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Appunti tossicologia

Appunti di tossicologia basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Campolongo dell’università degli Studi La Sapienza - Uniroma1, facoltà di Farmacia, Corso di laurea magistrale in farmacia. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Tossicologia docente Prof. P. Campolongo

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 Riassorbimento passivo degli ioni: dato che vi è un riassorbimento di ioni e che l’acqua lascia il fluido

tubulare per osmosi, le concentrazioni di altri soluti presenti nel fluido tubulare tendono ad aumentare.

Se le cellule del tubulo sono permeabili a tali soluti, essi tenderanno a passare attraverso le cellule e ad

entrare nel fluido peritubulare mediante diffusione passiva. L’urea, gli ioni cloruro e le sostanze

liposolubili sono fra le sostanze che possono diffondere all’esterno del TCP proprio in questo modo.

Questa diffusione riduce la concentrazione degli stessi soluti all’interno del fluido tubulare e promuove

un ulteriore assorbimento osmotico di acqua.

 Secrezione: nel TCP si verifica anche un’attiva secrezione.

Il riassorbimento di sodio gioca un ruolo chiave per tutti i processi che seguono. Gli ioni sodio possono

entrare nelle cellule tubulari mediante diffusione attraverso canali del sodio, co-trasporto mediato dal

glucosio o da aminoacidi o da altri soluti organici, o mediante contro-trasporto con ioni idrogeno.

All’interno delle cellule tubulari, gli ioni sodio diffondono verso la membrana basale che, in queste cellule è

dotata di una pompa di scambio sodio/potassio che espelle gli ioni sodio e assorbe i potassio dall’ambiente

extracellulare. Gli ioni sodio così riassorbiti diffondono nei capillari peritubulari. Circa il 60-70% del volume

di filtrato prodotto nel glomerulo viene riassorbito prima che il fluido tubulare raggiunga l’ansa di Henle, la

quale ha il compito di riassorbire circa la metà dell’acqua e circa i due terzi degli ioni sodio e cloro che sono

rimasti nel fluido tubulare. Tale riassorbimento si effettua efficacemente secondo il principio dello scambio

in contro-corrente. Il tratto sottile discendente e quello spesso ascendente dell’ansa sono molto vicini tra

loro separati soltanto dal fluido peritubulare. Lo scambio che avviene fra questi due segmenti viene definito

moltiplicazione in contro-corrente. Il termine contro-corrente si riferisce al fatto che lo scambio si attua tra

fluidi che si muovono in direzioni opposte: il fluido tubulare nel tratto discendente si sposta diretto verso la

pelvi renale, mentre il fluido del tratto ascendente è diretto verso la zona corticale del rene. Il termine

moltiplicazione è invece riferito al fatto che l’effetto dello scambio aumenta man mano che il fluido

procede nel suo decorso. I due segmenti paralleli dell’ansa hanno caratteristiche di permeabilità diverse. Il

tratto discendete sottile è permeabile all’acqua e relativamente poco permeabile ai soluti; il tratto

ascendete spesso, relativamente impermeabile ad acqua e soluti, possiede invece meccanismi di trasporto

attivo che pompano sodio e cloro dal fluido tubulare verso quello peritubulare della zona midollare. La

moltiplicazione in contro-corrente funziona mediante un semplice meccanismo a feedback positivo: il

pompaggio di soluti nel tratto ascendente porta a un aumento delle concentrazioni nel tratto discendente

che, in ultima analisi, accelera il pompaggio stesso del tratto ascendente. Il riassorbimento lungo il tubulo

contorto distale posto sotto il controllo dell’aldosterone favorisce una diminuzione della perdita di ioni

sodio con l’urina. Il tubulo contorto distale è il sito principale nel quale vengono riassorbiti gli ioni calcio.

3) Secrezione: è il trasporto, attraverso l’epitelio tubulare, di soluti dal fluido peritubulare verso quello

intratubulare. È un processo necessario perché la filtrazione non è in grado di forzare qualunque

molecola del plasma. La secrezione tubulare è dunque un processo che coadiuva la filtrazione

plasmatica nell’eliminazione di sostanze indesiderate. Inoltre è il processo di elezione per l’eliminazione

di alcune sostanze nocive come i farmaci.

Tutti questi processi cooperano alla produzione di un fluido diverso da tutti gli altri fluidi dell’organismo. 62

Il rene rimuove le sostanze tossiche dall’organismo con le stesse modalità utilizzate per la rimozione dei

prodotti finali del metabolismo fisiologico e, più precisamente, mediante:

 FILTRAZIONE GLOMERULARE

 DIFFUSIONE

 SECREZIONE TUBULARE

I capillari del glomerulo sono caratterizzati da pori abbastanza larghi e pertanto numerose sono le sostanze

chimiche filtrate a livello del glomerulo. Fanno eccezione molecole molto grandi (> 60000 kDa) o

strettamente legate alle proteine plasmatiche. Una volta che una sostanza tossica entra nel filtrato

glomerulare, può:

a) essere riassorbita passivamente dalle cellule tubulari, quando è caratterizzata da una elevata

lipofilia

b) rimanere nel lume tubulare ed essere eliminata quando ha le caratteristiche di un composto polare

Una sostanza tossica può anche essere escreta nelle urine attraverso i tubuli per diffusione passiva. Poiché

di norma le urine sono acide, questo meccanismo gioca un ruolo importante nell’eliminazione delle basi

organiche, che infatti risultano essere dissociate in tali condizioni di pH, e quindi non riassorbibili.

Per il motivo opposto, è molto difficile che gli acidi organici possano essere eliminati per diffusione passiva

attraverso le cellule tubulari. Alcune sostanze tossiche possono anche essere escrete nelle urine dalle

cellule del tubulo prossimale. Vi sono due diversi meccanismi di secrezione: uno per gli acidi organici, per

esempio i glucurono- e solfo-coniugati, e l’altro per le basi organiche. ⇒

Durante il processo di formazione delle urine, si ha riassorbimento di acqua aumento della

⇒ ⇒riassorbimento.

concentrazione dei soluti nell’urina gradiente di concentrazione urina-plasma Le

sostanze lipofile sono riassorbite più facilmente perché attraversano meglio lo strato cellulare dell’epitelio

tubulare. 63

ESCREZIONE

Dopo l’assorbimento e la distribuzione nell’organismo, le sostanze chimiche tossiche e non tossiche

vengono escrete tramite un processo più o meno lento. Gli xenobiotici possono essere eliminati tal quali o,

come già detto, come metaboliti o molecole coniugate.

L’escrezione degli xenobiotici e/o dei loro metaboliti può avvenire attraverso diverse vie:

 RENALE: è la via quantitativamente più importante

 BILIARE (o fecale): per diversi xenobiotici è la via principale

 POLMONARE: per sostanze volatili

 LATTE: quantitativamente poco importante ma rilevante dal punto di vista tossicologico

 ALTRE VIE: saliva, sudore

Le sostanze lipofile sono escrete più lentamente di quelle idrofile perché:

 sono più facilmente riassorbite nel tubulo renale (o nell’intestino in caso di eliminazione biliare);

 si accumulano nel tessuto adiposo

LA VIA RENALE: filtrazione glomerulare

I capillari glomerulari hanno una permeabilità molto elevata, anche perché hanno pori relativamente

grandi; il cut-off di peso molecolare è circa 60000. L’albumina e le proteine con PM più elevato non passano

nel filtrato; passano invece proteine con PM inferiore. Va sottolineato che sostanze nefrotossiche come la

puromicina, farmaco tripanosomicida, possono aumentare la permeabilità del glomerulo alle proteine

come l’albumina. Solo il farmaco libero, non legato alle proteina plasmatiche, passa nel filtrato glomerulare,

per diffusione. La concentrazione del farmaco è inizialmente uguale a quella plasmatica.

Nei tubuli, circa il 90% dell’acqua filtrata dai glomeruli viene riassorbita. Ciò determina la creazione di un

gradiente dal liquido tubulare al plasma che consente il riassorbimento dello xenobiotico.

L’entità del riassorbimento dipende dalla lipofilia dello xenobiotico stesso.

Per composti acidi e basi deboli, il riassorbimento varia in funzione del pH urinario. L’alcalinizzazione delle

urine (somministrazione di NaHCO ) comporta un aumento della velocità di escrezione di acidi deboli (es.,

3

salicilati, barbiturici); l’acidificazione delle urine (somministrazione di NH Cl) porterà all’aumento della

4

velocità di escrezione di basi deboli (es. amfetamine).

Alterazioni del pH urinario patologiche o indotte da farmaci (es. antiacidi) possono modificare la clearance

dei farmaci con possibile tossicità o insufficienza terapeutica.

La clearance è un parametro cinetico che esprime l’efficacia dei processi di eliminazione di un farmaco

dall’organismo. Può essere plasmatica o totale e viene definita come il volume di sangue o plasma da cui il

farmaco viene completamente eliminato nell’unità di tempo.

Per composti che non vengono secreti attivamente dai sistemi di trasporto, i valori di clearance renale

dipendono quindi da:

 legame alle proteine plasmatiche

 lipofilia (eventualmente dipendente dal pH)

Composti non legati alle proteine plasmatiche e fortemente idrofili (non riassorbiti) hanno valori di

clearance (renale) vicini a 130 ml/min (clearance dell’inulina)

La clearance renale di sostanze legate alle proteine plasmatiche e lipofile è compresa tra ~ 0 e ~ 130

ml/min.

Proteine a basso PM, passate nel filtrato glomerulare, sono riassorbite nel tubulo prossimale.

In alcuni casi queste proteine legano xenobiotici, esponendo le cellule tubulari a concentrazioni “elevate” di

questi xenobiotici. Un esempio è il cadmio legato alla metallotioneina (piccola proteina legante i metalli)

che con tale meccanismo porta a danno renale. 64

SISTEMI DI TRASPORTO TUBULARE

La funzione del sistema di trasporto

degli anioni è probabilmente quella

di eliminare i metaboliti coniugati

(glucuronidi, coniugati con

aminoacidi, solfati). Il sistema di

trasporto per gli anioni è saturabile,

come tutti i sistemi di trasporto. Può

essere inibito competitivamente: un

esempio è il probenecid che può

aumentare i livelli sierici di

penicillina, diminuendone la velocità

di eliminazione così da prolungarne

l’attività.

Esiste anche un sistema di trasporto

tubulare che riassorbe gli anioni (dal

lume tubulare al plasma). Questo

sistema è però più selettivo di quello

che opera dal plasma al lume, pertanto la maggior parte degli anioni secreti non viene riassorbita. Anche

questo sistema è saturabile ed è inibito dal probenecid.

Sistemi di trasporto per gli anioni simili a quelli renali (sensibili al probenecid) sono presenti anche in altri

tessuti ed organi (es. barriera emato-encefalica, ematooculare ecc).

L’escrezione renale varia in funzione di parametri come l’età e la presenza di patologie:

 In età neonatale molte funzioni renali non sono completamente sviluppate e alcuni xenobiotici sono

eliminati più lentamente, portando ad una maggiore tossicità rispetto agli adulti (es. penicillina). Al

tempo stesso, tuttavia si sviluppa una minore tossicità per composti nefrotossici secreti dai sistemi di

trasporto (es. cefaloridina).

 Insufficienza renale (IR): nell’IR cronica si ha una progressiva riduzione del numero dei nefroni

con e

funzionanti riduzione della clearance renale possibile tossicità dei farmaci se non si riduce la dose

o la frequenza di somministrazione. 65

LA VIA BILIARE O FECALE

È quantitativamente molto importante per molti xenobiotici. Come nel caso dell’escrezione renale anche

quella biliare dipende dal PM dei composti: l’escrezione biliare infatti è bassa per composti con basso PM

(<325 Da) e aumenta all’aumentare del PM. I coniugati con acido glucuronico e con glutatione sono

preferenzialmente escreti nella bile. I composti escreti con la bile possono essere riassorbiti nell’intestino,

rientrando nel circolo enteroepatico con aumento dell’emivita.

Glucuronidi e solfati, poco assorbiti, possono essere idrolizzati dalla flora batterica intestinale, liberando il

composto non coniugato, che può essere riassorbito.

La capacità secretoria epatica è non completamente sviluppata nei neonati, si avrà in tal caso una possibile

maggiore tossicità (es. ouabaina nota anche come strofantina).

I meccanismi della secrezione biliare non sono molto chiari. Sono coinvolti sistemi di trasporto attivo

(es., glicoproteina P e simili).

ESCREZIONE NEL LATTE

Quasi tutti i farmaci passano nel latte. Il passaggio dal plasma al latte avviene principalmente per diffusione

passiva, ed è quindi influenzato da:

 legame alle proteine plasmatiche

 liposolubilità

 pH: il pH del latte (6,5-7,2) è leggermente più acido di quello del plasma (7,4); sarà così favorita

l’escrezione di basi deboli e l’opposto si avrà con i composti acidi

Composti fortemente lipofili (es. DDT, Bifenili-Policlorurati PCB) passano dal plasma al latte insieme con i

lipidi; per questi composti il latte può essere una via importante di eliminazione.

Alcuni composti sono secreti attivamente nel latte, raggiungendo concentrazioni più elevate di quelle

plasmatiche. In figura è mostrata la diversa concentrazione del farmaco

nitrofurantoina nel plasma e nel latte di donne in fase di

allattamento trattate con tale farmaco. Si evince che nel latte il

farmaco passa in concentrazioni maggiori rispetto a quello

riscontrato nel plasma.

La dose ingerita dal lattante può esser calcolata in base al volume di latte ingerito giornalmente, alla

concentrazione plasmatica materna ed al rapporto AUClatte/AUCplasma. Per stabilire l’eventuale

pericolosità, occorre tenere conto della biodisponibilità orale dello xenobiotico e della clearance dello

xenobiotico nel neonato, che è in genere minore rispetto all’adulto.

In genere, i farmaci possono ritenersi sicuri se la dose/kg nel lattante è inferiore al 10% della dose/kg

materna, tranne nel caso di farmaci molto tossici (es. citotossici, isotretinoina, immunosoppressori ed altri),

per i quali è necessaria l’interruzione dell’allattamento.

Per legge, il latte non deve contenere farmaci. Tuttavia, tracce di alcuni farmaci, soprattutto

antibiotici, sono state trovate nel latte per uso alimentare.

Anche in tracce, gli antibiotici possono essere dannosi per:

 possibili allergie

 sviluppo di resistenza agli antibiotici 66

FARMACOCINETICA

I farmaci ad azione sistemica, dopo essere stati somministrati, entrano nel torrente circolatorio e da qui

diffondono nei vari tessuti per interagire con i recettori. Il percorso del farmaco nell’organismo, oggetto di

studio della farmacocinetica, può essere scomposto in 4 processi che avvengono simultaneamente: ADME.

Durante l’assorbimento il farmaco già si distribuisce nei tessuti e una sua quota è contemporaneamente

metabolizzata (eliminata o escreta). La quantità di farmaco nell’organismo aumenta con l’assorbimento e

diminuisce con l’eliminazione. Tuttavia, se il farmaco è iniettato per via endovenosa, la fase di

assorbimento viene aggirata. Nella fase di distribuzione il farmaco si ripartisce tra torrente circolatorio e i

vari tessuti. Il farmaco nel plasma si trova nella forma libera F in equilibrio con la forma legata alle proteine

plasmatiche F-P. L’entità di questo tipo di legame influenza il profilo farmacocinetico complessivo perché

solo la quota libera del farmaco è sottoposta ai processi di DME. Gli studi di farmacocinetica sono

fondamentali per stabilire la posologia, ossia lo schema che fissa le dosi del farmaco e gli intervalli tra le

somministrazioni. Una posologia ottimale produce concentrazioni plasmatiche e tissutali di farmaco che

assicurano l’efficacia terapeutica e minimizzano, per quanto possibile, il rischio di effetti indesiderati. La

posologia deve anche tener conto di eventuali fattori in grado di alterare il profilo farmacocinetico standard

di un farmaco, per esempio patologie o interazioni con altri farmaci.

Nella fase di assorbimento il farmaco attraversa differenti tessuti in base alla via di somministrazione

raggiungendo il torrente ematico. Questo processo produce un aumento della concentrazione plasmatica

Cp del farmaco. le più comuni vie di somministrazione sono:

 via enterale (orale, sublinguale, rettale)

 via parenterale-iniettiva (endovenosa, intramuscolare, sottocutanea)

 via inalatoria

 via transdermica

La via orale deve tener conto dell’effetto di primo passaggio, ossia del fatto che una quota di farmaco può

essere metabolizzata nell’intestino e/o nel fegato prima di raggiungere il circolo sistemico. Per questo

motivo, la via di somministrazione orale è caratterizzata da una efficienza o biodisponibilità variabile,

spesso inferiore al 100%. Al contrario, le somministrazioni iniettive sono caratterizzate da una 67

biodisponibilità uguale o di poco inferiore al 100% e da eccellente riproducibilità. Le vie iniettive

consentono di raggiungere in poco tempo valori di Cp efficaci.

La biodisponibilità è l’efficienza della somministrazione del farmaco. Più specificatamente, la

biodisponibilità (F iniziale di frazione) è la quota di farmaco che, attraverso una data via di

somministrazione, raggiunge inmodificato il circolo sistemico. Ad esempio, se la biodisponibilità orale di un

farmaco è del 60% significa che 60 mg di una dose di 100 mg raggiungeranno il circolo sistemico, mentre i

rimanenti 40 mg subiranno destini diversi (eliminazione con le feci, degradazione gastrica, metabolizzazione

epatica).

La biodisponibilità associata alla somministrazione endovenosa è del 100% perché in tal caso l’intera dose

di farmaco è immessa direttamente in circolo, bypassando l’effetto di primo passaggio.

Per determinare la biodisponibilità orale Fos di un farmaco si confrontano le curve di livello plasmatico

ottenute somministrando la stessa dose per via orale ed endovenosa. In queste curve la Cp del farmaco è

diagrammata in funzione del tempo.

L’entità dell’assorbimento è la quantità di sostanza che viene effettivamente assorbita; tale quantità non

può essere misurata direttamente. Un indice dell’entità è l’area sotto la curva (AUC, Area Under the Curve)

del grafico concentrazione-tempo. Le aree sotto le due curve forniscono rispettivamente i valori di AUCos e

AUCev. Fos corrisponde al rapporto percentuale tra AUCos e AUCev. Per calcolare matematicamente l’AUC

si utilizza il metodo dei TRAPEZOIDI: si considera l’area sotto la curva come una serie di trapezoidi, la cui

sommatoria delle aree darà l’AUC risultante. Le curve di livello plasmatico prodotte dalla

somministrazione di un farmaco descrivono

l’andamento della sua Cp rispetto al tempo. Da queste

curve si ricavano i parametri cinetici fondamentali,

ossia la F, il volume di distribuzione, la clearance e

l’emivita. Tali parametri, a loro volta, sono necessari

per stabilire la via di somministrazione del farmaco e

la sua posologia, cioè le dosi e gli intervalli di tempo

tra le somministrazioni. Una corretta posologia

produce valori della Cp compresi in una “finestra 68

terapeutica” delimitata dalla minima concentrazione efficace (MEC) e dalla minima concentrazione tossica

(MTC). L’ampiezza di questa finestra è proporzionale alla cosiddetta maneggevolezza del farmaco, ossia alla

sua tollerabilità alle dosi terapeutiche. In una curva di livello plasmatico generata da un’unica

somministrazione è possibile identificare un punto di massimo che ha come coordinate la Concentrazione

di picco Cmax e il tempo di picco Tmax. Il valore di Tmax è importante per farmaci che devono avere azione

rapida (es. anestetici, analgesici). Dopo tale massimo la Cp cade in maniera esponenziale dimezzandosi ad

intervalli di tempo costanti che corrispondono al tempo di dimezzamento o emivita T .

1/2

Il ramo ascendente della curva riflette la prevalenza dell’assorbimento del farmaco sulla eliminazione,

quello discendente vede prevalere l’eliminazione che prosegue anche quando l’assorbimento è completato.

La curva è il risultato di processi che seguono una cinetica di I ordine, ossia che procedono con una velocità

direttamente proporzionale alla concentrazione del farmaco. questo tipo di cinetica è molto comune

poiché è condivida da tutti i farmaci che alle dosi abituali non saturano i carrier di membrana o gli enzimi

metabolizzanti. La caduta uniformemente esponenziale della Cp a partire dal valore di Cmax, indica che il

farmaco si distribuisce non appena assorbito. In altre parole, ad un raddoppio della concentrazione del

farmaco nel sito di assorbimento, distribuzione o eliminazione, corrisponde anche un raddoppio della

quantità di farmaco che viene assorbita, distribuita o eliminata nell’unità di tempo.

In un processo di I ordine sia le costanti di velocità che il tempo di emivita sono stabili nel tempo e

indipendenti dalla concentrazione del farmaco (cinetica dose-indipendente).

Nel caso in cui la quota di farmaco assorbita, distribuita o eliminata nell’unità di tempo rappresenti una

frazione variabile della quantità di farmaco presente nel sistema in quel momento, si avrà una cinetica di

ordine zero. In questo caso, la quantità di farmaco assorbito, distribuito o eliminato nell’unità di tempo è

costante ed indipendente dalla concentrazione del farmaco nel sistema. In presenza di un processo di

ordine zero, i parametri cinetici del farmaco subiranno delle variazioni con il variare della dose

somministrata (cinetica non lineare o dose-dipendente).

Le figure sotto rappresentano rispettivamente una cinetica di I ordine su scala semi-logaritmica ed una

cinetica di ordine zero.

I meccanismi di eliminazione mediati da enzimi o trasportatori (eliminazione pre-sistemica, metabolismo,

trasporti tubulari) sono saturabili. In questi casi, si passa da una cinetica di I ordine ad una cinetica di ordine

⇒ ⇒

0 la velocità di eliminazione non è proporzionale alla concentrazione la concentrazione plasmatica e

l’AUC aumentano in modo circa esponenziale all’aumentare della dose (es. fenitoina). 69

La descrizione matematica dei movimenti di un farmaco nell’organismo e quindi il calcolo dei principali

parametri farmacocinetici può avvenire attraverso l’adozione di modelli di cui i più utilizzati sono quelli

COMPARTIMENTALI. Nel caso di questi modelli, si assume che l’organismo sia suddiviso in vari

compartimenti, caratterizzati ognuno da un certo volume e comunicanti tra loro. I modelli più semplici sono

ad 1 e a 2 compartimenti.

