porta ad un aumento lineare dell’effetto. Questo genere di curva è detto monotonica, la quale seppur con andamento non lineare, procede verso un’unica direzione.

In tossicologia sono frequenti curve non monotoniche, le quali hanno aumenti e diminuzioni della risposta, che si vanno a ripetere. Le curve a U possono essere pericolose nel momento in cui si pensa di testare gli effetti prodotti da una certa sostanza. Supponiamo di testare un farmaco che presenta una curva dose risposta a U come quella sotto riportata, di iniziare i nostri studi dalla dose di 50 mg/ml e di aumentarla man mano. In questo caso saremmo indotti a pensare che la dose di 50 mg/ml non ha effetto e che gli effetti insorgono aumentando linearmente la dose. Commetteremmo però uno sbaglio, in quanto manca la descrizione di tutte le dosi minori che, nella realtà dei fatti e differentemente da quanto possiamo immaginare, hanno lo stesso effetto tossico della dose massima di 90 mg/ml. I grafici con andamento bifasico sono molto utilizzati nello studio dei distruttori endocrini, ci sono infatti gruppi di scienziati che sostengono che alcune sostanze, reputate sicure per quanto riguarda il loro potenziale di distruttori endocrini, sono state in realtà valutate in zone di dose limitate e probabilmente, se si fosse scesi a dosi più basse, si sarebbero scoperti effetti diversi.

La curva a U è tipica di alcuni nutrienti essenziali come il cobalto (la cui curva a U è quella usata nell’esempio precedente). Il cobalto ha infatti una dose fisiologica per l’organismo priva di effetto tossico, ma sia la carenza che un suo eccesso danno luogo a tossicità, in un caso si andrà incontro ad anemia, nell’altro a patologie di tipo cardiaco.

Un altro tipo di curva è quella a U invertita, spesso associata al fenomeno della tolleranza. In generale, risulta molto pericoloso condurre degli studi su una sostanza che non si conosce avente un grafico di questo tipo, in quanto si potrebbe perdere un’intera parte del grafico e pensare invece di avere un quadro completo. Per quanto riguarda il concetto di tolleranza si può fare l’esempio di un fatto avvenuto qualche tempo fa, il caso degli estrogeni negli omogenizzati per i bambini. Anni fa il bestiame, la cui carne era utilizzata per produrre gli omogenizzati, era trattato con estrogeni per far aumentare la massa. Gli estrogeni residuavano però nella carne di questi animali e andavano quindi a finire negli omogenizzati per i bambini. Andando a valutare la dose 10 o la dose 1000 si otteneva quindi un’assenza di effetti tossici che poteva indurre a pensare che le dosi intermedie erano accettabili. Cosa che invece si dimostrò falsa in quanto l’effetto tossico avveniva proprio in questo gap.

In base a ciò che è stato detto fino ad ora possiamo dire che l’utilità del concetto di dose risposta risultava essere particolarmente importante in precedenza, quando la tossicologia si occupava prevalentemente degli effetti avversi e della tossicità dei farmaci. La curva dose risposta era infatti importante per poter maneggiare al meglio i farmaci, in particolare per valutare l’indice terapeutico.

Una dose particolarmente importante è la LD50, ossia la dose letale per il 50% dei soggetti sottoposti al trattamento. Essa si riferisce ad effetti acuti ed è un parametro assoluto, non valuta l’evoluzione della patologia ma semplicemente il numero di decessi, non dando informazioni sul manifestarsi degli effetti o su quali organi o proteine va ad agire. Inoltre la tossicità di una certa molecola non è esclusivamente legata alla mortalità; ad esempio, per la nicotina, la sua tossicità è molto più legata agli effetti che la sostanza causa nel lungo termine piuttosto che alla mortalità indotta dall’essere in contatto con una specifica dose. In questo caso si cerca di disegnare la curva, identificare la mortalità del 50% ed estrapolare la dose corrispondente. È molto importante che questo parametro sia il più lontano possibile dalla ED50, ovvero la dose efficace nel 50% dei soggetti. Questo concetto è particolarmente importante dal punto di vista pratico, infatti se un paziente con un metabolismo non idoneo all’assorbimento di un farmaco o semplicemente più lento dovesse ricevere dal medico un dosaggio sbagliato, potrebbe andare incontro ad effetti tossici prima, con conseguente effetto negativo, in quanto la curva del singolo soggetto è diversa.

Nel tempo per avere una maggiore sicurezza si sono accostatati a questi parametri la LD1, ovvero la dose che causa la mortalità dell’1% del gruppo trattato, e la ED99, ossia la dose capace di provocare un effetto benefico nel 99% della popolazione trattata. Oggi in realtà per i farmaci non si usa più il termine di letalità ma di dose in grado di produrre tossicità, visto che tutti i composti possono essere tossici a dosi errate. Ad oggi, con i nuovi parametri, la validità di una serie di farmaci approvati verrebbe messa in discussione. Un esempio su tutti è quello dei digitalici, che presentano un indice terapeutico troppo vicino a quello tossico, rendendo pericoloso il loro utilizzo.