La velocità di assorbimento è controllata non solo dalla natura del

farmaco ma anche dalla via di somministrazione e dalla forma

farmaceutica. In genere, le vie iniettive e le forme farmaceutiche

liquide sono contraddistinte da un assorbimento più rapido

rispetto alla via orale e alle forme farmaceutiche solide. 70

La retta tangente alla curva in corrispondenza della Cmax è parallela all’asse delle ascisse in quanto la

velocità di assorbimento è uguale a quella di eliminazione. Ecco perché la derivata della concentrazione sul

tempo è nulla. Al contrario, nella porzione discendente della curva, la derivata avrà segno negativo, poiché

la concentrazione della sostanza sta diminuendo.

L’entità con cui un determinato farmaco si distribuisce nei tessuti è espressa dal suo volume di

distribuzione Vd.

Vd è il volume teorico di acqua corporea che sarebbe richiesto per contenere la quantità di farmaco

presente nell’organismo, supponendo che la sua concentrazione fosse ovunque uniforme e pari alla

concentrazione plasmatica. In altre parole, è il volume che il farmaco occuperebbe se, al tempo 0 dopo

somministrazione per endovena, avesse in tutti i distretti dell’organismo la stessa concentrazione che ha

nel plasma.

Dal punto di vista farmaco-tossicologico, è importante definire la capacità dell’organismo di eliminare un

dato xenobiotico. I processi di eliminazione seguono cinetiche del I ordine. La velocità di diminuzione della

concentrazione plasmatica è proporzionale alla concentrazione stessa:

- dCp/dt = kel x Cp

La quantità assoluta di farmaco eliminato nell’unità di tempo varia quindi al variare della Cp. È invece

costante, indipendente dalla Cp, il valore della riduzione percentuale della concentrazione nell’unità di

tempo. Ad. esempio, ogni ora la concentrazione si riduce del 10%; tale valore frazionario è la costante di

eliminazione kel.

La quantità di farmaco presente nell’organismo alla fine della fase di distribuzione (Q0) è:

Q0 = Cp x Vd

(Q = Dose se la biodisponibilità è 100%)

Moltiplicando dCp/dt x Vd si ottiene la quantità (massa) di farmaco eliminata nell’unità di tempo (Qe), che

sarà: Qe = kel x Cp x Vd (= kel x Q0)

Il prodotto kel x Vd (dimensioni volume/tempo: l/h; ml/min) fornisce il volume di plasma che viene ripulito

dal farmaco nell’unità di tempo. Tale parametro, definito clearance, è indipendente dalla concentrazione

ed è quindi costante (se sono costanti kel e Vd). Dipende infatti da kel, ovvero dall’efficienza dei processi di

eliminazione per quel farmaco e da Vd, che dipende dalle caratteristiche chimico-fisiche del farmaco.

La clearance consente di:

 ⇒

prevedere la quantità di xenobiotico eliminato dal plasma nell’unità di tempo (se Cp è costante)

calcolare la velocità di somministrazione necessaria a mantenere la Cp efficace (Css); Css = Q/CL (Q

= D/t; t: intervallo tra le somministrazioni)

 valutare variazioni della capacità depuratoria conseguenti a patologie (insufficienza renale,

epatica), variabilità genotipica, interazioni

 avere informazioni sul meccanismo di eliminazione renale (se lo xenobiotico viene eliminato solo

per via renale) 71

Meccanismi della variabilità interindividuale della risposta ai tossici. Variabilità tossico-cinetica. Dovuta a:

 Fattori endogeni

 Fattori ambientali

La variabilità interindividuale si manifesta principalmente nella fase di eliminazione.

 Metabolismo: differenze genetiche (es. polimorfismo genetico) e ambientali (induzione o inibizione

enzimatica, altre interazioni); età; patologie (insufficienza epatica)

 Escrezione renale: età, patologie (insufficienza renale); interazioni

Fattori endogeni non genetici (età, patologie) e fattori ambientali possono determinare variabilità intra-

individuale (cambiamenti nel tempo). Variazioni nelle modalità di esposizione possono determinare

variazioni, anche intra-individuali:

 dell’assorbimento (velocità ed entità)

 dell’eliminazione (saturazione, induzione enzimatica)

La clearance misura la capacità depurativa totale dell’intero organismo. Nel caso di xenobiotici eliminati

tramite diverse vie (metabolismo epatico, escrezione renale ecc.), ciascun organo contribuisce per una

certa percentuale. La clearance totale è quindi pari alla somma delle singole clearance d’organo.

La clearance di un organo è data da: Cl = Flusso ematico x (Ca – Cv)/Ca

Ca e Cv sono le concentrazioni arteriosa (all’ingresso nell’organo) e venosa (all’uscita). Il rapporto (Ca –

Cv)/Ca è definito indice (o rapporto) di estrazione ed è costante (indipendente da Cp, se non intervengono

fenomeni di saturazione).

Concentrazione allo stato stazionario: la concentrazione allo stato stazionario (Css) è la concentrazione che

raggiunge un farmaco nel nostro organismo quando viene somministrato in dosi ripetute, distanziate tra

loro, da un tempo che corrisponde al tempo di dimezzamento. La concentrazione plasmatica allo stato

stazionario è legata strettamente all'emivita (T/2). Questo parametro viene preso in considerazione

soprattutto se abbiamo più dosi consecutive; è direttamente proporzionale alla dose somministrata ed

inversamente proporzionale all'intervallo tra le somministrazioni, volume di distribuzione e clearance.

Valutare la concentrazione allo stato stazionario permette di mantenere costante ed efficace una

determinata concentrazione plasmatica di farmaco nel nostro organismo. Di solito questa concentrazione

viene mantenuta costante in terapie croniche o terapie antibiotiche. Il livello costante ed efficace viene

stabilito grazie a più somministrazioni di farmaco. La seconda somministrazione viene eseguita solamente

prima che la dose precedente venga totalmente

eliminata. La seconda somministrazione andrà a

sommarsi con la prima e avremo così un effetto più

alto, ma sempre dentro al range terapeutico. Per la

terza, quarta e per le successive somministrazioni si

eseguono gli stessi passaggi eseguiti per la seconda

somministrazione. Il farmaco impiega 4 volte il T/2 per

arrivare allo stato stazionario, di conseguenza verrà

eliminato dopo 4 volte il T/2. Se l’intervallo tra le

esposizioni è maggiore di 5 emivite, non si ha

accumulo. 72

Se andiamo a rappresentare tutte queste somministrazioni in un grafico possiamo notare che ad un certo

punto c'è il raggiungimento di un plateau, quello è il livello di concentrazione plasmatica allo stato

stazionario. Al plateau della concentrazione plasmatica la quantità di farmaco assorbita è uguale a quella

eliminata. Molto importante è citare la DOSE DI CARICO O ATTACCO che viene utilizzata soprattutto per

quei farmaci che hanno una emivita ritardata e quindi hanno un raggiungimento della Css lunga (es.

digitalici). La dose d'attacco serve per accelerare i tempi nel raggiungere la concentrazione allo stato

stazionario. Quest'ultima la si può raggiungere immediatamente con una dose di farmaco alta e poi agire

nel tempo con dosi di farmaco più basse proprio per garantire un mantenimento (infatti le

somministrazioni successive prendono il nome di dosi di mantenimento). Oppure la Css la si può

raggiungere con una serie di somministrazioni ravvicinate in modo tale da raggiungere in pochissimo tempo

la concentrazione plasmatica che ci dia l'effetto terapeutico, e dopodichè si prosegue con le dosi di

mantenimento. La dose d'attacco la si può determinare con una semplice formula.

DOSE DI CARICO = Vd x Css

Aumentando la frequenza di somministrazione, non cambia il tempo per il raggiungimento dello stato

stazionario ma aumenta la Css.

La concentrazione allo stato stazionario dipende dal rapporto tra velocità di somministrazione e clearance:

A parità di condizioni di esposizione, variazioni della clearance determinano variazioni della Css

contribuendo alla variabilità dell’effetto.

Nel caso in cui un soggetto sia affetto da insufficienza renale, la clearance sarà rallentata, con maggiore

assorbimento rispetto all’eliminazione. Il tutto si traduce in un aumento della Css allo stato stazionario

rispetto ad un paziente con una normale funzionalità renale. 73

L’effetto di uno xenobiotico è proporzionale alla sua concentrazione nell’organo bersaglio e, in genere, al

tempo di permanenza nell’organo. Dato che la concentrazione in un organo è in genere proporzionale alla

concentrazione plasmatica, l’effetto è proporzionale a quest’ultima (che è misurabile). Per quasi tutti i

tossici esiste una concentrazione minima, al di sotto della quale non si ha effetto.

Il fattore tempo: la relazione tra la durata dell’effetto di un tossico e la sua permanenza nell’organismo

dipende dal meccanismo d’azione. Per tossici che agiscono legandosi reversibilmente a recettori, l’effetto

è condizionato dalla presenza del tossico nell’organismo (N.B. il danno ‘secondario’ prodotto può essere

irreversibile).

Per tossici che si legano o alterano irreversibilmente i recettori e altre macromolecole biologiche (es.

inibitori suicidi; metaboliti reattivi), l’effetto si mantiene anche dopo che il tossico non legato è stato

eliminato; l’effetto può essere irreversibile. Per sostanze che modulano l’espressione genica legandosi ai

recettori per i fattori di crescita e i recettori intracellulari, il loro effetto perdura anche dopo che il farmaco

è stato eliminato. 74

ADR: Adverse drug reaction

Secondo la definizione che ne da l’organizzazione mondiale della sanità (WHO), una ADR è una reazione

indesiderata e dannosa che si verifica in risposta ad un farmaco somministrato a dosaggi normali per la

profilassi, la diagnosi o la terapia di una malattia o per la modificazione di una funzione fisiologica.

Le ADR rappresentano il 2-3 % degli interventi in medicina generale. Si sviluppano prevalentemente dal 1°

al 10° giorno di terapia e si verificano più comunemente con farmaci quali: digitalici, antibiotici, analgesici,

sedativi, insulina, warfarin. I meccanismi responsabili delle ADR sono: per l’80% farmacologico e per il 20%

immunologico.

In base proprio alla definizione di ADR, essa non va confusa con:

A) Effetti collaterali: inscindibili rispetto alle proprietà farmacologiche della sostanza (es. ritenzione idrica

da corticoidi)

B) Effetti secondari: sfavorevoli tardivi (es. insufficienza surrenale da corticosteroidi, tossicodipendenza da

psicofarmaci, effetti mutageni e cancerogeni di antiblasti, citotossici ed immunosoppressori)

C) Allergie: reazioni di ipersensibilità

D) Parallergie: indistinguibili dalle allergiche ma non immunomediate (es. degranulazione, liberazione di

istamina)

E) Idiosincrasie: manifestazioni non allergiche o parallergiche (es. deficienze enzimatiche,

fotosensibilizzazione)

F) Malattie iatrogene: possono generarsi dagli effetti secondari (es. Sindrome di Cushing da corticosteroidi,

ulcerosi da aspirina, stati confusionali da psicofarmaci negli anziani, ritenzione urinaria da atropina nei

prostatici)

MALATTIE DA FARMACI

 Il farmaco comunemente induce una malattia altrimenti rara; in questo caso l’effetto sarà facilmente

rilevabile durante la sperimentazione a livello clinico (prima della commercializzazione). Il farmaco

verrà sicuramente abbandonato. Rimane il problema dei pazienti usualmente esclusi dalla

sperimentazione (donne gravide - talidomide)

 Il farmaco raramente induce una malattia comune; in questo caso probabilmente l’effetto rimarrà

sconosciuto

 Il farmaco raramente induce una malattia di per sé rara; in questo caso l’effetto verrà scoperto

mediante la farmacovigilanza post-marketing e confermato da studi successivi caso-controllo (anemia

aplastica- cloramfenicolo)

 Il farmaco induce comunemente una malattia comune; questo effetto non verrà scoperto nel corso di

osservazioni cliniche informali, ma può essere scoperto con studi caso-controllo come nel caso delle

sulfaniluree in rapporto alla mortalità cardiovascolare nei diabetici 75

CLASSIFICAZIONE DELLE ADR

A (augmented, dose-dipendenti)

 Relativamente frequenti

 Correlate al meccanismo d’azione del farmaco

 Prevedibili

 Bassa mortalità

Es: ipoglicemia da insulina; ipotensione da antiipertensivi; ulcere da FANS*; attacchi asmatici da β-

bloccanti; sedazione da benzodiazepine; nausea da digitale; ipocalemia da diuretici; ototossicità da amino

glicosidi.

Possono essere dovute ad interferenze farmacocinetiche (per esempio inibizione del metabolismo di un

farmaco da parte di un secondo farmaco, come nel caso della torsione di punta (aritmia cardiaca) osservata

quando alla terfenadina è associato il ketoconazolo, o miopatia da alcune statine quando associate al

gemfibrozil). Rappresentano la maggioranza delle ADR gravi, ma potrebbero essere evitate o prevenute in

quanto sono sperimentalmente riprodotte spesso prima della commercializzazione del farmaco.

L’identificazione di una ADR di tipo A può essere ostacolata da alcune condizioni:

 l’ADR si manifesta solo in una minoranza di utilizzatori del farmaco

 non vi è una stretta relazione con la dose

 l’ADR è banale e di scarsa importanza o di difficile riproduzione in animali da esperimento

 può sembrare coincidente con altre cause (per es., la cefalea)

 il meccanismo non è chiaro

La tosse da ACE inibitori è un esempio di reazione avversa di tipo A, la cui identificazione non è avvenuta

durante i trial clinici pre-marketing, ma dopo la commercializzazione, attraverso la segnalazione spontanea.

*ulcere da FANS: i FANS riducono la biosintesi delle prostaglandine mediatrici dell'infiammazione,

dell'ipetermia e del dolore. Tale effetto è legato alla loro capacità di bloccare gli enzimi ciclossigenasi che

sono, appunto, responsabili della formazione di queste sostanze e dei loro derivati (trombossano e

prostacicline). I FANS inibiscono entrambe le isoforme dell'enzima ciclossigenasi, chiamate COX1 e COX2.

L'inibizione di entrambe le isoforme è solo in parte utile, perché se da un lato porta all'effetto terapeutico

dall'altro è anche responsabile degli effetti collaterali. Le COX1, in particolare, sono ubiquitarie e vengono

chiamate costitutive perché sono normalmente presenti in tutti i tessuti ed in tutti gli organi; sono anche

conosciute come ciclossigenasi fisiologiche o buone (perché danno luogo a prostaglandine e prostanoidi

utili per mediare diversi effetti dell'organismo). Al contrario, le COX2 sono inducibili poiché la loro

attivazione è indotta da stimoli patologici (fisici, termici, chimici ecc.) e sono presenti in concentrazione

elevata nei siti dell'infiammazione; per questo motivo sono considerate ciclossigenasi patologiche (portano

i prostanoidi nel sito dell'infiammazione). Per tutti questi motivi un farmaco che inibisce solo le COX2, come

i FANS di seconda generazione, dà minori effetti collaterali rispetto ad uno che esercita il proprio potere

inibitorio su entrambe le isoforme. Gli inibitori esclusivi delle COX2, in effetti, espletano il loro potere

antinfiammatorio senza dare l'effetto gastrolesivo tipico dei farmaci che inibiscono sia le COX1 che le COX2.

I pazienti che fanno uso di FANS hanno un rischio più alto di seri eventi gastrointestinali rispetto a coloro

che non li assumono. Infatti, la biosintesi gastrica dei prostanoidi, in particolare la PGE2 e la PGI2, è

coinvolta nell’inibizione della secrezione acida da parte dello stomaco, nell’aumento del flusso ematico a

livello della mucosa e nella secrezione di muco protettivo a livello intestinale. L’inibizione della loro sintesi,

dovuta all’inibizione di COX può rendere lo stomaco più suscettibile al danno. I salicilati sono fra i FANS più

gastrolesivi, in particolare l’aspirina. 76

B (bizzarre, non “sempre” dose-dipendenti)

 Rare

 Non correlate al meccanismo d’azione

 Imprevedibili (non sempre)

 Elevata mortalità #

Es: ipersensibilità alla penicillina; epatotossicità da isoniazide*; ototossicità da aminoglicosidi .

La maggior parte delle ADR di tipo B insorgono entro 12 settimane. Alcune riconoscono una base

immunologica e spaziano dal rash cutaneo all’anafilassi, dalle vasculiti all’anemia emolitica (es. da

metildopa); altre riconoscono una predisposizione in un errore congenito del metabolismo o in una

deficienza acquisita di un certo enzima, con conseguente anomala via metabolica o accumulo di metaboliti

tossici (per es., epatite da isoniazide, apnea protatta da succinilcolina).

Questa classificazione, che permette anche di predire come si possa ridurre il rischio di alcune ADR

modificando la dose, non tiene però conto del fatto che alcune dipendono non solo dalla dose ma anche

dal tempo di esposizione (per es., osteoporosi da glucocorticoidi) e fa sì che la nausea e il vomito dose-

dipendenti (tipo A) da eritromicina vengano classificati anche nelle reazionei di tipo B, in quanto non

farmacologicamente prevedibili. A fronte di tali problematiche, la classificazione è stata modificata ed

estesa.

*epatotossicità da isoniazide: l’effetto epatotossico è dovuto all’accumulo di un suo metabolita, l’acetil-

idrazina.

#ototossicità da aminoglicosidi: la coclea è normalmente rivestita dalle cellule ciliari. Esse vengono distrutte

dalle alte concentrazioni di aminoglicosidi. La perdita delle cellule ciliari comporta prima un’alterazione

delle risposte ad alta frequenza e successivamente alterazioni a carico delle risposte a bassa frequenza.

Pertanto, gli aminoglicosidi sono particolarmente pericolosi nei bambini, i quali potrebbero sviluppare

sordità.

C (chronic o continuous, dose e tempo-dipendenti)

 Rare

 Legate al trattamento ripetuto

Es: soppressione dell’asse ipotalamo-ipofisi-surrene da corticosteroidi.

I farmaci, specialmente quando assunti per periodi di tempo molto prolungati (per anni o per il resto della

vita), possono indurre nuove malattie o aumentare l’incidenza di quelle verso le quali esiste già una

predisposizione individuale (per esempio l’aumento di tumore della mammella o di complicazioni

Tromboemboliche indotto da contraccettivi orali). Prendere in considerazione il decorso temporale della

relazione farmaco/evento avverso in singoli individui ha permesso di individuare l’associazione tra alotano

ed epatite e di distinguere ADR simili tra loro, come le due forme di trombocitopenia da eparina, e le due

forme di anemia da cloramfenicolo, nonché le reazioni di fotoallergia e fotosensibilità. L’insorgenza tardiva

della malattia, la coincidenza e la causalità possono talora essere inestricabili.

D (delayed, tempo-dipendenti)

 Rare

 Generalmente dose-dipendenti

 Si manifestano diverso tempo dopo l’uso

Es: discinesia tardiva da neurolettici, teratogenicità, carcinogenicità 77

Si tratta di ADR ad insorgenza tardiva, poco frequenti. Poiché insorgono a distanza di tempo, non è

possibile osservarle nelle fasi della sperimentazione pre-marketing e non è facile riconoscerne l’origine

farmacologica successivamente, potendo essere molteplici le cause responsabili dell’evento (una neoplasia

a carico della mammella insorta in una donna che in passato ha fatto uso di contraccettivi orali può

attribuirsi in maniera incontestabile all’uso di tali farmaci?).

E (end, da sospensione)

 Rare

 Si manifestano subito dopo la sospensione

Es: sindrome astinenziale da oppioidi

Poco frequenti, da fine d’uso cioè da sospensione dell’assunzione di un determinato farmaco.

Poiché si verifichino è necessario che:

 la sospensione del trattamento sia brusca;

 il trattamento con il farmaco sia stato sufficientemente protratto nel tempo;

L’emivita del farmaco sospettato sia sufficientemente breve. Alcuni esempi sono le allucinazioni e le

convulsioni da brusca sospensione di baclofen assunto come miorilassante per un periodo prolungato, la

sindrome d’astinenza da oppioidi e l’ischemia miocardica da sospensione di betabloccanti. Quando questo

tipo di ADR è noto, il prescrittore dovrebbe sempre informare il paziente che la terapia non va mai

interrotta bruscamente.

F (failure, da inefficacia terapeutica)

 Relativamentefrequenti

 Dose-dipendenti

 Spesso causate da interazioni tra farmaci

Es: ridotta efficacia di contraccettivi orali in associazione ad induttori enzimatici. Sono dovute al fallimento

inaspettato di un trattamento farmacologico; sono piuttosto comuni e dose-dipendenti (frequentemente

conseguenza di interazioni tra farmaci, per esempio insorgenza di una gravidanza in caso di assunzione

concomitante di contraccettivi orali e iperico, che essendo un induttore del CYP450 metabolizza il

contraccettivo).

INTERAZIONI TRA FARMACI: con il termine interazione tra farmaci viene comunemente definito il

fenomeno che ha luogo quando gli effetti (terapeutici o tossici) di un farmaco A sono modificati dalla

precedente o concomitante assunzione di altri (uno o più) agenti farmacologici. A livello clinico il fenomeno

diviene evidente e rilevante quando la risposta globale, susseguente alla somministrazione ravvicinata o

simultanea di due o più composti, è marcatamente o significativamente diversa dalla semplice somma degli

effetti che ciascun composto avrebbe esercitato se dato individualmente, oppure dagli effetti che il

composto principale avrebbe avuto se somministrato da solo. È quindi una situazione in cui possiamo

osservare:

A) Un fenomeno di sinergismo o di potenziamento con aumento degli effetti terapeutici e/o tossici di

uno o più dei farmaci somministrati

B) Un fenomeno di antagonismo con la riduzione o la scomparsa dell’efficacia terapeutica di uno o più

dei farmaci somministrati

I possibili risultati ottenibili associando due o più farmaci sono:

 EFFETTO ADDITIVO: generalmente dovuto ad interazioni di tipo farmacodinamico. I due farmaci

esercitano lo stesso effetto, ma attraverso meccanismi diversi. Il risultato è un effetto pari alla

somma algebrica delle risposte individuali. L’esempio è: aspirina (agisce sulle COX) e codeina

(agisce sui recettori oppioidi) per un effetto analgesico 78

 EFFETTO SINERGICO: interazione di tipo farmacodinamico o farmacocinetico. I due farmaci

esercitano lo stesso effetto farmacologico con meccanismi uguali o diversi. L’effetto finale è

superiore alla somma algebrica delle risposte individuali. L’esempio è: trimetoprim e

sulfametossazolo

 POTENZIAMENTO: interazione di tipo farmacodinamico o farmacocinetico. Solo uno dei due farmaci

esercita l’effetto, il secondo potenzia l’azione del primo. L’esempio è: caffeina e propifenazone per

un effetto antinocicettivo e fenilpropanolammina e paracetamolo per la tossicità epatica

 ANTAGONISMO: interazione di tipo farmacodinamico o farmacocinetico. L’effetto combinato dei

due farmaci è inferiore a quello degli effetti individuali. Può essere dovuto ad interazioni di tipo:

 Fisico-chimiche: interazione diretta fisico-chimica tra due sostanze. L’esempio è: tetracicline

(chelanti metallici) e antiacidi con cationi bi/trivalenti (Malox)

 Farmacocinetiche: modificazioni nell’ADME

 Recettoriali competitive: l’esempio è morfina e naloxone; uno funge da agonista e l’altro da

antagonista su un determinato recettore

 Recettoriali non competitive: due sostanze chimiche producono effetti opposti sulla stessa

funzione fisiologica.

Le interazioni tra farmaci costituiscono una importante causa non solo di variabilità individuale nella

risposta ai vari agenti terapeutici, ma anche di ADR o reazioni tossiche.

Purtroppo anche la valutazione del decorso temporale e della relazione dose-dipendenza non sempre

consente una classificazione soddisfacente delle ADR, poiché mancano informazioni importanti sulla

suscettibilità individuale. Aronson e Ferner hanno pertanto proposto un’altra classificazione, descritta come

tridimensionale ed indicata con l’acronimo DoTS, che per ogni ADR prende in considerazione: dose

dipendenza (Do), tempo di insorgenza della reazione (T) e suscettibilità del paziente (S).

Dose-dipendenza (Do): in base a tale criterio le ADR vengono suddivise in sovraterapeutiche (effetti tossici),

terapeutiche standard (effetti collaterali) e sub-terapeutiche in pazienti suscettibili (reazioni di

ipersensibilità). Una reazione di dose-dipendenza può valere anche per alcune reazioni di tipo B (come la

risposta immunogenica al vaccino dell’epatite B, la desensibilizzazione da aumento della dose nel caso delle

cefalosporine, le reazioni cutanee di ipersensibilità di tipo IV).

Tempo-dipendenza (T): numerosi effetti farmacologici sono caratterizzati dal decorso temporale dalla

somministrazione. Per esempio, la stessa dose di furosemide induce una diuresi maggiore se somministrata

per infusione invece che in bolo e la tossicità da metotressato è maggiore quando la stessa quantità totale

viene somministrata in più riprese a basse dosi anziché come singola dose. E’ quindi possibile distinguere

due modelli di ADR in base alla relazione temporale: reazioni tempo-indipendenti e reazioni tempo-

dipendenti.

Reazioni tempo-indipendenti: possono insorgere in ogni momento del trattamento, indipendentemente

dalla sua durata. Possono dipendere da un effetto farmaceutico, quando la dose e/o la biodisponibilità

vengono alterate (per es., prescrivendo lo stesso farmaco con una formulazione farmaceutica differente),

da un effetto farmacocinetico, quando la concentrazione del farmaco nel sito d’azione viene modificata

(per es., tossicità da digossina quando la funzionalità renale peggiora) o da un effetto farmacodinamico,

quando la risposta farmacologica è alterata senza una modificazione della concentrazione (per es., tossicità

da digossina in associazione a deplezione di potassio). Le reazioni tempo-dipendenti si suddividono in 6 tipi:

 Rapida: si verifica solo quando un farmaco viene somministrato troppo rapidamente (es., sindrome

dell’uomo rosso da vancomicina);

 Da prima dose: si verifica dopo la prima dose e non necessariamente in seguito (es., ipotensione dopo

la prima dose di un ACE inibitore, reazioni di ipersensibilità di tipo I);

 Precoce: si verifica all’inizio del trattamento e il paziente sviluppa tolleranza verso di essa (es., cefalea

da nitroderivati);

 Intermedia: si verifica con un certo ritardo, ma presenta scarso o nessun rischio di insorgenza tardiva se

non si è verificata dopo un determinato periodo di tempo; per esempio reazioni di ipersensibilità di tipo

79

II (trombocitopenia da chinina), di tipo III (nefrite interstiziale da penicilline), di tipo IV (ipersensibilità

cutanea agli antistaminici e rash pseudoallergico da ampicillina/amoxicillina) o anche reazioni non

allergiche (aumento del rischio di neutropenia da carbimazolo).

 Tardiva: non si verifica all’inizio del trattamento, ma il rischio aumenta con un’esposizione continuata o

ripetuta (per es., osteoporosi da corticosteroidi, discinesia tardiva da antagonisti dei recettori

dopaminergici, p g ,retinopatia da clorochina e deposizione di fosfolipidi da amiodarone). Sono reazioni

tardive anche quelle che si verificano quando un farmaco viene interrotto o quando la sua dose viene

ridotta dopo un trattamento prolungato (per es., sindrome da sospensione di oppioidi e

benzodiazepine, ipertensione dopo sospensione di clonidina e di alfa-metildopa)

 Ritardata: si osserva dopo un certo tempo dall’esposizione, anche se il farmaco viene sospeso prima

che appaia la reazione (per esempio, CCA vaginale in donne esposte a DES in utero, focomelia da

talidomide).

Suscettibilità (s): il rischio di una ADR differisce tra gli individui di una popolazione esposta; essa si

presenterà in soggetti sensibili e non in altri. In altri casi la sensibilità segue un andamento di distribuzione

continua (per esempio aumento della suscettibilità con un aumento del danno della funzionalità renale). La

suscettibilità può dipendere dal sesso, dall’età, da alterazioni fisiologiche, da fattori esogeni, da patologie

concomitanti, da cause genetiche.

In base alla classificazione DoTS, l’osteoporosi da corticosteroidi sarebbe classificata come collaterale per la

dose (Do), tardiva in base al tempo di comparsa (T) e dipendente dall’età e dal sesso in base alla

suscettibilità (S); l’epatotossicità da isoniazide sarebbe classificata come collaterale per la dose (Do),

intermedia per il tempo di comparsa (T) e dipendente da corredo genetico (metabolismo del farmaco), età,

sesso, fattori esogeni (alcol), patologie (malnutrizione) (s).

ADR causate dalla formulazione farmaceutica: le ADR possono derivare dalle caratteristiche della

formulazione farmaceutica; possono, infatti essere presenti eccipienti e veicoli in grado di evocare di per sé

una risposta indesiderata da parte del paziente. Es. alcune delle reazioni di ipersensibilità da docetaxel sono

da ascrivere all'eccipiente polisorbato e alcune di quelle da paclitaxel possono dipendere dal suo veicolo,

l'olio di ricino poliossietilato. In alcuni casi la sostituzione o l'alterazione di un eccipiente o di tutta la

formulazione può modificare la disponibilità sistemica e la sicurezza. Es. intossicazione da fenitoina per

sostituzione di un eccipiente - presenza di contaminanti nelle preparazioni, endovenose 80

ADR su base farmacocinetica: si tratta di ADR correlate a un farmaco presente nell'organismo in

concentrazioni superiori o inferiori (in caso di ADR di tipo F) a quelle previste per la dose normale. Sono

classificabili come di tipo A e sono ovviamente dose-dipendenti.

Possono verificarsi in seguito a modifiche nelle 4 fasi dell’ADME.

Tali modifiche possono essere dovute all'azione di fattori interni (quali alterazioni parafisiologiche,

presenza di patologie, substrato genetico) o esterni (quali farmaci, alimenti, sostanze d'abuso).

Assorbimento

La formulazione farmaceutica può alterare la quantità di farmaco assorbito, così come la dieta. La presenza

di alimenti può influenzare entità e velocità di assorbimento di un farmaco in seguito all'alterazione di pH

gastrico, secrezioni gastroenteriche, motilità e transito intestinale, flusso ematico. I componenti degli

alimenti possono inoltre competere con i farmaci per la superficie assorbente.

Es. una dieta ricca di proteine riduce l'efficacia della levodopa a causa della competizione a livello dei

sistemi di trasporto (ADR classificabile come F).

I liquidi possono invece accelerare lo svuotamento gastrico, facilitare la dissoluzione dei farmaci e/o ridurne

l’assorbimento per aumento della peristalsi intestinale determinando, a seconda dei casi, una maggiore o

minore biodisponibilità del farmaco coinvolto.

Le interazioni farmacocinetiche che si verificano in fase di assorbimento possono modificare la

biodisponibilità di un farmaco

Es: l’assunzione per via orale di sali di ferro o di calcio riduce l'assorbimento dei bifosfonati.

La chinidina è in grado di elevare di 2-3 volte la concentrazione plasmatica di digossina, poiché è un potente

inibitore della glicoproteina P (P-gp) e blocca, quindi, l'eliminazione della digossina mediata da P-gp. Altro

fattore da tenere in considerazione è la presenza/assenza di batteri intestinali: alcuni batteri intestinali

sono in grado di metabolizzare parzialmente i farmaci. La loro inibizione può quindi aumentare la quantità

di farmaco assorbito.

Es. overdose di digossina, in presenza di dosi ottimali, si sono registrati per contemporanea assunzione di

claritromicina.

Distribuzione

Lo spiazzamento di un farmaco da parte di un altro dal suo sito di legame sulle proteine plasmatiche causa

un incremento dei livelli circolanti di farmaco non legato, incrementandone l'effetto farmacologico (vale,

ovviamente, anche il ragionamento opposto). Tali interazioni, tuttavia, risultano clinicamente importanti

solo se il farmaco spiazzato possiede un legame farmaco-proteico estremamente elevato (>90%) e un Vd

particolarmente ridotto.

Es. La presenza di P-gp a livello della barriera ematoencefalica limita l'accesso all’encefalo di molti farmaci,

tra cui digossina, ivermectina, vinblastina, desametasone, ciclosporina, domperidone e loperamide.

Metabolismo

La maggior parte dei farmaci è metabolizzata a livello epatico. Il metabolismo dei farmaci avviene di norma

in due fasi:

- I fase: modifica di un gruppo funzionale o scissione della molecola (reazioni di ossidazione, riduzione,

idrolisi)

- II fase: coniugazione del metabolita risultante dalla prima fase con un composto endogeno (quali solfato,

acido glucuronico e acido acetico).

Il prodotto finale della coniugazione è più idrosolubile e perciò più rapidamente eliminato dall'organismo.

81

I principali fattori che possono influenzare il metabolismo sono:

- Flusso epatico: riduzioni di flusso si traducono in riduzioni del metabolismo del farmaco, aumentandone la

concentrazione plasmatica nel circolo con possibilità di reazioni avverse (es. labetalolo, propranololo,

morfina)

- Malattie epatiche: il fegato ha una capacita di metabolizzare i farmaci così elevata che deve essere

profondamente alterato affinché un effetto sul metabolismo del farmaco sia clinicamente rilevante.

Tuttavia, uno shunt artero-venoso può alterare il metabolismo dei farmaci anche in assenza di un ampio

danno epatocellulare.

- Età: il metabolismo di alcuni farmaci è condizionato dall'età, in particolare nei neonati e nelle persone

anziane, nei quali ciò è principalmente dovuto alla ridotta attività degli enzimi microsomiali epatici.

Es. cloramfenicolo nei neonati responsabile della Grey Syndrome

I principali fattori che possono influenzare il metabolismo sono:

 Fattori genetici

Le più importanti vie metaboliche soggette a variabilità farmacocinetica sono:

 acetilazione: alterazione quantitativa di N-acetil transferasi. Es. isoniazide, idralazina,

sulfametazina, sulfasalazina, procainamide, dapsone

 ossidazione: diverse isoforme del CYP450. Es. ampia variabilità interindividuale nel dosaggio del

warfarin (CYP2C9); inefficacia del profarmaco losartan in pazienti con ridotta espressione del

CYP2C9 o del tramadolo alle dosi normali in pazienti con elevata espressione del CYP2D6.

 idrolisi

 Interazioni tra farmaci: molti farmaci sono in grado di ridurre o aumentare il proprio metabolismo o

quello di altri farmaci principalmente attraverso un aumento o una riduzione degli enzimi coinvolti.

Esistono poi farmaci che, oltre a essere substrati di uno o più di tali isoenzimi, ne sono induttori o

inibitori. Es. succo di pompelmo: inibitore del CYP3A4; iperico: induttore del CYP3A4 82

Escrezione

Il rene è la principale via di eliminazione dei farmaci; tale via diventa fondamentale se il farmaco viene

escreto sotto forma immodificata o come metabolita attivo.

I principali fattori che possono influenzare l’escrezione renale comprendono:

- Filtrazione renale: per i farmaci soggetti a filtrazione renale, la quantità di composto filtrato è

direttamente proporzionale alla velocità della filtrazione glomerulare (GFR) e alla frazione di farmaco libero

nel plasma.

Aminoglicosidi, digossina, metotressato ed etambutolo sono esempi di

farmaci che hanno una clearance = GFR.

- Riassorbimento tubulare: per acidi (ASA) e basi (amfetamine) deboli, il

principale fattore che influenza il riassorbimento passivo è il pH del fluido

tubulare.

Eq. di Henderson-Hasselbach:

I principali fattori che possono influenzare l’escrezione renale comprendono:

- Malattie renali: l’insufficienza renale altera indirettamente il riassorbimento passivo modificando sia il

flusso renale sia il pH, così come la secrezione tubulare dei farmaci

- Età: con l'aumentare dell'età si va incontro a una progressiva riduzione del numero di nefroni e la

filtrazione viene progressivamente mantenuta da un aumento della sintesi di prostaglandine.

Es. I FANS hanno maggiori probabilità di determinare ritenzione urinaria nei soggetti anziani.

- Interazione tra farmaci: in particolare per competizione per la secrezione tubulare.

Es. La chinidina e il verapamil, inibiscono la secrezione tubulare di digossina --> intossicazioni da digitale

(ADR di tipo A). Il probenecid inibisce la secrezione tubulare di clorochina --> può aumentare la tossicità

oculare (ADR di tipo A). Competendo con la gentamicina, la furosemide ne aumenta l'effetto nefrotossico.

ADR su base farmacodinamica: le ADR di questo tipo sono legate a fattori genetici e a interazioni

farmacologiche.

Tra i fattori genetici le condizioni più note sono:

 quelle che riguardano difetti enzimatici a carico degli eritrociti:

- Deficit di glucosio-6-fosfato deidrogenasi: doxorubicina, primachina, dapsone, acido nalidissico e

nitrofurantoina possono precipitare l'emolisi

- Deficit di glutatione reduttasi: l'emolisi può essere indotta dai medesimi agenti ossidanti

- Carenza di metemoglobina-reduttasi: comparsa di porfirie in presenza dei medesimi agenti ossidanti e

anche di nitroderivati (es. nitroglicerina)

- Aumento dell'attività dell‘ALA sintetasi: porfiria indotta dai farmaci che indirizzano l'EME (repressore

dell'ALAsintetasi) verso la sintesi del citocromo P450

 quelle che riguardano difetti genetici dei recettori:

- I pazienti asmatici con aumentata espressione dell'isoforma b del recettore nucleare dei glucocorticoidi

sono resistenti a tali farmaci (ADR di tipo F). 83

- Una mutazione dominante negativa del recettore PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ)

comporta una grave resistenza all'insulina

- Un polimorfismo del recettore B2 della bradichinina sembra essere coinvolto nella tosse da ACE inibitori

- Una mutazione nel gene KCNE2 che codifica per una subunità di membrana coinvolta nella formazione di

un canale del potassio (IKr) è stata associata a prolungamento del QT in seguito a terapia con claritromicina

e trimetoprim/sulfametoxazolo

- Polimorfismi genetici nei recettori D3 e D4 della dopamina sviluppano discinesia tardiva e acatisia acuta

da antipsicotici

Vi sono molti esempi di ADR dovute a interazioni farmacodinamiche. Queste possono essere distinte in

azioni dirette, da parte del farmaco che induce l‘interazione(e avvenire a livello dello stesso sito d'azione), e

indirette.

- Tra le ADR da azione diretta vi sono: il prolungamento dell'effetto depolarizzante dei farmaci miorilassanti

il muscolo scheletrico, indotto da aminoglicosidi e chinidina, le aritmie, l'asistolia e l'insufficienza cardiaca,

indotte dall'associazione di verapamil con beta-bloccanti l’aumento del rischio di emorragia da warfarin,

per associazione con anabolizzanti, clofibrato, corticosteroidi, estrogeni e tetracicline.

Fattori predisponenti alle ADR:

A) Interazioni farmacologiche: le interazioni sono tra le principali cause di sviluppo di ADR (6-30%). Le

interazioni farmacologiche (e le eventuali ADR) aumentano proporzionalmente al numero dei farmaci

assunti e quanto maggiore è il numero dei farmaci prescritti tanto maggiore è la probabilità di

inappropriatezza prescrittiva.

Poiché non è possibile ricordare tutte le possibili interazioni tra farmaci è utile attenersi ai seguenti principi:

• Evitare, quando possibile, qualsiasi associazione

• Ridurre, per quanto possibile, la variabilità prescrittiva, cercando di prescrivere i farmaci di cui si hanno

approfondite conoscenze farmacocinetiche e farmacodinamiche

• Interrogare il paziente sulla terapia che sta seguendo (anche non da prescrizione) ogni qual volta viene

prescritto o nuovamente prescritto un farmaco

• Valutare insieme al paziente il rischio/beneficio di ciascuno dei farmaci associati e della loro associazione

I farmaci con basso IT (quali anticoagulanti, antiepilettici e digitalici) sono ovviamente a maggior rischio di

interazioni.

B) Genere: le donne sembrano avere ADR più frequenti e gravi (neuropatia,pancreatite ecc.) con vari

inibitori delle proteasi e con gli inibitori nucleosidici della transcrittasi; hanno, inoltre, maggiore

suscettibilità a sviluppare ADR cardiache (torsioni di punta), forse a causa delle variazioni ormonali

correlate al ciclo mestruale. Rispetto agli uomini (a parità di dose/kg), le donne presentano maggiore

rischio di tosse da ACE inibitori, aumento dei livelli plasmatici di betabloccanti, risposta ipotensiva maggiore

da calcioantagonisti, decesso in corso di terapia con digitale, discrasie ematiche da cloramfenicolo.

C) Etnia: differenze più o meno rilevanti, di natura sia farmacocinetica sia farmacodinamica, esistono tra le

varie etnie, riconoscendo il più delle volte un substrato genetico.

Esempi:

• Deficienza di glucosio-6-fosfato deidrogenasi è più frequente nelle popolazioni africane,mediorientali e

del Sudest asiatico 84

• Circa l’85% dei soggetti asiatici possiede un alcool deidrogenasi con un'attività molto più rapida rispetto a

quella del fenotipo caucasico; ciò comporta un aumento delle concentrazioni di acetaldeide, dopo

l’assunzione di alcol, che si manifesta clinicamente con vasodilatazione imponente, flushing e tachicardia.

• Le donne di origine africana hanno maggiore predisposizione a sviluppare angioedema da ACE-inibitori

D) Età:

• Bambini: rispondono ai farmaci in modo diverso rispetto agli adulti, con una grande variabilità a seconda

della fascia d'età (neonati, lattanti, bambini in età prescolare e scolare, adolescenti).

Es. Aspirina Sindrome di Reye

“L'agenzia regolatoria britannica ha stabilito che l'aspirina dovrebbe essere evitata negli stati febbrili o nelle

infezioni virali in pazienti di età inferiore a 16 anni”

• Anziani: oltre ad assumere tendenzialmente più farmaci, gli anziani subiscono cambiamenti fisiologici

imputabili all'invecchiamento, tra i quali una minore peristalsi gastrointestinale, una ridotta capacità di

detossificare ed eliminare le sostanze esogene fino a una diversa sensibilità recettoriale in risposta allo

stimolo farmacologico (soprattutto per quanto concerne i farmaci neurologici e cardiovascolari).

E) Gravidanza:

Nelle donne in gravidanza è necessario considerare due ordini di problemi:

• le modifiche fisiologiche che accompagnano la gestazione possono ripercuotersi sulla cinetica dei farmaci

• i farmaci assunti dalla madre possono attraversare la placenta

Fattori chiave (in entrambe le problematiche) sono:

- le caratteristiche fisico-chimiche del farmaco

- l'entità del passaggio attraverso la placenta

- la concentrazione di farmaco che arriva al feto

- la durata dell'esposizione

- la distribuzione ai tessuti fetali

- la maturità del fegato fetale

- la maturità della placenta al momento dell'esposizione.

Tra le caratteristiche fisico-chimiche del farmaco, oltre alla liposolubilità e alla ionizzazione è importante il

peso molecolare (PM): solo le molecole con PM ≤ 250-500 Dalton attraversano facilmente la placenta.

La placenta permette il passaggio sia di molecole piccole, ionizzate e altamente lipofile sia - grazie ad

appositi trasportatori (P-gp)- di molecole con caratteristiche fisiche-chimiche diverse.

L’ inibizione della P-gp può favorire l'afflusso di farmaci al feto. La placenta possiede inoltre capacità

metaboliche di tipo ossidativo, che possono dare luogo a metaboliti inattivi o dotati di attività

farmacologica residua o tossici (come l'etanolo). I farmaci che riescono ad attraversare la placenta arrivano

al fegato fetale che, per quanto immaturo, possiede una certa capacità metabolica provvedendo alla

biotrasformazione parziale dei farmaci, prima che questi raggiungano la circolazione fetale sistemica.

L’esposizione ai farmaci in gravidanza, oltre ad aumentare il rischio di aborto, può determinare

teratogenesi (alterazione dello sviluppo fetale, malformazioni caratteristiche organo-specifiche e stadio-

specifiche). L’effetto teratogeno sul feto può essere diretto o indiretto.

Gli effetti teratogeni possono esplicarsi attraverso diversi meccanismi: apoptosi (scatenata da stress

ossidativo e radicali liberi); alterazioni dei movimenti cellulari; inibizione di attività enzimatiche o di canali

di trasporto (es. gli ACE inibitori causano oligoidramniosi e malformazioni renali; la dofetilide blocca i canali

del K+ nel miocardio); interferenza con i geni che controllano lo sviluppo fetale. 85

Ognuna delle differenti fasi in cui si articola lo sviluppo fetale ha una particolare suscettibilità all'effetto dei

farmaci, con esiti diversi:

• Preimpianto:“effetto del tutto o nulla”

• Embrionale: grande suscettibilità ai teratogeni

• Fetale: alterazioni funzionali (quali ritardo mentale e sordità), della crescita e dell'adattamento post-

natale

• Perinatale: possibile azione (diretta o mediata da alterazioni delle funzioni materne) dei farmaci sulle

funzioni organiche del feto

Non va trascurato, infine, l'effetto di un'esposizione paterna a farmaci o sostanze tossiche che possono

ritrovarsi nel liquido seminale (es. talidomide) e venire assorbiti dalla mucosa vaginale (meccanismo non

genetico: per esempio morfina e mortalità perinatale) oppure indurre mutazioni genetiche o cromosomiche

sulle cellule gametiche (meccanismo genetico: es. pesticidi e tumori del SNC) o alterazioni dell'espressione

genica (meccanismo epigenetico).