Tossicità

La tossicità (T) è funzione della concentrazione della sostanza che stiamo analizzando (c) o molto spesso dei suoi metaboliti, ma anche del numero di bersagli endogeni (R) e dell’affinità (Arc) per tali bersagli (anche il ruolo del bersaglio nella cellula fa la differenza): T=c*R*Arc

Come concentrazione della sostanza ovviamente possiamo considerare anche quella dei metaboliti che da essa derivano, in alcuni casi infatti il metabolismo attiva sostanze che di per sé sarebbero inerti. A tutto ciò va aggiunto che il bersaglio deve essere raggiungibile dalla sostanza in questione. Per esempio, il DNA è un bersaglio abbastanza comune per molte sostanze tossiche, soprattutto perché ricco di siti nucleofili dati dalle proteine che lo rivestono, ma viene salvaguardato da diverse strutture cellulari. Una sostanza per poterlo raggiungere deve quindi attraversare una serie di membrane, come quella citoplasmatica e nucleare. Di conseguenza esso risulta essere molto meno sensibile di quanto ci si potrebbe aspettare.

Ricordiamo, inoltre, che la concentrazione al bersaglio è correlata alla dose esterna, quindi a quanta sostanza stata somministrata o a cui si è esposto il soggetto.

Parametri tossicologici

Un primo parametro è la dose, concetto già ampiamente visto dei paragrafi precedenti.

Un secondo parametro ancora da esplorare è la via di somministrazione o via di esposizione; infatti nel caso di tossici spesso si tratta di esposizioni involontarie (come nel caso di agenti tossici ambientali o di contaminanti alimentari). Alcune vie di esposizione possono però essere sia volontarie che involontarie, in quest’ultimo caso avvengono principalmente per via orale, via cutanea e inalatoria. La via orale e quella cutanea portano a bassi valori di biodisponibilità, quindi anche di tossicità. Un aspetto importante legato all’esposizione alla tossicità è il fatto che questa esposizione è spesso inconsapevole e quindi può essere molto prolungata nel tempo.

Altri parametri importanti sono poi la durata dell’esposizione e la frequenza dell’esposizione. Per quanto riguarda la frequenza di esposizione si parla in generale di tempi di esposizione e di solito si fa una distinzione tra tossicità acuta, subacuta, subcronica e cronica.

In generale è bene fare anche una distinzione a seconda che si parli di modello umano o di modello animale. Di solito una somministrazione acuta nell’animale è intesa come una somministrazione singola in un lasso di tempo inferiore alle 24 ore. Mentre quando parliamo di subacuto, subcronico e cronico, negli studi sugli animali, di solito intendiamo che l’animale è stato esposto alla sostanza in esame per diversi mesi continuativamente. Talvolta, soprattutto negli studi che forniscono informazioni riguardo la tossicità a lungo termine o la cancerogenesi, si parla anche di esposizioni di diversi anni.

Nel caso di tossicità cronica sulla riproduzione, viene fatta un’esposizione ai due animali genitori e mantenuta l’esposizione durante la gravidanza e anche ai figli.

Per lo studio sui farmaci invece una somministrazione nell’animale della durata di 6 mesi è da ritenersi più che sufficiente.

Nel caso di una tossicità acuta si suppone che una singola dose sia in grado di superare la soglia di tolleranza dell’organismo manifestandosi con un effetto acuto, molto vicino all’esposizione entro qualche ora o giorno; l’intensità della manifestazione acuta inoltre permette di fare il collegamento sostanza-tossicità mentre nella somministrazione cronica si ha una tossicità cumulativa, data dall’accumulo della sostanza nell’organismo.

In aggiunta all’accumulo di sostanza va anche considerato l’accumulo di un danno. Nel caso di una singola esposizione ad una sostanza dannosa, l’organismo riesce a gestirla e riparare il danno, se però l’esposizione è continua questo non può avvenire e a lungo andare si trasforma nell’effetto tossico.

Per quanto riguarda la durata dell’esposizione vediamo che può essere classificata in diversi modi. Abbiamo infatti esposizioni brevi (volontarie e involontarie) di cui si occupa la tossicologia clinica, esposizioni di tipo occupazionale e esposizioni croniche. Le esposizioni occupazionali sono quelle legate alla professione, esse hanno una durata media visto che di norma un individuo non svolge uno stesso lavoro o una stessa mansione per tutta la sua vita e perché attualmente si adottano una serie di presidi di protezione, di questo tipo di esposizione solitamente si occupa la medicina del lavoro. L’esposizione cronica invece è un’esposizione di lunga durata, legata quindi a sostanze con cui entriamo a contatto nella nostra quotidianità, come additivi alimentari, sostanze presenti nell’acqua, nell’atmosfera… Di essa se ne occupa la tossicologia sperimentale e in parte l’epidemiologia. In questi casi le concentrazioni in gioco sono molto basse, ma si potrebbe avere un effetto cumulativo, nel caso di ripetuti contatti con lo stesso agente tossico.

Livelli di esposizione