Per alcuni farmaci che possono essere assunti durante il periodo di fertilità della donna sono stati

approntati programmi di gestione del rischio. (es. talidomide, isoretinoina). Tali programmi di gestione del

rischio proibiscono alle donne incinte di assumere l’isotretinoina e impediscono alle pazienti che ne fanno

uso di iniziare una gravidanza.

F) Allattamento: la cinetica dei farmaci è importante anche durante l'allattamento. La concentrazione del

farmaco nel latte è direttamente proporzionale a quella raggiunta nel plasma materno.

Durante l'allattamento sono consigliate, se praticabili, le seguenti misure:

• evitare le formulazioni long-acting e i farmaci a lunga emivita

• assumere il farmaco (anche per iv) subito dopo la poppata

• in caso di monosomministrazione giornaliera, farla coincidere col periodo di sonno più prolungato del

bambino

In relazione all'allattamento i farmaci possono essere suddivisi come segue:

- Controindicati: farmaci per i quali il rischio è superiore al beneficio derivante al bambino dall'allattamento

al seno

- Rischiosi: un rischio per il lattante o per la lattopoiesi è provato, ma è accettabile se il farmaco è

indispensabile alla madre e non vi sono

alternative più sicure

- Moderatamente sicuri: per questi

farmaci non vi sono studi controllati in

allattamento, ma il rischio di effetti

collaterali per il bambino è possibile

- Sicuri: sono i farmaci studiati in un

numero limitato di donne che allattano,

senza riscontro di effetti collaterali nel

lattante e/o per i quali il rischio per il

bambino è da ritenersi remoto

- Più sicuri: farmaci assunti da molte

madri in allattamento, senza riscontro di

effetti collaterali nel lattante e per i quali

esistono studi controllati 86

G) Patologie concomitanti:

• La farmacoterapia potrebbe risentire della presenza di patologia renale, epatica o cardiaca.

• A loro volta, i farmaci possono esacerbare condizioni cliniche preesistenti, soprattutto in pazienti anziani

(es. diabete e diuretici tiazidici, cadute e benzodiazepine a lunga durata d'azione, malattia di Parkinson e

metoclopramide, ipertensione e FANS).

• Uno stato di grave malnutrizione può alterare la cinetica dei farmaci, in quanto la mancanza di proteine

alimentari si ripercuote sulla sintesi di enzimi metabolizzanti e proteine di trasporto. 87

FARMACOVIGILANZA

La farmacovigilanza nasce dal fatto che, secondo quanto afferma l’OMS, nessuna sostanza (droga) è sicura

al 100% per tutte le persone in qualunque circostanza.

Nessuna delle attività umane si svolge a rischio zero. La sicurezza è un concetto relativo che deriva da un

equilibrio dinamico tra il livello di rischio che siamo disposti ad accettare e i benefici che ci attendiamo da

quella determinata attività.

Determinare il rapporto beneficio/rischio significa studiare la relazione tra efficacia terapeutica e

tollerabilità e promuovere la razionalità di impiego dei farmaci nella popolazione.

Esistono 3 livelli di valutazione:

•AUTORITA’ REGOLATORIE: valutano i benefici/rischi per la popolazione

•MEDICI / FARMACISTI: valutano i benefici/rischi per uno specifico paziente

•PAZIENTE: valuta i benefici/rischi in termini di valori personali 88

Alla conclusione di un trial clinico controllato e randomizzato RCT, ossia in cui l’assegnazione dei

trattamenti oggetto di studio ai pazienti è casuale, non si riesce ad avere informazioni dettagliate sulla

tollerabilità del trattamento. Questo accade per due motivi:

 inadeguatezza del disegno dei trials RCT

 scarsa attenzione al problema 89

FARMACOVIGILANZA O FARMACOSORVEGLIANZA

Insieme delle attività che vengono intraprese allo scopo di garantire un utilizzo appropriato e sicuro dei

farmaci e che coincidono con la fase IV dello studio clinico farmacologico.

Tali attività sono portate avanti dalle aziende farmaceutiche sui prodotti di loro produzione e dalle agenzie

governative su tutti i prodotti medicinali.

Obiettivo della farmacovigilanza sin dalla sua nascita è stato quello di valutare e segnalare le reazioni

avverse (ADR) che i farmaci potessero dare nella fase post-marketing, ossia dopo la loro immissione in

commercio.

Nel 1951 si assiste alla prima pubblicazione di un testo dedicato agli effetti collaterali dei farmaci: il

Meyeler's Side Effects of Drugs. Nel 1960, la Food and Drug Administration (FDA) inizia la raccolta delle

segnalazioni di reazioni avverse. È solo nei successivi anni '60 che si avvia anche in Italia un programma di

farmacovigilanza a seguito dei devastanti effetti della somministrazione di Talidomide in gravidanza anche

se una normativa sistematica sulla materia ed il conseguente avvio del sistema italiano di Farmacovigilanza

risalgono all'inizio degli anni '80.

Nel 1968 è partita la centralizzazione dei dati mondiali sulle ADR, coordinata dalla World Health

Organization (WHO). Si tratta di un progetto, il “Program on International Drug Monitoring”, la cui banca

dati mondiale è localizzata a Uppsala in Svezia.

L’Italia è entrata a far parte di questo programma internazionale di monitoraggio delle ADR del WHO nel

1975. Nel 1980 è stato istituito il Centro nazionale di segnalazione spontanea delle ADR, nello stesso

periodo alcuni ospedali e università hanno attivato sistemi paralleli di monitoraggio. Dalla collaborazione di

gruppi di ricerca di varie Regioni italiane è nato nel 1995 il Gruppo Interregionale di Farmacovigilanza.

Nel 2008 la Commissione Europea ha pubblicato un rapporto, denominato “Pharmaceutical Package, che

conteneva una serie di pareri e proposte volte a rendere più sicuro, innovativo ed accessibile il mercato dei

farmaci in Europa.

Tale rapporto pone l’attenzione su tre ambiti:

1) accesso all’informazione sui farmaci da parte dei cittadini europei

2) potenziamento del sistema di farmacovigilanza dell’Unione Europea

3) misure anti-contraffazione dei farmaci

La proposta legislativa della Commissione UE sulla farmacovigilanza è stata successivamente approvata dal

Parlamento Europeo e dal Consiglio dell’UE (Direttiva 2010/84/EC; Regolamento EU No. 1235/2010).

È stato stimato che:

1) il 5% di tutti i ricoveri ospedalieri in Europa è dovuto ad ADR

2) le reazioni avverse rappresentano la quinta causa di morte ospedaliera

3) il 5% dei pazienti ospedalizzati incorre in una ADR, che sono anche responsabili di circa 197.000

decessi per anno in UE

4) il costo sociale delle reazioni avverse in UE è stato valutato in 79 miliardi di euro annui

La nuova legislazione europea si è focalizzata sul raggiungimento dei seguenti obiettivi:

1. definizione di “sospetta reazione”

2. definizione chiara di ruoli e responsabilità

3. elaborazione di interventi di risk management proporzionali al rischio

4. maggiore pianificazione di attività di farmacovigilanza “proattiva”

5. maggiore integrazione del concetto di efficacia nell’ambito delle valutazioni del rapporto

beneficio/rischio dei farmaci

6. individuazione di un processo decisionale rapido ed efficace a livello europeo 90

7. maggiore coinvolgimento di pazienti e professionisti sanitari nel network europeo di

farmacovigilanza

8. maggiore trasparenza e comunicazione del rischio

9. migliore informazione sui farmaci

Le principali modifiche della nuova legislazione includono:

 un nuovo concetto di ADR che viene ora definita come: “una reazione nociva e non voluta ad un

medicinale”. Rispetto alla precedente definizione, che si riferiva esclusivamente a reazioni avverse

insorte durante terapie farmacologiche impiegate a dosaggi normali e per le indicazioni

terapeutiche autorizzate, da ora in poi si considereranno ADR anche le reazioni avverse da

overdose, abuso o uso improprio di farmaco, gli errori medici e le reazioni comparse per impieghi

non conformi a quelli descritti nella scheda tecnica del prodotto.

 Gli Stati membri mantengono un ruolo centrale per tutte le attività di farmacovigilanza; la nuova

normativa prevede una maggiore cooperazione tra di essi e la definizione di meccanismi finalizzati

ad armonizzare e a rendere più veloci le procedure. Le responsabilità delle aziende farmaceutiche

sono maggiormente chiarite, in particolar modo per ciò che riguarda gli obblighi di monitoraggio

continuativo della sicurezza dei loro prodotti così come l’onere di portare a conoscenza delle

autorità competenti tutte le informazioni ottenute, inclusi i risultati positivi e negativi degli studi

clinici e quelli derivanti da uso offlabel. E’stato istituito all’interno dell’EMA un nuovo comitato

scientifico, denominato PRAC (Pharmacovigilance Risk Assessment Committee), con il compito di

valutare i problemi di sicurezza dei farmaci e di dare pareri al CHMP (Committee for Medicinal

Products for Human Use).

 Strumenti di valutazione post-marketing: è stato previsto un Risk Management Plan (RMP).

All’interno del Risk Management system verranno inclusi gli studi postmarketing di sicurezza ed

efficacia; nella nuova legislazione viene inoltre richiesta alle autorità competenti la valutazione

dell’efficacia degli interventi di minimizzazione del rischio attraverso i PASS (Post-Authorization

Safety Studies) e i PAES (Post-Authorization Efficacy Studies). Le autorità competenti avranno la

possibilità di imporre alle aziende farmaceutiche la conduzione di studi post-marketing su sicurezza

ed efficacia dei farmaci. L’obbligo degli studi può essere imposto al momento dell’autorizzazione

alla commercializzazione, nella fase post-marketing o come condizione alla autorizzazione. Le

autorità competenti si dovranno assumere la responsabilità della supervisione degli studi non-

interventistici da loro richiesti, secondo principi guida armonizzati, garantendo che essi non

vengano condotti a scopi promozionali e che venga fornito il follow-up di tutti i dati di sicurezza

raccolti.

 Trasparenza e comunicazione: per aumentare la trasparenza nelle attività di farmacovigilanza, gli

Stati membri dovranno istituire e mantenere dei portali web. Allo stesso fine i titolari delle

autorizzazioni all’immissione in commercio dovranno fornire alle autorità competenti preavvisi o

avvisi per le comunicazioni sulla sicurezza e le autorità competenti dovranno scambiarsi

reciprocamente qualsiasi altro avviso riguardante la sicurezza. L’EMA sarà responsabile del

coordinamento della comunicazione sui problemi di sicurezza e stabilirà un nuovo portale web

specifico per queste informazioni.

 Segnalazioni: per semplificare la segnalazione di ADR, il database Eudravigilance diventerà il punto

singolo di ricezione dei report di farmacovigilanza. La nuova legislazione enfatizza il ruolo di pazienti

nella farmacovigilanza, promuovendo iniziative da parte delle autorità competenti indirizzate a

facilitare e a rendere diretta la segnalazione spontanea di sospette ADR dei cittadini.

http://eudravigilance.ema.europa.eu/human/evdbms01.asp

http://eudravigilance.ema.europa.eu/human/TenSteps.asp 91

Le nuove sostanze attive, tutti i farmaci biologici (inclusi i biosimilari) ed alcuni medicinali specifici

soggetti all’obbligo di condurre uno studio post-marketing sulla sicurezza, saranno autorizzati a

condizione che siano oggetto di monitoraggio addizionale. Tali medicinali saranno contrassegnati

da un simbolo nero e da un’adeguata nota esplicativa nel RCP e sul foglietto illustrativo.

 È stato modificato l’ambito d’applicazione dei rapporti periodici di aggiornamento sulla sicurezza

(PSUR), affinché presentino un’analisi del rapporto rischio/beneficio di un medicinale piuttosto che

un elenco dettagliato dei casi già trasmessi alla banca dati Eudravigilance. Gli obblighi imposti

relativamente alla compilazione degli PSUR saranno d’ora in poi proporzionati ai rischi associati ai

medicinali. Di conseguenza, gli PSUR non verranno richiesti a scadenza regolare per i medicinali

generici, i medicinali contenenti una sostanza attiva di impiego ben consolidato, i medicinali

omeopatici o i medicinali di origine vegetale con registrazione effettuata sulla base del loro impiego

tradizionale, salvo il caso in cui dovessero emergere specifici problemi di sicurezza. Al fine di

razionalizzare le risorse, per i medicinali autorizzati in più Stati membri sarà sufficiente una

valutazione unica degli PSUR.

Le Good pharmacovigilance practices (GVP) sono un insieme di misure atte a facilitare l’esecuzione della

farmacovigilanza nell’Unione Europea. Esse si applicano ai detentori delle autorizzazioni di immissione in

commercio dei farmaci, alle agenzie che regolano tutto ciò che concerne i farmaci.

In attesa che la normativa europea venga recepita, in Italia la farmacovigilanza viene effettuata dall’AIFA. 92

La sorveglianza delle reazioni avverse attraverso la segnalazione spontanea è uno strumento fondamentale

per la definizione del profilo di tollerabilità di un farmaco nelle sue reali condizioni di impiego e in un

numero sufficientemente elevato di pazienti.

Una reazione o evento avverso è qualsiasi episodio sfavorevole di natura medica che si verifichi in un

paziente o in un soggetto partecipante in una sperimentazione clinica al quale sia stato somministrato un

prodotto farmaceutico e che non deve avere necessariamente una relazione causale con tale trattamento.

La fonte di dati per gli studi di farmacovigilanza è la scheda di segnalazione di Reazione Avversa, che deve

essere compilata e spedita dal farmacista o dal medico che ravvisi o sospetti una reazione avversa. Solo con

un numero adeguato di segnalazioni sarà possibile cogliere un segnale d’allarme

tempestivo. La scheda di segnalazione, compilata e firmata, deve essere trasmessa tempestivamente al

responsabile della farmacovigilanza della struttura sanitaria di appartenenza.

Il responsabile della farmacovigilanza, dopo aver verificato che le schede di segnalazione di reazioni avverse

sono compilate in modo adeguato e completo, inserisce la segnalazione nella Rete Nazionale di

Farmacovigilanza.

Tale rete, attiva dal novembre 2001, garantisce da un lato la raccolta, la gestione e l’analisi delle

segnalazioni spontanee di sospette reazioni avverse a farmaci (ADR) e dall’altro la pronta e capillare

diffusione delle informazioni diramate dall’AIFA.

Dal 2006 le attività di farmacovigilanza sono state potenziate attraverso il consolidamento della rete

nazionale (con il coinvolgimento dei centri regionali) ed il suo collegamento ad Eudravigilance ed al Centro

Organizzazione Mondiale della Sanità per il Monitoraggio Internazionale dei Farmaci di Uppsala. 93

All’atto dell’acquisizione di una nuova scheda o del suo follow-up, il sistema invia automaticamente un

messaggio di avviso alla Regione di competenza ed alle Aziende Farmaceutiche titolari dei farmaci indicati

come sospetti informandoli che nella RNF è stata registrata una nuova segnalazione.

In questa Sezione sono disponibili i riferimenti dei Responsabili di Farmacovigilanza che, nell’ambito della

Rete Nazionale di Farmacovigilanza, operano nelle diverse Regioni italiane per assicurare il continuo

monitoraggio delle segnalazioni delle reazioni avverse ai farmaci garantendo la sicurezza dei medicinali in

commercio.

In questa sezione sono pubblicati i segnali emersi dall’analisi delle schede di segnalazione spontanea

contenute all’interno della banca dati della segnalazione italiana, che nasce dall’unione di due archivi: il

database della Rete Nazionale di Farmacovigilanza (RNF), istituita nel 2001, e il database GIF (schede di

segnalazione delle regioni appartenenti al gruppo GIF inserite dal 1988 al 2006).

L’analisi comprende sia una valutazione qualitativa caso per caso (caseby-case assessment) e sia una analisi

quantitativa con tecniche di datamining per arrivare ad una valutazione statistica del rischio (PRR =

Proportional Reporting Ratio). I segnali descritti hanno un carattere prematuro e l'obiettivo della loro

pubblicazione è quello di dare una informazione precoce di quanto contenuto nel sistema della

segnalazione spontanea oltre che di attirare l’attenzione e la vigilanza del lettore. 94

Esistono strumenti matematici che in maniera piuttosto oggettiva valutano se si tratti di una ADR o

semplicemente di una reazione successiva all’uso di più sostanze contemporaneamente ad esempio.

Si tratta di algoritmi che determinano la relazione causale tra l’assunzione della sostanza X e l’evento

avverso verificatosi.

Schematicamente, una relazione causale in base a criteri e definizioni adottati internazionalmente, (WHO

International Drug Monitorino Programme) si può definire:

 Improbabile

 possibile

 probabile

 quasi certa/molto probabile

Qual è il livello ottimale di segnalazioni? 300 segnalazioni anno/milione di abitanti; 30% di natura grave e

provenienti da almeno il 10% dei medici. In queste condizioni la comunità può essere ragionevolmente

sicura che ADR importanti siano identificate in un tempo ragionevolmente breve. In Italia si verificano 120

segnalazioni all’ anno per milione di abitanti. 95

MUTAGENESI O TOSSICOLOGIA GENETICA

È la branca della tossicologia che si occupa dello studio di sostanze che esercitano il loro effetto tossico sul

DNA e sui processi genetici delle cellule viventi. Tali sostanze definite mutageni, sono capaci di indurre

mutazioni, cioè cambiamenti stabili casuali nel materiale genetico, che possono essere trasmessi alla

progenie.

In genetica per genotossicità si intende la capacità di alcuni agenti chimici di danneggiare l'informazione

genetica all'interno di una cellula causando mutazioni ed inducendo modificazioni all’interno della

sequenza nucleotidica o della struttura a doppia elica del DNA di un organismo vivente. Queste alterazioni

possono portare allo sviluppo di un cancro. Molto spesso il termine viene confuso con quello di

mutagenicità. Tuttavia è importante notare che mentre tutte le sostanze mutagene sono anche

genotossiche, non tutte le sostanze genotossiche risultano mutagene.

Il termine genotossicità copre un più ampio spettro di effetti rispetto al termine mutagenicità: per esempio

la sintesi non programmata del DNA, gli scambi tra cromatidi fratelli e la frammentazione del DNA sono

parametri di genotossicità e non di mutagenicità.

Il termine mutazione comprende modificazioni sia quali che quantitative nella struttura informazionale di

singoli geni e del genoma. Le mutazioni possono avvenire a livello di basi, della struttura di geni individuali,

dei cromosomi e dell’intero genoma. Possono insorgere spontaneamente o sotto l’influenza di fattori

esterni quali, temperatura, sostanze chimiche, luce ultravioletta e radiazioni ionizzanti.

Le principali classi di danno genetico sono:

MUTAGENESI (MUTAZIONI GENETICHE): comprende piccoli cambiamenti della sequenza delle basi del DNA,

rimozione o sostituzione di coppie di basi. Si parla quindi di mutazioni puntiformi.

CLASTOGENESI (MUTAZIONI CROMOSOMICHE): comprende qualsiasi modificazione (addizione, rimozione,

delezione, riarrangiamento) di parti di cromosomi.

ANEUPLOIDIA (MUTAZIONI GENOMICHE): consiste nell’aumento o nella diminuzione del numero di

cromosomi, e non comporta cambiamenti strutturali.

Le mutazioni geniche o puntiformi: consistono in cambiamenti della sequenza delle basi del DNA cui fa

seguito un’alterazione dell’informazione genetica e la comparsa di un fenotipo mutante. Le mutazioni

geniche possono riguardare una o poche basi e si possono classificare in:

 Sostituzioni: una base viene sostituita con una diversa

 Inserzioni/Delezioni: una o più basi vengono rispettivamente aggiunte o perse, determinando uno

scivolamento nella lettura del codice genetico. Questo tipo di mutazioni sono altresì dette

mutazioni frame-shift. Questo fenomeno avviene perché, essendo il codice genetico senza

“virgole”, se in un gene si inseriscono o si perdono delle basi, le triplette da quel punto in poi

cambiano, con conseguente produzione di una catena polipeptidica alterata. 96

Nello schema sopra sono mostrati due tipi di mutazioni per sostituzione di basi: le transizioni, in cui una

purina è rimpiazzata da un’altra purina (G rimpiazza A) e le transversioni, in cui una purina rimpiazza una

pirimidina o viceversa.

Da un punto di vista genetico le cellule della maggior parte degli eucarioti pluricellulari si possono

distinguere in:

 CELLULE SOMATICHE: rappresentano la grande maggioranza delle cellule di un organismo. Il loro

assetto cromosomico è detto diploide, ovvero formato da coppie di cromosomi omologhi, i cui due

componenti derivano uno dal padre e l’altro dalla madre.

 CELLULE GERMINALI: dette anche sessuali (gameti ossia spermatozoi e cellule uovo), sono una

piccola porzione delle cellule di un organismo e sono essenziali per la formazione della progenie. I

gameti si formano nelle gonadi, in seguito a meiosi e sono caratterizzati da un corredo

cromosomico aploide, ossia formato da un solo cromosoma per ogni coppia.

Nelle cellule diploidi per ogni gene sono presenti due alleli, copie derivanti una dal padre e l’altra dalla

madre. Gli individui sono detti omozigoti per un determinato gene se gli alleli dello stesso gene sono uguali,

mentre sono detti eterozigoti se gli alleli sono diversi.

Alleli dominanti sono quelli che si esprimono nelle cellule diploidi anche allo stato di eterozigosi, sono detti

invece recessivi quegli alleli che si esprimono nelle cellule diploidi solo allo stato omozigote. 97

Gli eventi mutazionali (come

riportato in figura) sono di

norma indotti da grandi

molecole, come ACRIDINE,

agenti batterici che si

intercalano nel DNA, o la

PROFLAVINA

(diamminoacridina e quindi

intercalante anch’essa del

DNA) impiegata

sperimentalmente come

induttore di mutazioni frame-

shift. La proflavina mima,

infatti, la struttura chimica di

due basi azotate appaiate,

come quelle presenti nel DNA.

Grazie all'azione di forze di

interazione idrofobiche (le

cosiddette forze di impilazione

o di stacking), la proflavina può

facilmente inserirsi

(intercalarsi) tra una coppia di base e quella successiva: se questa molecola resta intercalata nel DNA sino al

successivo ciclo di replicazione può indurre mutazioni indel, ovvero determinare l'inserzione o la delezione

di basi. 98

MECCANISMI DI RIPARAZIONE DEL DANNO MUTAZIONALE:

BOX: Riparazione per escissione

I principali meccanismi del sistema

per escissione sono riferibili alla

escissione di nucleotidi o di basi. Il

primo meccanismo è senz’altro il

meno specifico ed è principalmente

coinvolto nella riparazione di difetti

strutturali, quali la presenza di

dimeri di pirimidina o grossi

addotti. Nella escissione dei

nucleotidi, il sistema di riparazione

riconosce il danno prodotto a livello

del DNA ed una endonucleasi

interrompe il filamento del DNA

nelle immediate vicinanze. La

rimozione della regione

danneggiata determina la comparsa

di una interruzione del filamento di

DNA. A questo punto, una

polimerasi introduce la base

corretta, usando la catena opposta

come stampo. L’interruzione viene

“cucita” da una ligasi. Il risultato di

questa sequenza di eventi consiste 99

nel ripristino della corretta sequenza del DNA.

Nell’escissione delle basi, il danno al DNA viene riconosciuto da una DNA-glicosilasi che determina la

liberazione della base danneggiata, mediante la escissione del legame interposto tra la base e lo zucchero. Il

risultato è la produzione di un sito sia apurinico che pirimidinico (sito AP). Una endonucleasi AP quindi

rimuove un segmento di DNA in prossimità del sito AP. Le fasi della polimerizzazione e della ligazione

completano il processo di riparazione. Nella riparazione mismatch, le coppie di basi non corrette possono

formarsi nel DNA in seguito ad errori effettuati durante la replicazione.

Test di mutagenesi: questi test vengono utilizzati per identificare mutageni per le cellule somatiche e

germinali e potenziali cancerogeni. Mutazioni nelle cellule germinali possono provocare malattie ereditarie

(fibrosi cistica) e concorrere a determinare malattie “multifattoriali” quali diabete, ipertensione ecc.

Questi test servono a rivelare se una sostanza è in grado di provocare mutazioni geniche e sono importanti

per individuare agenti inizianti. Essi hanno come obiettivo quello di evidenziare la capacità di un composto

chimico a provocare, in organismi sperimentali da laboratorio, quegli stessi effetti mutageni alla base di

eventi genetici responsabili di numerose forme patologiche che vanno dalle malattie ereditarie alla

trasformazione neoplastica. Il principio dei test è che la mutazione deve produrre un cambiamento del

fenotipo rilevabile mediante appropriate tecniche.

La principale finalità di questi test è essenzialmente quella di proteggere il genoma umano soprattutto

dall’oncogenesi, intimamente correlata alla genotossicità di determinate sostanze.

Il TEST DI AMES è il test in vitro più utilizzato. Utilizza ceppi mutanti di Salmonella typhimurium, che hanno

-

perso la capacità di sopravvivere in assenza di istidina (His ). Una sostanza mutagena può produrre una

retromutazione: i batteri ri-acquistano la capacità di sopravvivere in assenza di istidina.

Il test di Ames prevede l’impiego di preparati microsomiali ottenuti per centrifugazione di un omogenato di

fegato di ratto indotto con il policlorobifenile Aroclor 1254 (frazione S9) per l’attivazione metabolica di

mutageni indiretti. 100

Limiti del saggio:

 I sistemi di induzione metabolica (come la frazione microsomiale S9) non mimano perfettamente il

metabolismo in vivo

 Tessuti diversi dal fegato possono infatti metabolizzare in modo diverso gli xenobiotici. Vi è inoltre il

contributo della flora intestinale

 Il rapporto attivazione/detossificazione in vitro può essere diverso da quello in vivo

Vi sono altri test in vitro che impiegano cellule di mammifero in coltura. In genere questi test si basano sulla

valutazione di mutazioni “in avanti”, che conferiscono resistenza a sostanze tossiche (test di mutazione

locus specifici). Le mutazioni in avanti sono tipi di mutazione che inattivano un gene del ceppo nativo; per

esempio, mutazioni del gene della ipoxantina-guanina fosforibosil-transferasi (HGPRT) conferiscono

resistenza agli analoghi delle purine, 6-tioguanina o 8-azaguanina, e mutazioni del gene della timidina

chinasi (TK) conferiscono resistenza ad un analogo delle pirimidine, la trifluorotimidina (TFT).

l’ enzima ipoxantina -guanina fosforibosiltransferasi permette l’ incorporazione della 6-tioguanina e

composti analoghi del DNA, con inibizione della crescita cellulare e/o morte cellulare. Una mutazione del

gene codificante per il HGPRT può consentire alla cellula di sopravvivere in presenza di 6-tioguanina. Per

l’esecuzione del test, le cellule e la sostanza da testare vengono incubate in presenza di 6-tioguanina. Si

procede quindi alla conta delle colonie.

I saggi di mutagenesi in vivo:

• Hanno il vantaggio di essere effettuati in presenza dei fattori condizionanti la tossicità: metabolismo,

meccanismi di riparazione del DNA, effetti farmacodinamici

• Nei test “classici”, si sceglie un gene bersaglio, la cui mutazione produca un’evidente modifica del

fenotipo nella prima generazione (es. colore del pelo) o nelle generazioni successive (es. anomalie

scheletriche, cataratta)

• La limitazione è che la mutazione avviene a bassa frequenza con bassa sensibilità per l’impossibilità di

usare gruppi di animali troppo numerosi

• I test con animali transgenici consentono di aumentare la sensibilità; tuttavia, non è chiaro se la

sensibilità ai mutageni dei transgeni sia uguale a quella dei geni endogeni

L’analisi molecolare delle mutazioni consente di determinare il tipo di mutazione ed il meccanismo; infatti,

lo “spettro mutazionale” di un gene consente di individuare le regioni più sensibili (altamente mutabili)

all’interno di un gene.

L’analisi molecolare implica:

 Induzione della mutazione in un frammento di DNA (o isolamento dei frammenti mutati);

 Amplificazione del frammento mediante clonaggio o PCR

 Analisi della sequenza del DNA 101

CLASTOGENESI

È definito clastogeno (dal greco antico κλαστός - rotto + geno) un agente chimico o fisico in grado di indurre

un'anomalia o un'alterazione nella struttura di un cromosoma, mediante cancellazione, aggiunta o

traslocazione di sue sezioni.

Si tratta di una forma di mutagenesi, che può essere all'origine di una carcinogenesi, dal momento che le

cellule che non muoiono per effetto clastogenico possono diventare cancerose.

Tra gli agenti clastogeni sono conosciuti il giallo di acridina, il benzene, l'ossido di etilene, l'arsenico, la

fosfina e la mimosina.

Le aberrazioni cromosomiche possono coinvolgere interi cromosomi (aberrazioni di tipo cromosomico) o

solo uno dei due cromatidi di un cromosoma replicato (aberrazioni di tipo cromatidico).

L’induzione di tali aberrazioni cromosomiche e cromatidiche dipende dalla natura dell’agente clastogeno, in

grado cioè di causare rotture a livello cromosomico, e dalla fase del ciclo cellulare delle cellule bersaglio al

tempo di esposizione. La maggior parte degli effetti cromosomici derivano da lesioni indotte nella fase G1,

ossia prima della sintesi del DNA, mentre l’esposizione in G2 porta in genere ad aberrazioni di tipo

cromatidico, come nel caso delle radiazioni ionizzanti.

D’altra parte, la maggior parte dei clastogeni chimici induce principalmente aberrazioni di tipo cromatidico,

indipendentemente dalla fase del ciclo cellulare in cui avviene l’esposizione. L’induzione preferenziale di

questo tipo di danno ipotizza la dipendenza delle lesioni indotte a livello del DNA da agenti chimici da una

fase di replicazione del DNA, la fase S.

Le rotture a livello cromosomico o del singolo cromatide possono generare un cromosoma acentrico, che

non è più in grado di essere trasportato dalle fibre di tubulina, e portano quindi alla perdita di informazioni

geniche. Alcune aberrazioni sono invece stabili in quanto possono essere trasmesse attraverso ripetute

divisioni cellulari e perciò persistono nella popolazione cellulare.

Le principali classi di aberrazioni cromosomiche strutturali sono:

 Delezioni: sono perdite di segmenti di cromosomi. Se la

delezione porta via il centromero, si ha la perdita del

cromosoma acentrico. Tra le principali cause di delezione

ricordiamo: le radiazioni X e gamma e il crossing over

ineguale tra sequenze ripetute. Perché il crossing over

avvenga normalmente i due cromatidi devono essere

appaiati perfettamente; in caso contrario, ci sarà un

crossing over ineguale con possibili delezioni e/o

duplicazioni di frammenti cromosomici che

determineranno anomalie geniche. Un esempio di una

grave sindrome genetica nell’uomo derivante da una

mutazione cromosomica è rappresentato dalla Sindrome

del Cri du Chat (pianto del gatto) derivante dalla

delezione del braccio corto del cromosoma 5. Tale

sindrome è caratterizzata da microcefalia, difficoltà

intellettive e da un pianto caratteristico che ricorda il

miagolio del gatto. 102

 Duplicazioni: Una duplicazione è un tipo di anomalia citogenetica, o mutazione cromosomica, causata

dal raddoppiamento di un tratto di un cromosoma: si verifica quando un frammento di un cromosoma

si lega all'omologo causando una doppia presenza di geni per lo stesso locus. Una duplicazione può

essere il risultato di un crossing over diseguale o errato. La lunghezza del tratto di cromosoma duplicato

può variare, e altrettanto può variare la sua collocazione: il segmento duplicato può trovarsi in un luogo

del genoma del tutto diverso e lontano dall'originale, oppure può trovarsi affiancato a quest'ultimo in

una disposizione testa-coda, denominata disposizione tandem. La sindrome dell'X fragile (o sindrome di

Martin-Bell o FRAX) è una malattia genetica umana causata dalla mutazione del gene FMR1 sul

cromosoma X. Normalmente il gene FMR1 contiene tra 6 e 53 ripetizioni del codone CGG (ripetizioni di

trinucleotidi). Negli individui affetti dalla sindrome dell'X fragile, l'allele FMR1 ha più di 230 ripetizioni di

questo codone. Questo grado di espansione provoca la metilazione delle citosine nel promotore del

gene FMR1, con conseguente silenziamento dell'espressione del gene FMR1. La metilazione del locus

FMR1, che è situato nella banda cromosomica Xq27.3, provoca in quel punto la costrizione e la fragilità

del cromosoma X, fenomeno che dà il nome alla sindrome.

 Inversioni: consistono nella

rottura del filamento di DNA in

due punti; il frammento così

ottenuto viene reincorporato,

grazie alla riparazione ad opera

di specifici enzimi (come le DNA

ligasi), nel cromosoma, ma viene

invertito di orientamento.

Esistono due tipi di inversione: le

pericentriche, quando nel tratto

invertito è compreso il

centromero, ovvero i due punti

di rottura si trovano

rispettivamente sul braccio p e q

(corto e lungo); le paracentriche,

mostrano punti di rottura sul medesimo braccio (o p, o q) e dunque non comprendono il

centromero. L'inversione nel cromosoma 9 inv(9)(p11q12) è una delle più frequenti.

 Traslocazioni: derivano da un errato scambio di parti di cromosomi non omologhi durante il

riarrangiamento cromosomico. Si distinguono due tipi principali di traslocazioni: la traslocazione

reciproca, detta anche non robertsoniana, e la traslocazione robertsoniana. Inoltre le traslocazioni

possono essere bilanciate (ovvero, lo scambio non comporta la perdita o l'aggiunta di materiale

genetico) o non bilanciate (ovvero, lo scambio provoca la perdita o l'aggiunta di informazioni

genetiche). 103

Test per l’aberrazione cromosomica:

• Misurano il danno al DNA che si manifesta come danno delle struttura del cromosoma dovute ad agenti

clastogeni: rotture, riarrangiamenti, delezioni, duplicazioni, inversioni.

• Questo tipo di danno è coinvolto nella cancerogenesi e nello sviluppo di anomalie fetali e malattie

congenite.

• I test per l’aberrazione cromosomica classici si basano sulla rivelazione del danno mediante analisi

citogenetica, effettuata al microscopio ottico, dei cromosomi in metafase. La valutazione del danno

richiede notevole abilità ed esperienza.

Test in vitro:

• Utilizzano linee cellulari di mammifero. La più utilizzata è la CHO (Chinese Hamster Ovary), che fornisce

cellule con un cariotipo ben definito e stabile, con un basso numero di cromosomi (2n= 22) di grandi

dimensioni.

• Le cellule in fase S vengono trattate con diverse dosi della sostanza in esame per 2h a 37°C. Vengono

lavate con fisiologica e piastrate in un mezzo contenente 5-bromodeossiuridina e fatte crescere al buio per

20h. Quasi alla fine dell’incubazione si trattano con il colcemid, un veleno mitotico che inibisce la

formazione del fuso. Le cellule in metafase raccolte saranno lisate, fissate e colorate su vetrino.

le aberrazioni sono osservate alla prima divisione cellulare.

• Le condizioni sperimentali possono influenzare in modo determinante il risultato; ad es., condizioni

sperimentali ‘estreme’ (iperosmolarità del medium di incubazione, condizioni estreme di pH,

concentrazioni citotossiche di xenobiotico) forniscono risultati di dubbio significato.

Test in vivo:

• Il tessuto analizzato è il midollo osseo, che fornisce un gran numero di cellule in replicazione.

• I fattori critici sono la dose e la via di somministrazione, il tempo tra la somministrazione e la raccolta

delle cellule, il numero di animali e cellule testato.

• Alcuni saggi in vivo non misurano direttamente il danno cromosomico ma si basano sugli effetti

osservabili del danno. Ad es., il test del dominante letale misura le morti embrionali e fetali nella progenie

di animali trattati. 104

Il saggio più utilizzato oggi è il test dei micronuclei. È un test di

mutagenesi che consente di osservare eventuali errori occorsi

durante la mitosi, causati da agenti mutageni. Consiste nel

prelevare, da un organismo sottoposto all'agente mutageno,

cellule durante la mitosi, e osservarne un discreto numero

(almeno un centinaio) al microscopio, dopo aver effettuato

una colorazione differenziale che evidenzi il materiale

genetico: in caso di errori (provocati dal mutageno), sono

visibili, oltre al nucleo, frammenti di DNA sparsi per il

citoplasma e che dunque non sono stati incorporati nel nucleo

principale durante le ultime fasi della divisione cellulare

(chiamati micronuclei). Tali alterazioni, che appaiono come dei piccoli nuclei accessori, sono

morfologicamente identici a quelli normali; dunque perfettamente tondi, ma di dimensioni notevolmente

ridotte. Infatti per essere considerati dei veri e propri micronuclei, generalmente non devono superare un

terzo delle dimensioni del nucleo principale.

L’aneuploidia è la mancanza o la presenza in eccesso di uno o più cromosomi (es., monosomia, trisomia). La

poliploidia è la presenza in eccesso di uno o più interi corredi cromosomici (cellule triploidi, tetraploidi

ecc.). L’aneuploidia è implicata nello sviluppo dei tumori e determina alcune malattie congenite (sindrome

di Down). Gli agenti aneugeni agiscono non sul DNA ma sui componenti degli apparati mitotici e meiotici

(fibre del fuso). I saggi per gli agenti aneugeni utilizzano diversi organismi o cellule: funghi, piante,

Drosophila, mammiferi, linee cellulari mammifere.

Saggi per altri danni genetici:

 Molto utilizzato è il test SCE (Sister Chromatid

Exchange), in cui si determina lo scambio di segmenti

tra i due cromatidi di un cromosoma, che è una

misura indiretta del danno genetico. Può essere

effettuato sia in vivo sia in vitro. È molto sensibile e

conveniente. Tuttavia, non è noto il meccanismo

responsabile dell’effetto e come l’effetto sia

influenzato dal danno al DNA. Tuttavia, i dati ottenuti

da questo test sono di minor valore rispetto ai test di aberrazione cromosomica.

 Saggio di trasformazione cellulare (trasformazione maligna di cellule normali). È un saggio in vitro che

si basa sull’osservazione delle alterazioni morfologiche provocate da una sostanza capace di

trasformare una cellula normale in cellula maligna. Le cellule normali aderiscono alla superficie della

piastra, formando un monostrato. Quelle trattate con un cancerogeno si riproducono senza attaccarsi

ad una superficie solida e crescono al di sopra del monostrato. La presenza di tali colonie

multistratificate indica la trasformazione maligna, che può essere confermata iniettando tali cellule

negli animali e osservando lo sviluppo di tumori maligni. I risultati di questo saggio sono

potenzialmente molto importanti ai fini della valutazione del potenziale cancerogeno. 105

La predittività dei test a breve termine dipende da:

• meccanismo dell’effetto cancerogeno; ad es., i cancerogeni non genotossici (promotori) non danno

risultati positivi ai test di mutagenesi; i metalli cancerogeni non danno risultati positivi al test di Ames.

• potenza della sostanza: in generale, la predittività aumenta all’aumentare della potenza cancerogena.

• specie-specificità: composti che inducono tumori in più specie animali sono identificati più esattamente

rispetto a composti cancerogeni in una sola specie. Ad es., confrontando i risultati del test di Ames con

quelli di cancerogenesi animale per le ammine aromatiche e nitro composti, è risultato che il test

identificava positivamente il 93% dei composti cancerogeni sia nel topo che nel ratto, il 100% dei composti

cancerogeni in entrambe le specie.

• Possibili ‘falsi negativi’ negli studi di cancerogenesi animale Þ incorretta riduzione della predittività

I dati degli studi di genotossicità a breve termine sono utilizzati per:

• Contribuire alla valutazione del potenziale cancerogeno di una sostanza al fine di stabilire decisioni

regolatorie (prima e dopo l’immissione nell’ambiente)

• Indirizzare i produttori nella scelta delle sostanze da sviluppare (farmaci, pesticidi ecc.)

• Individuare le priorità di studi più approfonditi per sostanze già immesse nell’ambiente 106

CANCEROGENESI

In molti paesi il cancro può essere una delle cause più importanti di morte. Può essere provocato da

numerosi fattori, tra cui i più importanti sono:

Le prime osservazioni epidemiologiche sulla possibile relazione tra agenti causali estrinseci e cancro

risalgono alla metà del 700, con le osservazioni cliniche di Hill sull’associazione tra l’uso di tabacco e

l’insorgenza di polipi nasali, seguite da quelle di Pott sull’associazione della deposizione cronica di fuliggine

tra le pliche cutanee scrotali degli spazzacamini e la successiva insorgenza di carcinomi in quella sede.

Curling notò come spesso intercorressero anni tra l’esposizione all’agente ritenuto cancerogeno e

l’insorgenza della neoplasia.

La maggiore attenzione era tuttavia rivolta alla cancerogenesi chimica: le prime informazioni basilari per la

comprensione del processo di cancerogenesi si devono agli studi di Yamagawa-Ichikawa, che spennellando

ripetutamente catrame sulla cute rasata di orecchi di conigli, ottennero la formazione di tumori epiteliali.

Dal catrame venne isolato il primo principio attivo cancerogeno appartenente alla famiglia degli IPA: il

benzopirene.

Fu solo nel 900 che, con Boveri prima e Bishop in seguito, si ebbero i primi dati sperimentali che

correlavano l’insorgenza di cancro ad eventi di mutagenesi nel genoma.

Il termine “cancerogenesi chimica” viene usato per indicare l’induzione o l’incremento di incidenza di

neoplasie dovute a sostanze chimiche. 107

La cancerogenesi chimica è un processo multistadio, che si compone di tre tappe fondamentali:

INIZIAZIONE: è un evento

immediato che danneggia il genoma

cellulare irreversibilmente tramite

mutazioni in genere puntiformi, a

meno che non abbia luogo una

riparazione enzimatica del suddetto

danno prima della replicazione

cellulare. Data l’irreversibilità del

fenomeno, sia dosi frazionate del

cancerogeno somministrate in

successione che una singola dose di

pari entità, provocano il medesimo risultato sulla cellula colpita. Pertanto, è difficile stabilire dosi soglia. Si

definiscono AGENTI INIZIANTI O INIZIATORI quei cancerogeni chimici che si legano in maniera covalente al

DNA formando addotti che portano a mutazioni.

Tra i meccanismi molecolari che causano modificazioni delle singole basi si hanno:

 Incorporazione di analoghi delle basi: un esempio è costituito dal 5-bromouracile (5-BU) che, nel caso di

carenza di timina libera al momento della replicazione del DNA, si lega facilmente al suo posto al

filamento di DNA e si accoppia all’adenina. Il 5-BU però passa rapidamente dallo stato chetonico a

quello enolico (tautomerismo chetoenolico), in conseguenza del quale si lega alla guanina. Se la

transizione coincide con la replicazione del DNA, una guanina viene incorporata al posto della adenina.

Alle successive replicazioni del DNA, la guanina si lega alla sua base complementare, es. citosina. In

altre parole, si verifica una transizione da una coppia di basi A-T ad una G-C.

 Modificazioni chimiche nelle basi: le basi possono essere alterate chimicamente, ad esempio dalla

idrossilammina e dall’acido nitroso. Ad esempio, in presenza di acido nitroso si ha deaminazione

dell’adenina, con formazione di ipoxantina. Durante la replicazione del DNA, l’ipoxantina si comporta

come la guanina e si lega alla citosina. Alla replicazione successiva, la citosina si lega alla guanina, con

avvento quindi di una transizione A-T G-C.

 Legame di un agente chimico alle basi: questo tipo di evento può avvenire al seguito di alchilazione, ad

es. da parte di gas mostarde, metansulfonato, epossidi. Questi mutageni di solito alchilano la posizione

N7 della guanina o, in minor misura, la posizione N3 dell’adenina o la 06 della guanina. I gas mostarde

causano alchilazione di G che non si lega più esclusivamente a C, ma anche a T. Nella successiva

replicazione del DNA, T si lega ad A, con avvento di una transizione G-C A-T. Mutazioni possono essere

indotte anche al seguito di legame con composti relativamente grandi con formazione dei cosiddetti

108

“bulky adducts”. È il caso degli idrocarburi policiclici aromatici, quali benzo(a)pirene. Un suo specifico

metabolita, il 7,8-diidrodiol-9,10-epossido si lega covalentemente al gruppo amminico di G. le

mutazioni puntiformi che ne derivano sono principalmente transversioni G-C T-A.

 Modificazioni spontanee delle basi: modificazioni spontanee possono avvenire in certe condizioni

fisiologiche, sebbene le basi del DNA siano chimicamente stabili.

A seguito del danno sono possibili 4 risposte:

a) meccanismo di riparazione (rimozione del DNA danneggiato)

b) meccanismo di tolleranza (il danno viene “ingannato” e non viene “fissato”)

c) apoptosi

d) sviluppo proliferativo

Grazie alle conoscenze di biologia molecolare sono stati identificati molti geni la cui funzione viene alterata

durante lo sviluppo di molte forme di tumore. Questi geni rientrano in due classi: oncogeni e

oncosoppressori.

Gli studi sugli oncogeni hanno rivelato che sequenze di DNA ad essi omologhe sono presenti anche nel

genoma di cellule normali prima che avvenga la trasformazione cancerosa. Tali geni sono detti proto-

oncogeni e sono essenziali per il normale funzionamento cellulare, avendo un ruolo spesso collegato ai

processi di trasduzione del segnale e di divisione cellulare. Mutazioni o un’espressione alterata di questi

geni può conferire alla cellula un comportamento neoplastico.

I proto-oncogeni principali: 109

I meccanismi principali della loro attivazione sono:

Un esempio dell’attivazione di un oncogene è la traslocazione di c-myc coinvolta nell’insorgenza del linfoma

di Burkitt. In tale patologia, il proto-oncogene c-myc è traslocato dal cromosoma 8 al locus delle catene

pesanti delle immunoglobuline IgH sul cromosoma 14, che causa un’abnorme espressione del c-myc.

Le proteine G codificate dagli

oncogeni ras vengono definite

p21ras e sono monomeriche,

diversamente da quelle coinvolte

nella via metabolica del cAMP che

sono eterotrimeriche. La

differenza tra la forma normale,

codificata dal proto-oncogene, e

la forma mutata codificata

dall’oncogene, è costituita da

un’unica sostituzione

aminoacidica a livello di un sito

critico per la regolazione

dell’attività della proteina. Si

tratta dunque di una mutazione

puntiforme che comunque

comporta conseguenze devastanti: infatti l’attivazione di ras è riscontrata nei tumori più diffusi (fegato,

colon, polmone) e si ritiene rappresenti il primo passo nella progressione neoplastica. Le p21ras

partecipano alla cascata di trasduzione del segnale mitogeno dai diversi tipi di recettori di membrana agli

elementi di trasduzione distali situati a livello del citoplasma ed infine del nucleo. Le forme mutate delle

proteine G codificate dagli oncogeni ras presentano in generale una ridotta capacità di degradare il GTP, il

nucleotide che le attiva, con conseguente limitazione della funzione della loro autoinattivazione. In latre 110

parole, le proteine G mutate sono costitutivamente attive e continuano a stimolare le cascate di reazioni

regolatorie in cui sono coinvolte.

Esiste un altro gruppo di geni coinvolto nello sviluppo dei tumori, detti geni oncosoppressori. Mutazioni che

aboliscono la funzione di questi geni provocano lo sviluppo tumorale, in quanto essi regolano

negativamente la proliferazione cellulare e promuovono il differenziamento.

Il primo di questi geni ad essere identificato è stato il gene del retinoblastoma, Rb.

Il gene codificante per la proteina p53 è un

oncosoppressore il cui ruolo principale è regolare in senso

negativo la proliferazione cellulare. In particolare, p53 è un

mediatore chiave della risposta cellulare al danno al DNA.

Danni diretti al DNA operati da diversi agenti inducono un

accumulo di p53, a cui consegue l’arresto del ciclo cellulare

in G1 operata da p21, inibitore delle chinasi ciclina-

dipendenti. Al blocco del ciclo segue la riparazione del DNA

stesso operata da GADD45, al fine di evitare la

trasmissione di lesioni geniche alla progenie. Nel caso in

cui il danno sia troppo ingente da essere riparato, p53

promuove invece l’eliminazione della cellula mediante

apoptosi. Infatti, essa promuove l’attivazione di fattori

proapoptotici come Bax ed inibisce i membri antiapoptotici

della famiglia del Bcl-2. È comprensibile come lo stato di p53 normale o mutata sia un parametro

importante da valutare nell’ambito della cancerogenesi. 111

Il processo di cancerogenesi è iniziato da cancerogeni genotossici, detti anche DNA reattivi. Essi sono in

grado di interagire chimicamente col DNA formando addotti con il materiale genetico. La maggior parte dei

cancerogeni di questo tipo sono composti molto reattivi, elettrofili che reagiscono quindi con grande facilità

con atomi ricchi di elettroni come l’O in posizione 6 e l’N in posizione 7 della guanina. I cancerogeni DNA

reattivi possono essere attivi di per sé oppure possono essere trasformati in composti elettrofili in seguito

ad attivazione metabolica. Tali composti DNA reattivi sono efficaci già dopo una singola dose (in genere

subtossica), agiscono in maniera cumulativa con altri cancerogeni aventi lo stesso organotropismo,

pertanto risulta difficile stabilire il loro livello soglia.

I loro effetti sono aumentati dai cosiddetti promotori o co-cancerogeni. Come già detto, il DNA danneggiato

può essere riparato dai meccanismi di proofreading. Se nonostante tali sistemi di riparazione la cellula

entra nella fase S del ciclo, quando il DNA danneggiato è ancora presente, possono verificarsi morte

cellulare e mutazioni. Se la mutazione coinvolge geni critici (proto-oncogeni o oncosoppressori), è possibile

l’evoluzione di una neoplasia. Ad ogni modo, Iniziazione non significa neoplasia!

Riassumendo quindi:

CANCEROGENI GENOTOSSICI PRIMARI

 METALLI E IONI METALLICI (Arsenico, Cromo VI, Cadmio,

Cobalto, Berillio, ecc). Non sembrano agire come

elettrofili ma risultano genotossici in saggi biologici

rapidi. Sanderman nell’84 ha elencato le seguenti ipotesi

sui meccanismi di cancerogenesi dei metalli. I cationi

metallici si legano covalentemente al DNA, formano

cross-link tra DNA e proteine o tra eliche di DNA

adiacenti, inficiano la fedeltà della replicazione del DNA

alterando la conformazione della DNA polimerasi,

influenzano la struttura della cromatina e di

conseguenza l’espressione genica. 112

 COMPLESSI DI COORDINAZIONE DEL PLATINO (cis-platino)

 AGENTI ALCHILANTI: tra questi si annoverano le mostarde azotate che alchilano la guanina in posizione

7, i composti di coordinazione del platino (cis-platino), ciclofosfamide ecc…

 ALOETERI ( bis clorometil etere, importante intermedio dell’industria chimica, nell’uomo induce cancro

nel tratto respiratorio anche per esposizione a bassissimi livelli. In modelli animali l’inalazione di 0.1

ppm induce cancro)

 ESTERI DELL’ACIDO SOLFORICO (dimetil e dietil solfato che vanno maneggiati esclusivamente sotto

cappa)

 NITROSAMIDI, NITROSUREE, ETILENIMINE

CANCEROGENI GENOTOSSICI SECONDARI

 IPA (benzopirene, benzo-antracene): sono molecole praticamente ubiquitarie, essendo prodotte nella

combustione (pirolisi) del tabacco, delle carni o pesci affumicati o cotti alla brace, nei fumi di scarico

delle auto e nella preparazione degli asfalti stradali. Necessitano di attivazione metabolica a fenoli,

diidrodioli, chinoni e inducono tumori in vari tessuti e specie a seconda della via di somministrazione. Si

ricorda che una regione importante di tali composti è la regione baia, nella quale si formano gli epossidi

molto elettrofili che risultano essere potenti mutageni e cancerogeni. Tali epossidi si legano al DNA

covalentemente, apportando una mutazione al 12° codone dell’oncogene Hras, responsabile di tumori

al polmone ed alla cute.

 AMINE AROMATICHE E COLORANTI AZOICI: le amine aromatiche necessitano di attivazione metabolica

epatica ad opera del CYP450. Vengono idrossilate alla forma attiva e glucurono-coniugate. La

glucuronidasi urinaria è però in grado di scindere di nuovo il reattivo elettrofilo che quindi può dare

tumori vescicali.

I coloranti azoici sono stati usati in cibi, medicinali e bevande fino a che non è intervenuta una

regolamentazione. Sono composti sintetici che consistono di due anelli aromatici legati tra di loro

attraverso un legame azoico (-N=N-). Ad uno degli anelli presentano un gruppo amminico da cui

dipende la loro attività cancerogena. Infatti, il gruppo amminico viene idrossilato e successivamente

metabolizzato in esteri. Assai noto è il DAB (4-dimetilamminoazobenzene) o giallo burro, usato come

colorante del burro prima della scoperta della sua cancerogenicità.

 NITROSAMINE: derivano da amine secondarie o amidi tramite nitrosazione. Sono potenti mutageni e

cancerogeni che si formano per interazione a pH acido tra amine secondarie e acido nitroso. Le

nitrosamine vengono convertite in forme reattive dalle mono-ossigenasi e sono in grado di interagire

col DNA alchilandolo. Sono presenti come tali in alcuni alimenti oppure si formano nello stomaco per

interazione fra alimenti contenenti nitrati o nitriti ed ammine secondarie.

 PRODOTTI NATURALI, VEGETALI E DI NATURA MICROBIOLOGICA: il safrolo è un composto aromatico

tossico presente in alcuni vegetali utilizzati anche nell'alimentazione umana, pertanto si tratta di una

sostanza antinutrizionale. È presente nello zafferano, nel prezzemolo, nel pepe nero, nell'anice stellato,

nella noce moscata, nel cacao e nel sassofrasso. Le principali fonti del composto sono gli olii di

zafferano, di sassofrasso e di canfora. Il composto lega il DNA ed è epatocancerogeno secondo

esperimenti condotti. Viene utilizzato per produrre l'ecstasy. 113

Le aflatossine sono prodotte principalmente da due tipi di muffe:

Aspergillus flavus e parasiticus, per questo appartengono alla più

vasta categoria delle micotossine. Oltre a queste due specie

principali, le micotossine vengono prodotte anche da Aspergillus

nomius e niger. Il nome aflatossina deriva proprio da quello di A.

flavus, responsabile della prima epidemia da micotossine descritta,

riscontrata nel 1961. Queste muffe producono almeno 13 diversi

tipi di aflatossine tra cui le B1, B2, G1 e G2 considerate tra le più

pericolose (di cui la B1 è la più tossica, previsto saggio FU per la sua

presenza/assenza), e due prodotti metabolici M1 ed M2. Le

aflatossine sono tossine potenti, cancerogene (agiscono da

inizianti), mutagene e immunosoppressive. Aspergillus flavus è

comune in natura e più spesso è trovato quando alcuni cereali

crescono in condizioni di siccità. Si ritrova nel suolo, nella

vegetazione in decomposizione, nel fieno ed invade tutti i tipi di

substrati organici, soprattutto in condizioni di alta umidità ed alta

temperatura. Tra i vegetali a rischio vi sono il grano, il sorgo, l’orzo,

il riso e la soia. Le aflatossine possono ritrovarsi nei vegetali sia prima che dopo il raccolto. Dopo il raccolto

la crescita fungina è facilitata da condizioni di umidità e dalla presenza di micro e macroparassiti. I prodotti

maggiormente a rischio sono: frumento, arachidi e semi di cotone, seguiti in misura minore da: latte,

formaggio, mandorle, nocciole, fichi, spezie, uova e carni. Le aflatossine, ad esempio la B1, sono attivate a

livello epatico dal CYP450 ad epossidi, i quali possono subire due destini: a) possono essere detossificati e

quindi inattivati, attraverso coniugazione con GSH, b) possono legare il DNA alchilandolo e quindi essere

responsabili di neoplasie al fegato e ai reni. In particolare, l’aflatossina B1 (AFB1) è metabolizzata da vari

citocromi P450, producendo AFB1-exo-8,9-epossido. L’epossido puo’ reagire con il N7 della guanina nel

DNA per formare l’addotto AFB1-N7-dG. La reazione dell’addotto con una base induce l’apertura

dell’anello della guanina formando l’addotto finale AFB1-FAPY. Per i loro effetti tossici le aflatossine sono

state utilizzate in passato come componenti di armi biologiche. Gli organi bersaglio sono per la maggior

parte quelli destinati a metabolizzare le sostanze esterne potenzialmente pericolose, come fegato, reni,

polmoni, ma sono a rischio anche sistema circolatorio e sistema nervoso. Una volta assorbite nel primo

tratto dell’intestino, le micotossine finiscono velocemente nel fegato (l’organo più esposto perché attore

principale della detossificazione), poi nei reni e via via negli altri organi. In molti casi l’organismo riesce a

detossificare parte delle micotossine e formare metaboliti (spesso ancora tossici) che vengono poi espulsi

tramite l’intestino (ad esempio attraverso la bile, se partono dal fegato) o i reni, ma anche dalle ghiandole

mammarie (come le aflatossine AFM1 ed AFM2 che possono contaminare il latte), mentre una parte resta a

far danni nei vari organi.

Fra i composti naturali genotossici vi sono anche le dialchilidrazine. Esse per esempio, si ritrovano nelle

palme del genere Cycas. A causa degli effetti tossici provocati dal consumo di farina di noci di queste palme

fu scoperta l’azione mutagena di un suo componente la cicasina. Tale sostanza è una dialchilidrazina che

viene metabolizzata nel tratto digerente in seguito all’azione delle glucosidasi batteriche producendo un

composto alchilante che provoca tumori nel tratto digerente. Altre dialchilidrazine come l’isoniazide

inducono tumori al polmone murino dopo attivazione metabolica con conseguente rilascio di idrazina. Lo

stesso si verifica per l’azossimetano e l’1,2-dimetilidrazina nel tratto digerente del topo e del ratto. 114

PROMOZIONE: stadio in cui in seguito alla stimolazione della crescita cellulare dovuta a fattori endogeni o

esogeni si ha un’espansione clonale selettiva delle cellule iniziate che evolve in una lesione preneoplastica.

Si tratta di un processo reversibile non dovuto direttamente ad un danno al DNA (causato dall’iniziante) che

richiede un livello di soglia di esposizione cronica al di sotto del quale l’effetto non si manifesta. Rispetto

agli inizianti, sono necessarie dosi elevate ed esposizioni ripetute per indurre anormalità fisiologiche,

sbilanciamenti ormonali o danno tissutale, perciò è più facile stabilire un livello soglia.

Si definiscono CANCEROGENI EPIGENETICI le sostanze che non danneggiano il DNA ma promuovono con

diversi meccanismi d’azione la crescita di tumori indotti da cancerogeni genotossici. Tali sostanze non sono

mutageni. Agiscono attraverso vari meccanismi che comportano modifiche dell’espressione genica ed

inducono una proliferazione cellulare sostenuta.

Possono essere classificati in co-cancerogeni e promotori. I primi accrescono gli effetti dei cancerogeni

genotossici se somministrati simultaneamente; i promotori aumentano gli effetti degli inizianti se assunti

dopo.

L’esempio classico di questo fenomeno è fornito da studi che dimostrano come un’applicazione iniziale

sulla cute di topo di benzopirene non induca neoplasie fin dopo l’applicazione nello stesso sito di esteri del

forbolo contenuti nell’olio di croton. A dose bassa di cancerogeno non si otteneva lo sviluppo tumorale,

anche se al benzopirene veniva aggiunto olio di croton, anche dopo molto tempo rispetto al primo

trattamento. Se i due trattamenti venivano invertiti, non si aveva alcuna evidenza tumorale. L’olio di croton

da solo, poi, non era in grado di indurre la formazione del tumore, così come non lo erano una serie di

trattamenti molto distanziati tra di loro, anche se successivi alla somministrazione del benzopirene.

Meccanismi possibili alla base dell’azione cancerogena di queste sostanze sono:

 Citotossicità (cloroformio)

 Danno tissutale cronico

 Generazione intracellulare di specie reattive (ROS) (Etanolo, TCDD)

 Sbilanciamento ormonale (DES e altri ormoni steroidei e peptidici)

 Effetti immunologici

 Attività promotrice di aumento della proliferazione cellulare

 Alterata metilazione (fenobarbitale) 115

Esempi di promotori sono sotto elencati:

* Saccarina: tale dolcificante è stato al centro di preoccupazioni per la sua potenziale nocività. Durante gli

anni sessanta diversi studi hanno suggerito che la saccarina fosse un cancerogeno per gli animali. L'allarme

tocca il livello massimo nel 1977, dopo la pubblicazione di uno studio in cui si rileva un aumento dei casi di

cancro alla vescica nei ratti alimentati con alte dosi di saccarina. Quell'anno la saccarina viene vietata in

Canada. Negli Stati Uniti la Food and Drug Administration (FDA) propone un bando, ma si scontra con

l'opposizione dell'opinione pubblica, in special modo dei malati di diabete, per i quali all'epoca non

esistevano dolcificanti alternativi. Si trova un compromesso nell'obbligo di indicare i potenziali pericoli della

saccarina sulle etichette dei prodotti che la contengono. Da allora molti studi sono stati condotti sulla

saccarina, con risultati controversi; lo studio del 1977 è stato criticato per via delle altissime dosi di

saccarina date ai ratti, un valore ritenuto assolutamente irrealistico per un normale consumatore. La

saccarina, infatti, si comporta come sostanza cancerogena se ingerita nella quantità di 4 g/kg in dose unica

116

mentre le concentrazioni di tale dolcificante negli alimenti è nell'ordine dei milligrammi. Finora nessuno

studio ha evidenziato pericoli per l'uomo, alle dosi normalmente utilizzate. Dopo 14 anni, nel 1991, la FDA

ha ufficialmente ritirato la proposta di bando.

Possiamo riassumere schematicamente le caratteristiche dell’iniziazione e della promozione come segue:

PROGRESSIONE: è la fase finale del processo di cancerogenesi in cui le lesioni preneoplastiche diventano

neoplastiche. La progressione è caratterizzata dall’acquisizione di ulteriori alterazioni genetiche da parte

delle cellule neoplastiche, che, come nel caso dell’iniziazione, coinvolgono oncogeni e/o oncosoppressori.

Queste alterazioni genetiche si riflettono in alterazioni fenotipiche del tumore quali ad esempio

l’aumentata capacità di crescita, di invasività e di capacità metastatica o in alterazioni biochimiche presenti

nelle cellule cancerose in questo stadio.

Trattandosi di alterazioni fenotipiche che

vengono acquisite in seguito a mutazioni

genetiche, ne consegue che le alterazioni

che avvengono in questo stadio della

cancerogenesi, come quelle che

avvengono durante l’iniziazione, sono

irreversibili e vengono ereditate dalle

cellule figlie. Le sostanze chimiche che

agiscono come agenti di progressione

sono in genere agenti genotossici detti

clastogeni, ossia agenti in grado di

indurre un’anomalia nella struttura di un

cromosoma. 117

Riassumendo:

 Agente iniziatore: cancerogeno incompleto capace solo di iniziare cellule normali

 Agente promotore: capace di causare l’espansione di cloni di cellule iniziate (co-carcinogeno)

 Agente progressore: capace di trasformare cellule iniziate o quelle nello stadio di promozione in cellule

potenzialmente maligne

 Cancerogeno completo: agente capace di indurre cancro partendo da cellule normali, che possiede

proprietà di agente iniziatore, promotore e progressore

Le tappe fondamentali della cancerogenesi possono essere schematizzate come segue: 118

Molti fattori cancerogeni derivano da un errato stile di vita (in genere sono associati a cattiva

alimentazione), da esposizioni occupazionali (amianto, benzene, formaldeide ecc…) o da terapie medico-

diagnostiche (agenti alchilanti, cloramfenicolo ecc…). Pertanto diventa importante esercitare innanzitutto la

prevenzione alimentare, così come limitare per quanto possibile o regolamentare l’esposizione a tali

sostanze.

Esistono evidenze sperimentali che mostrano come alcuni farmaci ad attività antineoplastica possano avere

un effetto cancerogeno. 119

Esistono estratti di piante contenenti tannini con attività cancerogena nel ratto, come ad esempio quercia,

acacia, la pianta del thè. Esempi di costituenti tossici di piante medicinali che potrebbero non raggiungere

livelli sicuri nei prodotti erboristici finiti tali da essere definiti markers negativi sono:

I cancerogeni per l’uomo sono stati classificati dalla IARC (International Agency for Research on Cancer): 120

Modelli sperimentali per l’identificazione di agenti genotossici:

1. Studi cronici di cancerogenesi nei roditori (2 anni) richiesti dalle linee guida FDA e EMEA. Specie: ratti o

topi, di entrambi i sessi. Durata: 18-24 mesi (l’intera vita dell’animale). Con l’età, gli animali sviluppano

normalmente tumori per cui è necessario comparare l’incidenza dei tumori nel gruppo trattato con quella

di un gruppo di controllo, non trattato.

VANTAGGI: lo studio a 2 anni è un buon modello per valutare il potenziale cancerogeno nell’uomo. Tutti i

cancerogeni umani noti sono risultati cancerogeni anche nell’animale, in opportune condizioni sperimentali

(con la possibile eccezione dell’arsenico).

Predittività: per carcinogeni poco potenti, i risultati sono spesso di difficile interpretazione e possono

dipendere in modo critico dalle condizioni sperimentali.

SVANTAGGI: problemi di interpretazione dei dati sull’animale. Inoltre, la sensibilità è intrinsecamente bassa

a causa di:

 lunga latenza dell’effetto;

 natura probabilistica dell’evento;

 impossibilità di utilizzare dosi troppo elevate a causa della tossicità correlata;

 tumori che si sviluppano solo a dosi tossiche;

 impossibilità di usare gruppi di animali adeguatamente numerosi (decine di migliaia);

 elevata variabilità di incidenza nei controlli non trattati (l’effetto che si osserva è sempre un aumento

dell’incidenza)

Per ottenere risultati validi ai fini della stima del rischio (classificazione), si devono quindi controllare i molti

fattori che possono influenzare la risposta:

 sensibilità del ceppo utilizzato: utilizzare ceppi sensibili ma evitare l’uso di ceppi con incidenza

spontanea di tumori (in un organo) molto elevata (dati poco utili per la valutazione del rischio

nell’uomo)

 purezza del composto in esame e sua stabilità; composizione delle impurezze (il cancerogeno può

essere un’impurezza; problema particolarmente rilevante per le piante medicinali)

 altre condizioni sperimentali: modalità di esposizione; condizioni ambientali (stabulazione);

valutazione degli effetti (esame patologico dei tessuti)

 Dosi: per aumentare la sensibilità si usa spesso, come dose più alta, la dose massima tollerata

(MTD), (molto) più alta della dose prevista nell’uomo. La maggioranza delle sostanze si è dimostrata

cancerogena solo alla dose più alta, ma non alle dosi più basse (1/2, 1/4 della MTD). A dosi pari alla

MTD si potrebbe avere saturazione dei sistemi di eliminazione-detossificazione. Dato che la MTD

produce un certo effetto tossico, è presumibile che questo effetto possa interferire con il processo

di invecchiamento, processo correlato allo sviluppo dei tumori.

Un problema spesso riscontrato in questo tipo di test è la presenza di falsi positivi, nel senso che sostanze

cancerogene nell’animale non lo sono nell’uomo. Le possibili cause di tale fenomeno sono:

• Tumori specie-specifici (spesso sono previsti studi in 2 specie)

• Sensibilità particolare nel ceppo utilizzato (dovuta a fattori farmacocinetici, corredi enzimatici particolari);

• Condizioni sperimentali (v. sopra)

• Effetti cancerogeni negli animali di dubbio significato nell’uomo (saccarina) 121

A causa dei problemi di interpretazione (risultati discordanti di studi effettuati sulla stessa sostanza da

gruppi diversi; risultati positivi solo a dosi tossiche o vicine alle dosi tossiche; tumori specie-specifici o

ceppo-specifici) e dato l’elevato costo degli studi di cancerogenesi a 2 anni (1 milione di dollari

circa), sono stati sviluppati test alternativi, in vitro o in vivo, a breve termine, che non sostituiscono, ma

fungono da supporto agli studi di cancerogenesi, ai fini della valutazione del rischio.

2. Saggi di mutagenesi a breve termine:

 saggi in vitro di mutazione genica:

- mutazione genica in vitro su procarioti (test di Ames)

- saggio della timidina chinasi su cellule di linfoma murino

- saggio della ipoxantina guanina fosforibosiltransferasi (HGPRT) su cellule di ovaio di criceto cinese (CHO) e

V79

 saggi in vivo di mutazione genica:

- saggio dei letali dominanti

- saggio di induzione di anormalità nello sperma

- induzione di mutazioni in transgeni in vivo

- alterazioni cromosomiche in vitro e in vivo

- saggio per altri danni genetici

- saggi di trasformazione cellulare 122

APPROFONDIMENTI (I): il benzene.

L’esposizione umana è dovuta al fumo di sigarette, alla benzina ed ai prodotti di lavorazione del petrolio.

Si accumula nei tessuti ricchi di grassi, in particolare nel cervello, nei surreni e nel midollo osseo.

Nella prima ora viene eliminato il benzolo ed i suoi metaboliti contenuti nel sangue e nei tessuti ad elevata

vascolarizzazione; nelle ore successive quello presente nei muscoli e nella cute e, nella terza fase, della

durata di alcuni giorni, viene eliminato il benzolo accumulatosi nei lipidi e nei tessuti poco vascolarizzati.

Il benzene è principalmente metabolizzato nel sistema reticolo-endoteliale del fegato. Le ossidasi

microsomiali trasformano il benzene in benzene epossido: questo viene poi trasformato secondo le

seguenti vie:

1. modificato in fenolo e coniugato con

solfati e con acido glucuronico prima di

essere eliminato con le urine

2. per azione del glutatione e di una

transferasi viene trasformato in acido

premercapturico ed escreto con le urine

oppure sotto l’azione di una deidrasi viene

trasformato in catecolo, coniugato con

solfati e con acido glucuronico e quindi

eliminato con le urine

3. si può frammentare dando

muconaldeide

La tossicità del benzene si sviluppa soprattutto a livello emopoietico ed epatico.

I metaboliti del benzene formano legami covalenti con il DNA nel nucleo e nei mitocondri del fegato e del

midollo osseo. Ne conseguono un’inibizione della sintesi del RNA mitocondriale, alterazioni della

funzionalità mitocondriale, e modificazioni marcate della proliferazione cellulare. Studi epidemiologici

hanno evidenziato un aumentato rischio di leucemia mielocitica e monocitica, in lavoratori esosti al

benzene. In genere la leucemia compare

dopo una latenza di circa 11 anni, ma può

comparire anche dopo esposizione per

meno di 1 anno. La leucemia può essere

preceduta da leucocitopenia,

trombocitopeniao pan citopenia. Il

benzene produce anche anemia. Sono stati

ipotizzati 3 meccanismi per spiegare

l’anemia:

1) un effetto diretto sulla membrana

cellulare che porta a lisi e

riduzione del periodo di vita

dell’eritrocita

2) un effetto diretto sulla cellula staminale che inibisce la differenziazione e di conseguenza riduce il

numero di eritrociti circolanti

3) un effetto inibitorio sugli stati proliferativi delle cellule staminali con riduzione dello sviluppo di

tutte le cellule del sangue. 123

Quest’ultima ipotesi tiene conto del fatto che il benzene causa anche trombocitopenia e granulocitopenia.

Non è ancora chiaro se il benzene possa essere considerato un cancerogeno completo per i seguenti motivi:

è noto che alcuni metaboliti del benzene possono legarsi covalentemente alle proteine e agli acidi nucleici e

alcuni metaboliti possono essere ossidati dalla perossidasi con conseguente produzione di specie reattive

dell'ossigeno (ROS) e chinoni (DNA reattivi). Diversi studi suggeriscono che la disfunzione di p53 è un

fattore potenziale di carcinogenesi indotta da benzene. Attualmente si discute su due ipotesi relativamente

all’azione leucemica del benzene:

- Secondo la prima ipotesi le interazioni, scatenanti l’anemia aplastica, del benzene e dei suoi metaboliti

con DNA, RNA, proteine di segnale e altre molecole rappresentano il presupposto di una leucemia.

- L’altra ipotesi si basa su osservazioni di aberrazioni cromosomiche nel sangue che possono persistere per

anni nei lavoratori esposti a elevate concentrazioni di benzene; le leucemie si sono sviluppate solo nei

soggetti nei quali l’aberrazione cromosomica è stata dimostrata permanere a lungo.

APPROFONDIMENTI (II): le diossine.

Con questo termine si indica un gruppo di 210

composti chimici aromatici policlorurati, ossia

formati da carbonio, idrogeno, ossigeno e cloro,

divisi in due famiglie: dibenzo-p-diossine (PCDD o

propriamente “diossine”) e dibenzo-p-furani

(PCDF o “furani”).

In base al numero e alla posizione degli atomi di

cloro è possibile distinguere 75 congeneri di PCDD

e 135 congeneri di PCDF. Le caratteristiche

chimico-fisiche variano in base al grado di

clorurazione: ad un maggiore numero di atomi di

cloro corrispondono una minore solubilità in acqua ed un più alto grado di lipofilicità. Questi composti sono

inoltre caratterizzati da una bassa tensione di vapore, che ne determina una lenta evaporazione, da un alto

punto di fusione, da una bassa biodegradabilità e da una degradazione fotochimica variabile. Tutte queste

caratteristiche ne consentono una lunga persistenza ambientale e la tendenza al bioaccumulo. Tra i

composti appartenenti a questa classe, i congeneri aventi da quattro a otto

atomi di cloro ed almeno le posizioni 2,3,7,8 clorosostituite (17 congeneri), hanno evidenziato una attività

cancerogena simile a quella causata dalla 2,3,7,8 tetracloro dibenzo diossina (TCDD), che come riportato

dallo IARC (International Agency for Research on Cancer), risulta essere un cancerogeno di Classe 1.

Sorgenti delle diossine e loro vie di esposizione umana sono:

SORGENTI

• Combustione

• Fusione, raffinazione e

lavorazione dei metalli

• Produzione chimica

• Processi biologici e fotochimici

• Comparti ambientali

d’accumulo 124

VIE

• Assunzione di alimenti, soprattutto d’origine animale

• Inalazione di polveri e vapori

• Contatto cutaneo (suolo)

Le diossine possono dare:

 TOSSICITA’ ACUTA: nell’uomo determina lesioni cutanee (cloracne) molto persistenti. Ha inoltre azione

epatotossica inducendo alterazioni nella biosintesi dell’eme.

 TOSSICITA’ CRONICA: sono state descritte alterazioni nella funzionalità epatica, disordini del

metabolismo lipidico e glucidico, alterazioni della funzionalità respiratoria, danni neurologici sia

periferici che centrali.

Un problema legato alle diossine è il loro BIOACCUMULO. Le diossine infatti si accumulano nel tessuto

adiposo. Per comprendere la tossicità di tali composti basti pensare che 1 litro di latte di mucca fornisce la

stessa quantità di diossina che assumeremmo respirando aria per OTTO MESI (Connett and Webster, 1987).

In nove mesi molta diossina accumulata in 20-30 anni nel grasso della madre, passa al feto. Per tale motivo

le diossine sembrano essere embri-feto-tossiche e teratogene.

Un po’ di storia: il caso SEVESO. L’esplosione dalla fabbrica Icmesa (Hoffmann la Roche) che produceva

l’erbicida acido triclorofenossiacetico nel 1976 ha sparso sul terreno 3.000 kg di materiale contaminato da

TCDD. Nei primi giorni è avvenuta una moria di piccoli animali (polli, conigli, gatti) e di piante, seguita da

sintomi cutanei tra bambini e acne tra adulti. L’evacuazione è avvenuta solo due settimane dopo.

L’incidente ha portato in seguito alla legge “Seveso”.

È stata studiata l’incidenza di neoplasie insorte tra il 1976 ed il 1991, nei residenti nelle tre zone al

momento dell’esplosione (classe di età 0<74 anni) e si è notato un incremento del rischio di cancro del

retto, neoplasie linfoemopoietici, leucemia mieloide e linfoma non-Hodgkin, cancro della pleura,

cancro all’esofago, sarcomi tessuti molli.

A livello molecolare, le diossine

interagiscono con il recettore

citoplasmatico AhR (recettore arilico per

gli idrocarburi AhR). L’affinità di legame

tra molecola e recettore è direttamente

proporzionale al numero di atomi di cloro

sostituiti nelle posizioni laterali. Se ne

deduce che la 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-

p-diossina (TCDD) è il composto con

maggiore affinità di legame per il

recettore. La TCDD è di un fattore di

trascrizione ligando-dipendente con

struttura elica-loopelica che regola

l’espressione di una serie di geni in una

vasta gamma di specie e di tessuti. Sono

coinvolti, ad esempio, geni che codificano per enzimi coinvolti nel metabolismo, come il gene CYP1A1.

La diossina agisce quindi da promotore della cancerogenesi. 125

TERATOGENESI

La tossicologia riproduttiva si occupa di studiare le azioni tossiche delle sostanze chimiche in tutti gli ambiti

della riproduzione, valutando in animali da laboratorio la possibilità che uno xenobiotico induca alterazioni

della fertilità, danni pre e postnatali, difetti nelle generazioni successive.

La tossicologia dello sviluppo in particolare segue i danni riconducibili all’esposizione a sostanze chimiche

sia prima del concepimento che durante lo sviluppo intrauterino (organogenesi) e postnatale, fino alla

maturazione sessuale.

Essa contempla gli studi di farmacocinetica, i meccanismi, la patogenesi e gli effetti dell’esposizione ad

agenti o condizioni che portano ad uno sviluppo anomalo, detto appunto teratogenesi. Tale processo

include:

 malformazioni strutturali

 ritardi nella crescita

 danni funzionali

 morte dell’organismo

L’esposizione ad un agente tossico può

interessare le cellule somatiche

dell’embrione/feto, con effetti teratogeni

diretti che possono portare a malformazioni

congenite, oppure può interessare le cellule

germinali materne o paterne, causando

alterazioni al feto. Tali alterazioni, se letali,

condurranno all’aborto; in caso di mancato

aborto potranno portare alla nascita di

bambini affetti da anomalie/malattie

genetiche. La valutazione del rischio per l’uomo nella

tossicologia del sistema riproduttivo è

difficile da valutare a causa della

complessità e della durata del ciclo

riproduttivo. Quindi si procederà a studi

sperimentali su animali da laboratorio atti a

valutare:

 l’unione dei gameti maschili e femminili

con corredo cromosomico normale

 il decorso della segmentazione,

impianto, sviluppo intrauterino, nascita,

fase postnatale con allattamento

 sviluppo del nascituro fino a maturità

sessuale 126

Il problema di eseguire studi di teratogenesi sull’uomo non è legato soltanto al suo lungo e complesso ciclo

riproduttivo, ma anche alla difficile interpretazione dei dati clinici e alle difficoltà di natura etica che

precedono l’approvazione dei protocolli sperimentali.

Il modello animale d’altro canto rappresenta un valido strumento per esaminare gli effetti degli xenobiotici

(sia a breve che a lungo termine) nel periodo perinatale.

La spermatogenesi è un processo ormono-dipendente che si instaura dopo la pubertà e procede

continuamente, senza alcun ciclo, fino ad età avanzata. Avviene nei testicoli, all’interno dei tubuli

seminiferi, dove le cellule del Sertoli oltre a secernere ormoni e proteine importanti per il

processo,formano le baso funzionali per la barriera sangue-testis, che impedisce l’ingresso di sostanze

polari e macromolecole nei tubuli.

I farmaci possono indurre i seguenti danni al sistema riproduttivo maschile:

- impedimento alla formazione degli spermatozoi (etanolo, metalli pesanti, agenti citotossici)

- danno alla loro capacità fertilizzante (antiandrogeni, sulfasalazina, agenti citotossici)

- anomalie nella discendenza (agenti citotossici)

Nella donna, dalla pubertà alla menopausa, maturano circa 400 ovociti. Durante il ciclo ovarico mensile

nell’ovaio matura una sola cellula uovo in ogni follicolo primario. Durante la maturazione dell’ovocita, poco

prima dell’ovulazione, avviene la dimezzazione del corredo cromosomico. Agenti genotossici possono

danneggiare il DNA degli ovociti durante la meiosi ed alterare così la fertilità. Danni di questo tipo portano

alla morte dell’embrione nella prima fase della gravidanza.

La teratologia, dal greco “creazione di mostri”, si occupa dello studio degli effetti negativi indotti nel

periodo che va dal concepimento alla nascita dell’individuo.

Nel 1960 fu dimostrata l’associazione fra assunzione di talidomide, farmaco sedativo/ipnotico, usato anche

per migliorare la nausea e il vomito durante la gravidanza, e la nascita di bambini gravemente malformati

con amelia (completa assenza degli arti) o focomelia (riduzione della lunghezza delle ossa degli arti).

Coesistevano: malattie cardiache congenite, anomalie oculari, intestinali e renali, malformazioni

dell’orecchio esterno ed interno. Tuttavia, nei test tossicologici su animali da laboratorio, alle dosi

terapeutiche, il farmaco non aveva dimostrato tali effetti. Questo ha indotto a pensare che la teratogenesi

sia un evento specie-specifico. A causa di tale catastrofe, le agenzie regolatorie in molti paesi cominciarono

a richiedere saggi sull’animale in via di sviluppo separatamente dagli studi di tossicità cronica, per valutare

gli effetti dei farmaci sugli esiti della gravidanza.

Già qualche anno prima il problema della teratogenesi diventava così preponderante da portare

all’elaborazione dei principi di teratologia di Wilson da parte dello stesso:

1. La suscettibilità alla teratogenesi dell’embrione o del feto dipende dal genotipo del concepito e da

fattori ambientali (es. salute della madre)

2. La suscettibilità alla teratogenesi varia con lo stadio di sviluppo dell'embrione. Ci sono periodi più critici

di suscettibilità agli agenti tossici

3. Gli agenti teratogeni agiscono in modo specifico sulle cellule in via di sviluppo e sui tessuti per avviare

una sequenza di eventi inerenti allo sviluppo anormale

4. L'accesso dell’agente tossico all’embrione o al feto in sviluppo dipende dalla natura chimico-fisica

dell’agente stesso. Diversi fattori influenzano la capacità di un teratogeno di entrare in contatto con un

embrione in via di sviluppo, come ad esempio la natura dell'agente stesso, percorso e grado di

esposizione materna, tasso di passaggio attraverso la placenta e l'assorbimento sistemico, e la

composizione dei genotipi materni ed embrionale/fetale

5. Ci sono quattro manifestazioni di sviluppo deviante (morte, malformazioni, ritardo della crescita e

difetto funzionale). 127

6. L’effetto embriotossico è dose-dipendente

L’effetto teratogeno di un tossico può avvenire in diversi

momenti della gravidanza e dello sviluppo

dell’embrione/feto.

Si parla appunto di “periodi critici” che possono essere:

 il periodo pre-impianto: va dalla fecondazione

dell’ovocita fino all’impianto della blastocisti sulla

mucosa uterina, fase in cui l’embrione, durante il

passaggio negli ovidotti, può subire effetti tossici da

parte di sostanze chimiche presenti nell’organismo

materno. In particolare, questo periodo va dal 14° al 32° giorno secondo il calendario ginecologico (che

inizia dal primo giorno dopo il termine della mestruazione ed è quindi il più affidabile) oppure dal 1° al

18° giorno secondo il calendario ostetrico (che inizia dalla data del concepimento). Questa fase dura

circa 8-10 giorni ed è definita “periodo del tutto o nulla” poiché i casi possibili sono: aborto (se il danno

è irreparabile), riparazione (se il danno è riparabile) o il caso estremo della formazione di mostri doppi

simmetrici detti ''gemelli siamesi" che possono essere craniopagi, toracopagi, ischiopagi. Non si

conosce esattamente come un tossico agisca in questa fase, ma verosimilmente non induce mutazioni

puntiformi. a a

 il periodo embrionale: va dalla 2 alla 7 settimana. Comprende le fasi di morfogenesi ed organogenesi

ed è quindi il periodo più sensibile agli effetti tossici. Dopo l’impianto, infatti, l’embrione va incontro

alla grastrulazione, processo di formazione delle tre linee cellulari primarie: ectoderma, mesoderma e

endoderma. Durante tale periodo, l’embrione è completamente suscettibile alla teratogenesi da parte

di numerose sostanze che causano malformazioni oculari, cerebrali e della faccia. Dopo il primo

trimestre i gravi danni della teratogenesi a livello morfologico sono più rari.

a

 il periodo fetale: va dall’8 settimana al termine della gestazione e comprende il differenziamento

istologico e funzionale così come l’accrescimento corporeo. La formazione degli organi non è ancora

completa, ma tutti gli organi sono presenti e grossolanamente riconoscibili. È la fase da cui

dipenderanno le alterazioni funzionali e comportamentali. 128

I meccanismi con cui un teratogeno può agire sono:

Placenta: i moderni metodi analitici hanno

evidenziato come la maggior parte dei

farmaci sia in grado di attraversare la

placenta. Per tale ragione oggi non si parla

più di barriera placentare ma piuttosto di

filtro placentare. Il passaggio di un

farmaco attraverso la placenta è un

processo bidirezionale, anche se in effetti

si verifica un trasferimento netto in

direzione fetale, che può avvenire per

diffusione passiva semplice, trasporto

facilitato o attivo mediato da carries. I

fattori che regolano tale trasporto

riguardano le proprietà chimico-fisiche

delle sostanze in causa, ma anche le

caratteristiche anatomico-funzionali della

placenta. Le caratteristiche chimico-fisiche

delle sostanze svolgono un ruolo

importante nel definire l’entità del

passaggio transplacentare. A tale proposito

vanno ricordate le dimensioni, il peso

molecolare, la liposolubilità e il grado di

ionizzazione del farmaco, così come la sua

affinità per le proteine di legame.

Le molecole di basso peso molecolare (più

piccole di 600 dalton) attraversano più

facilmente il filtro placentare. Molecole con

peso superiore ai 1000 dalton non riescono

ad arrivare al feto salvo rare eccezioni.

Comunque, poiché la maggior parte dei

farmaci ha un peso inferiore ai 600 dalton, 129

praticamente tutti raggiungono la circolazione fetale. Per farmaci che siano basi o acidi deboli, il pH del

mezzo può influenzare il grado di dissociazione e quindi la liposolubilità. In particolare, aumentando la

liposolubilità, aumenta la probabilità che le sostanze passino dalla madre al feto; mentre sostanze idrofile

tenderanno a passare in misura minore, essendo la placenta una “barriera di natura lipofila”.

Man mano che la gravidanza procede si assiste ad un assottigliamento della placenta ed anche ad un

aumento della superficie di scambio madre-feto. Per ciò che concerne l’eliminazione placentare dei

farmaci, va ricordato che la placenta è in grado di sequestrare, accumulare e metabolizzare sostanze

circolanti sia nei vasi materni che fetali. La capacità di accumulo è stata dimostrata per alcuni metalli, tra cui

Hg e Cd, ed ormoni tra cui l’estradiolo. Al termine della gravidanza la placenta possiede tutte le principali

vie metaboliche di biotrasformazione (come un piccolo fegato). Questi meccanismi, come quelli epatici,

appaiono inducibili almeno negli ultimi mesi di gravidanza, sia da farmaci come i barbiturici che da fumo.

Comunque, il contributo della placenta alla biotrasformazione dei farmaci sembra quantitativamente poco

rilevante. La circolazione fetale presenta caratteristiche anatomiche che la differenziano nettamente da

quella dell’adulto: il sangue che proviene dalla vena ombelicale è carico di ossigeno, sostanze nutritive ed

eventualmente di farmaci. È da tenere presente inoltre che il pH del sangue fetale è più basso di quello

materno di 0,1 unità di pH. Questo diverso equilibrio acido-base fa si che nel comportamento fetale le basi

deboli siano più ionizzate degli acidi deboli, con una conseguente alterazione dei rispettivi equilibri. Ciò può

portare all’accumulo nel sangue fetale di farmaci quali ad esempio anestetici locali, quali lidocaina o

bupivacaina, usati per l’epidurale.

La tossicità nei confronti della placenta può compromettere le sue funzioni, in particolare la capacità di

produrre ormoni critici per mantenere la gravidanza e le capacità di metabolizzare gli xenobiotici.

Numerose sostanze sono tossiche per la placenta tra cui si annoverano metalli pesanti come Cd, As e Hg,

fumo di tabacco, etanolo, cocaina, salicilato di sodio, dietilstilbestrolo…

I teratogeni possono essere di tipo diretto o indiretto: è diretto quando l’effetto si esplica direttamente

sull’embrione o sul feto perché il farmaco è somministrato direttamente al prodotto del concepimento

tramite i villi e la circolazione placentare determinando inibizione o deviazione di una certa reazione

enzimatica. È indiretto quando l’effetto dannoso si esplica sulla madre riducendo la capacità di trasfondere

l’ossigeno o causando iper- o ipoglicemia o riducendo la disponibilità di vitamine.

Alcuni teratogeni possono agire con entrambi i meccanismi; è questo il caso dei metalli, della cocaina,

dell’etanolo ecc…

Il cadmio in particolare interferisce col trasferimento dello zinco attraverso la placenta. Le carenze dello

zinco provocano apoptosi eccessiva mediante attivazione delle caspasi, enzimi intracellulari in grado di

degradare specifici substrati cellulari. Le conseguenze della carenza di zinco durante la gestazione possono

talora manifestarsi, per il neonato, con la prematurità, peso scarso, e con la comparsa di malformazioni. Il

ritardo nella crescita è molto frequente in caso di madri fumatrici, poiché il tabagismo crea un

abbassamento dello zinco leucocitario ed aumenta il tasso di cadmio tissutale, che agisce come antagonista

dello zinco. Il principale effetto teratogeno da carenza di zinco, dovuta all’aumento di cadmio, si traduce in

un difetto di chiusura del tubo neurale e quindi evolve in patologie di natura neuroteratogenica. 130

Il metil-mercurio (contaminante ambientale presente nel pesce e nei prodotti ittici) induce una sindrome

da paralisi cerebrale nel bambino, ritardo nell’apprendimento e rende i bambini più aggressivi anche se alla

nascita sembrano normali. Il mercurio è naturalmente presente in natura. Il problema legato alla sua

tossicità è dovuto al suo accumulo, in particolare nella forma metilata. Tale forma, estremamente lipofila, si

produce nelle acque ad opera della flora marina (alghe) e risale la catena alimentare da pesci piccoli a pesci

più grandi. Il consumo di carni “intossicate” di pesci grandi come il tonno, fa si che il metallo passi la

barriera ematoencefalica e si accumuli a livello del SNC, esplicando la sua neurotossicità. Mentre negli

adulti il consumo di tale pesce contaminato causa lievi effetti, in utero l’esposizione a metilmercurio causa

effetti teratogeni prevalentemente di natura neurologica. È da annoverare anche il caso dell’Iraq dove si

sono verificate malformazioni, cecità e morte, dovute alla presenza del mercurio usato come

anticrittogamico nei cereali.

Piombo: è senza dubbio uno dei metalli pesanti più studiati per i suoi effetti in relazione allo sviluppo del

SNC e SNP. Il piombo interferisce con i meccanismi sinaptici dei neurotrasmettitori ed in particolare

compete con il calcio, sostituendosi a questo secondo messaggero coinvolto in innumerevoli pathways

cellulari. Il feto è particolarmente sensibile al piombo che oltrepassa la sua barriera ematoencefalica

ancora immatura. In particolare, su animali da laboratorio, ma anche sull’uomo si è visto che l’esposizione a

questo metallo nel periodo perinatale causa reazioni avverse sullo sviluppo comportamentale e sulla

funzione cognitiva con diminuzione del Q.I. Sono stati evidenziati effetti tossici a livello del sistema visivo.

Per tale motivo il piombo è stato tolto dalla benzina e dalle vernici.

A livello scheletrico, il piombo compete con il calcio nel fissarsi a ossa e denti alterandone e struttura e

funzionalità. A livello ematico, il piombo blocca due vie enzimatiche caratterizzanti la biosintesi dell’eme

(ala-deidratasi che converte il substrato ala in protoporfirina IX, e ferro-chelatasi che trasforma la

protoporfirina IX in EME ). 131

Arsenico: la tossicità di questo metallo è dovuta alla sua forma pentavalente la quale presenta isochimismo

con il gruppo fosfato. È facile capire come tale metallo pesante, possa interferire nella sintesi dell’ATP e del

DNA, determinando così il suo potenziale cancerogeno e teratogeno. L’arsenico si accumula nelle cellule

dove spesso subisce una doppia metilazione, a dimetilarseniato nel caso del pentavalente o arsenito nel

caso del trivalente, entrambi estremamente lipofili e in grado di attraversare la barriera emato encefalica.

Inoltre l’arsenico ha un potente effetto mutageno che sembra essere dovuto ad alterazioni del sistema di

riparazione dei danni al DNA.

Ritardanti di fiamma (eteri difenilici polibromurati): sono composti lipofili e persistenti che si accumulano

anche perché sono resistenti alla degradazione. Sono largamente usati nella produzione di oggetti di uso

comune con componenti plastiche o tessili, come prodotti elettronici, vestiti e mobili, ma anche in molte

schiume poliuretaniche qualora sia prevista, per essi, una classificazione di reazione al fuoco. I BFR sono

comunemente utilizzati in prodotti elettronici come mezzo per ridurre l'infiammabilità dei prodotti. Viene

tuttavia aspramente contestata la loro tossicità, dal momento che i BFR hanno potenzialità nocive

specialmente per il sistema nervoso umano (si parla di neurotossicità) e in particolare ha fatto discutere il

loro impiego in oggetti d'uso come i cuscini e i materassi, a contatto dei quali ognuno trascorre circa 8 ore

ogni notte.

DES (dietilstilbestrolo): è un estrogeno non steroideo di sintesi. Utilizzato dagli anni ’40 agli anni ‘70 negli

Stati Uniti per prevenire l’aborto in quanto stimola la sintesi di estrogeni e di progesterone nella placenta.

Purtroppo il suo uso è stato correlato poi ad alcune malformazioni: l’uso materno nel primo trimestre di

gravidanza causa nei nati di sesso femminile una maggior incidenza, tra i 15 e 22 anni, di adenocarcinomi a

cellule chiare della vagina, tumore raro prima dei 30 anni di età.

Nei nati di sesso maschile causa una aumentata incidenza di cisti dell’epididimo, di testicoli ipotrofici, di

ridotto volume e qualità dello sperma.

Retinoidi: è noto da oltre 50 anni che l’eccesso di vitamina A (retinolo) induce malformazioni della faccia,

degli arti, del cuore, del SNC e dello scheletro. Il periodo embrionale suscettibile alla teratogenicità da

retinoidi è molto ampio e comprende tutte le fasi organogenetiche.

Esistono in commercio preparati a basi di retinoidi (isotretinoina) da usarsi contro l’acne (Roacutan).

Nonostante i controlli e le limitazioni di prescrizione cui sono sottoposti questi farmaci, casi di bambini

malformati, caratterizzati dalla mancata chiusura del tubo neurale, continuano a registrarsi.

Qualora una donna che ha l’acne volesse avere una gravidanza, curerà l’acne dopo il parto. Invece, se una

donna volesse curare l’acne, a prescindere da una gravidanza voluta o meno, essa farà uso obbligatorio,

secondo quanto previsto dai protocolli regolatori, di anticoncezionali orali in associazione alla terapia con

retinoidi.

Acido valproico: è un farmaco anticonvulsivante che causa delle malformazioni del tubo neurale (spina

bifida che si determina prima del 40° giorno di gestazione calcolato secondo il calendario ginecologico).

Se la donna in gravidanza è epilettica, potrà assumere un altro antiepilettico non teratogeno, per tutta la

gravidanza, in quanto non potrà sospendere la terapia. Nel caso volesse utilizzare comunque l’acido

valproico, essa potrà farlo dopo il 5° mese di gravidanza, periodo dopo il quale non si manifestano più i suoi

effetti teratogeni. 132

Bendectina: la bendectina (dossilamina e piridossina), usata per alleviare la nausea mattutina non sembra

essere tossica per lo sviluppo umano. Un caso di bambino nato con una riduzione monolaterale della

lunghezza del braccio scatenò però una causa legale, vinta dalla casa farmaceutica, ma che la costrinse a

cessare la produzione nel 1983.

Etanolo: l’alcool è il teratogeno chimico più diffuso nel mondo come causa di malformazioni e ritardo

mentale nell’uomo la FAS (sindrome fetale da alcool) è definita dalla serie di anomalie somatiche e

neurologiche caratteristiche dei figli di donne che hanno assunto

alcol durante la gravidanza o nei giorni immediatamente

precedenti. La FAS comprende dismorfismi cranio-facciali, ritardi

della crescita intrauterina e post-natale, ritardo nello sviluppo

psicomotorio e intellettivo. Il Q.I. patologico medio è di 68 vs un

Q.I. normale di 90-110. L’espressione completa della sindrome è

stata osservata solo in bambini nati da madri alcolizzate e

l’incidenza tra le alcoliste è del 2,5 %. Non è stata identificata una

dose soglia, per cui anche un bicchiere di vino può essere

teratogeno. Tuttavia, è verosimile che il livello di assunzione di

etanolo atto a causare SFA sia di circa 100 g/die.

Il ritardo di crescita è il segno clinico di più frequente riscontro. È

accompagnato da ridotta lunghezza e da microcefalia, è causato

dalla distruzione delle cellule trofoblastiche della placenta che

permettono gli scambi tra la circolazione materna e quella fetale e dal conseguente minore apporto

energetico. Altrettanto comuni sono le anomalie del volto associate alla FAS: epicanto accentuato, ponte

nasale piano e largo, rime palpebrali brevi, naso corto e rivolto in alto, filtro nasale allungato, labbro

superiore sottile. Il periodo critico per FAS è il primo trimestre, periodo in cui avviene l’organogenesi.

L’alcool rimane tuttavia un teratogeno in grado di causare malformazioni fetali per tutto il periodo

gestazionale e quindi anche negli ultimi mesi. L’esposizione in utero è stata associata ad un largo spettro di

effetti, incluse isolate malformazioni tipiche della FAS e più moderate forme di disordini neurologici e

comportamentali, note come effetti fetali da alcol (EFA). Non è ben noto quali siano le cause, ma è comune

l’evidenza di un eccesso di morte cellulare in popolazioni cellulari sensibili.

Se la mamma si è esposta all’etanolo nella fase fetale della gravidanza, ossia quando l’organogenesi è

conclusa, il nascituro svilupperà la FAS con alterazioni funzionali/comportamentali, che saranno

individuabili principalmente in età scolare/infantile:

 riduzione indice Q.I

 problemi di apprendimento e di linguaggio (spesso diretta conseguenza delle alterazioni neuronali,

specie

 dell’area limbica e della corteccia frontale)

 deficit di attenzione

 problemi di adattamento sociale

 iperattività 133

Alterazioni ossee e disturbi motori sono altre caratteristiche della FAS:

• Ritardata ossificazione

• Bassa statura

• Clinodattilia (curvatura permanente laterale o mediale di una o più dita) e camptodattilia

(malformazione congenita delle dita, solitamente bilaterale, caratterizzata da una deformità in flessione

permanente delle articolazioni interfalangee, usualmente le prossimali e in particolare quella del dito

mignolo)

• Displasia congenita dell’anca

• Piede torto

• Anomalie della cassa toracica

La causa di tali alterazioni è da ricercare nella distruzione delle cellule ossee o dall’inibizione dell’azione

degli osteoblasti e da alterazioni nell’omeostasi fosfo-calcica (paratormone, vitamina D).

Il migliore “trattamento” della FAS rimane la prevenzione e quindi l’astenersi dal bere alcol in gravidanza.

Cocaina: è un alcaloide della coca che inibisce la conduzione nervosa e blocca la ricaptazione neuronale di

catecolamine (noradrenalina) e di serotonina dai terminali nervosi; ciò causa un aumento della

concentrazione del neurotrasmettitore con conseguente vasocostrizione e riduzione dell’attività motoria

(legata alla noradrenalina). Per la madre gli effetti euforizzanti della cocaina durano solo una 20ina di

minuti; invece, a livello fetale la cocaina permane per più di 2 settimane. Infatti, sembra che, a causa della

differenza di pH tra il sangue materno e il liquido amniotico, la cocaina una volta oltrepassata la barriera

placentare si protona sull’N, diventando più idrofila e restia al ritorno verso la madre. Quindi, essa si

accumula a livello fetale dove, grazie al suo ruolo di agente vasocostrittore fa sì che l’arrivo dei nutrienti al

feto sia bloccato o quantomeno ridotto. Questi meccanismi la rendono un teratogeno sia diretto che

indiretto che comporta effetti complessi e controversi quali: distacco della placenta ed altre complicazioni

ostetriche (emorragie, parti prematuri), microcefalia, alterato sviluppo del prosencefalo, sindrome

neurologica neonatale (che si manifesta con anormalità del sonno, tremori, alterazioni nutrizionali,

irritabilità, convulsioni occasionali, casi di morte improvvisa), malformazioni congenite del tratto urinario,

sindrome da distress respiratorio, morte improvvisa infantile, deficit di attenzione, memoria e

apprendimento nel bambino. L’assunzione di cocaina induce malformazioni congenite: si avrà una

sindrome da deficienza ossea e muscolare (specialmente per i muscoli addominali). I bambini nati da madri

cocainomani, inoltre, presentano ritardo del riflesso di raddrizzamento e iperattività; ancora, sono più bassi

e presentano una ridotta circonferenza cranica.

È stato inoltre dimostrato che l’uso di cocaina in gravidanza espone il feto ad alti livelli di creatina, che si

accumula come metabolita cerebrale a livello del lobo frontale e che, probabilmente, è causa di alterazioni

nell’attività neuronale legate ad un anomalo apporto energetico.

Oppiacei: l’uso di eroina ed altri oppiacei in gravidanza è stato correlato ad un aumentato rischio di:

aborto, ritardi di crescita intrauterina, prematurità, basso peso neonatale, morte infantile improvvisa. Una

donna eroinomane che si accorge di essere incinta deve smettere immediatamente di abusare di tale droga

e provvedere alla disintossicazione tramite terapia sostitutiva con metadone. Si consiglia l’impiego del

metadone fino al termine della gravidanza a dosaggi stabili per evitare la comparsa di sindromi d’astinenza

nella madre e nel feto. Le donne vanno ospedalizzate e il dosaggio del metadone deve essere determinato

valutando lo stato fisico della madre e le concentrazioni urinarie della sostanza di cui essa abusa. La 134

sospensione del trattamento sostitutivo con metadone, se necessaria, deve essere effettuata non prima

a a

della 14 settimana di gestazione e non dopo la 32 , onde evitare rispettivamente, il rischio di aborto e di

a

parto pretermine (si considera pretermine un parto prima della 36 settimana). La riduzione del farmaco, se

indispensabile, dovrà essere molto graduale anche nella fase centrale della gravidanza, per evitare sintomi

da astinenza. Gli effetti del metadone sul feto sembrano essere relativamente “benefici”. Tuttavia, i bimbi

nati da madri trattate con metadone possono manifestare segni fisici di dipendenza, quali la sindrome

astinenziale NAS (neonatal abstinence syndrome, caratterizzata da segni quali iperreflessia, tremore,

irritabilità, pianto convulso, disturbi del sonno) di entità variabile.

L’assunzione del metadone dovrebbe proteggere il feto, per quanto possibile, da fluttuazioni della

concentrazione ematica di morfina che si verificano in donne eroinomani in gravidanza.

Inoltre, proteggerebbe il feto da altri fattori di rischio (es. possibilità di contrarre infezioni virali).

Lo sviluppo embrionale può essere alterato, oltre che dall’uso di sostanze da abuso da parte della madre,

anche da patologie nel corso della gravidanza, quali:

 ASMA: la madre può assumere soluzioni inalatorie di salmetrolo e terbutalina, oppure il prednisolone

per os o im

 COMPLESSO TORCH (toxoplasma, virus della rosolia, citomegalovirus ed herpes simplex): tutti i

microrganismi del complesso TORCH attraversano la placenta ed infettano il prodotto del

concepimento anche prima che la placenta diventi funzionale.

 SIFILIDE CONGENITA: la trasmissione avviene tramite T. pallidum attraverso la placenta e si può

verificare in ogni stadio di gravidanza. Le lesioni fetali si sviluppano generalmente dopo il 4° mese di

gestazione; il danno fetale dipenderà più dalla risposta immune dell'ospite che dall’agente eziologico. I

possibili effetti sul feto sono: aborto precoce, manifestazioni di tipo infettivo che compaiono nelle

prime settimane di vita, manifestazioni tardive (compaiono dopo i 2 anni) e non infettive che

richiamano alcuni aspetti della infezione terziaria dell'adulto: neurosifilide, cheratiti, artropatie.

 AIDS (Acquired ImmunoDeficiency Syndrome): la trasmissione al feto da madre sieropositiva ha una

frequenza quasi quattro volte maggiore rispetto al virus epatite B. Ha un passaggio transplacentare e la

sua trasmissione è materno-fetale.

 EPILESSIA: non esiste una terapia specifica considerando la teratogenicità dei farmaci impiegati per

l’epilessia. Le madri di neonati con malformazioni risultano avere concentrazioni plasmatiche di

farmaco superiore a quelle delle madri di neonati sani. I neonati di madri epilettiche non rattate

farmacologicamente hanno una minore incidenza di malformazioni delle epilettiche trattate

I neonati di madri epilettiche trattate on più farmaci hanno un’incidenza maggiore di malformazione

dei neonati di pazienti epilettiche trattate con un solo farmaco. Le malformazioni frequenti: ipoplasia

delle dita e delle unghie, deformità oro facciali (labbro e palato leporino). Solo un attento monitoraggio

della paziente può determinare una sospensione momentanea della terapia soprattutto nel primo

trimestre di gravidanza. L’impiego di antiepilettici quali ad es. il fenobarbitale deve essere effettuato al

più piccolo dosaggio possibile e/o compatibile con la salute della madre. Il frazionamento della dose

ridurrebbe i picchi plasmatici. È consigliato associare ac. folico supplementare, ed è assolutamente

controindicata la somministrazione di sodio valproato e del trimetadione (levato dal commercio). Va

detto che la sospensione di farmaci antiepilettici causa un aumentato rischio di crisi epilettiche, di

cadute e traumatismi, di morte materna e fetale. Gli antiepilettici di elezione sono sotto elencati, da

usare tuttavia con opportuni accorgimenti:

• Carbamazepina: 3° trimestre possibile carenza di vitamina K e rischio di sanguinamento neonatale

• Fenobarbitale: malformazioni congenite possibili carenze di vit.k 135

• Sodio Valproato: 1° e 3° trimestre rischio di difetti del tubo neurale (spina bifida)

• Etosuccimide: 1° trimestre potrebbe essere teratogena

 DIABETE: è la più comune patologia cronica che comporta complicazioni in gravidanza. Costituisce un

fattore di rischio significativo per : malformazioni congenite, mortalità intrauterina/perinatale,

morbidità postnatale. Il diabete può essere:

 pre-gestazionale: può essere insulino-dipendente autoimmune (di tipo I) o non insulino-dipendente

acquisito (di tipo II)

 gestazionale: si manifesta con intolleranza glucidica con esordio o primo riconoscimento in

gravidanza

Il meccanismo teratogeno del diabete si può schematizzare come segue:

 Perdita dell’omeostasi del metabolismo dei carboidrati, dei grassi e delle proteine con

conseguente iperglicemia

 Complicazioni vascolari possono portare a cambiamenti metabolici aggiuntivi (ipossia, alterata

clearance delle tossine)

Pax3: è un fattore di trascrizione coinvolto nella

regolazione dello sviluppo del tubo neurale e delle creste

neurali. BAX: fattore pro-apoptotico di attivazione delle

caspasi. Quindi è importante monitorare la glicemia ematica e

laddove ci fosse un problema di diabete gestazionale,

si provveda con antiossidanti/acido folico e terapia

insulinica. Gli ipoglicemizzanti orali (metformina) si

possono somministrare dopo il primo trimestre di

gravidanza. 136

 MALARIA: Pirimetamina più Dapsone non dovrebbero più essere usati in gravidanza. Proguanil più

Atovacuone dovrebbero essere evitate a meno che non esistano alternative adeguate. Meflochina e

Clorochina: studi hanno dimostrato assenza di danni.

 MORBO DI CHRON (MC) E ARTRITE REUMATOIDE (AR): la gravidanza potrebbe influenzare

negativamente l’attività sia del MC e dell’AR. Le suddette malattie aumentano il rischio che la

gravidanza porti ad esiti negativi. Sulfasalazina mesalazina corticosteroidi: risultano ben tollerati in

gravidanza. L’azatioprina, 6-mercaptopurina: controverso parere sulla sicurezza. Metotressato:

controindicato in gravidanza associato a riassorbimento fetale ed a difetti del tubo neurale.

Ciclosporina: potrebbe essere sicura ed efficace in caso di colite grave. L’infliximab: è un anticorpo

monoclonale. L’esposizione ad infliximab entro tre mesi dal concepimento e nel primo trimestre di

gravidanza non presenta aumento del rischio di danno fetale o malformazioni alla nascita.

Durante la gravidanza devo essere considerate alcune peculiarità fisiologiche:

 Respiratorie: la donna sperimenta 1) congestione vie aeree, 2) aumento del volume corrente, 3) lieve

aumento della frequenza respiratoria (questi effetti sono dovuti all'azione del progesterone sul centro

respiratorio mediato dai chemocettori carotidei), 4) alcalosi respiratoria (Pa CO = 32 mmHg), 5)

2

riduzione della capacità funzionale residua del 15-20% al termine della gravidanza, 6) aumento del

consumo di ossigeno anche a riposo del 20% per aumento del metabolismo materno e del lavoro

respiratorio Innalzamento del diaframma (fino a 4cm) ed aumento della circonferenza toracica

 Cardiovascolari: in gravidanza si possono manifestare delle complicazioni a livello emodinamico (gittata

e frequenza cardiaca, resistenze vascolari periferiche ecc). Tuttavia l’ipertensione rappresenta la più

comune complicazione della gravidanza anche se può essere preesistente nella donna anche prima

della maternità. Nonostante ciò sono solo due gli studi controllati con placebo che hanno valutato il

ruolo del trattamento farmacologico antiipertensivo: il primo ha utilizzato metildopa che si è

dimostrata sicura in gravidanza eccetto che tra la prima e la ventesima settimana di gestazione. Anche

il secondo studio con atenololo ha permesso di determinarne la sicurezza.

 Renali: Aumento del 50-60% del flusso plasmatico renale (FPR) e della velocità di filtrazione

glomerulare (VFG) al 4° mese di gestazione, con un aumento della clearance della creatinina (i cui valori

plasmatici risultano più bassi rispetto ai valori pregravidici insieme a quelli dell'azoto ureico

plasmatico). Il FPR e la VFG tornano lentamente alla norma al temine della gravidanza.

Iperaldosteronismo con aumento del contenuto corporeo totale di acqua e sodio. Aumento della

secrezione di ADH con riduzione dell'osmolalità plasmatica. Dilatazione dei calici renali e degli ureteri

dopo il 3° mese di gestazione dovuti all'azione del progesterone. Al termine della gestazione questi

effetti sono dovuti alla compressione dell'utero gravido sugli ureteri.

La FDA ha classificato i farmaci come segue, nell’ambito della loro possibile teratogenicità:

Classe A: studi sull’uomo controllati non hanno mostrato rischi per il feto

Classe B: studi sugli animali non hanno mostrato rischi fetali, ma non esistono studi umani controllati

Classe C: effetti teratogeni o di morte embrionale sono stati evidenziati in studi animali ma non in studi

umani controllati

Classe D: esiste un’evidenza di rischio umano fetale, ma in alcuni casi, i benefici possono superare i rischi

Classe X: studi o esperienze hanno mostrato rischi fetali che sovrastano ogni possibile beneficio 137

I farmaci durante la gravidanza possono essere:

 Consentiti, tra cui si annoverano il paracetamolo, acido folico, vitamine con particolare attenzione

alla vitamina A, alcuni antibiotici ecc.

 Con effetti sul feto ma non teratogeni, non controindicati, ma sconsigliati, per i quali bisogna sempre

valutare il rapporto rischio/beneficio prima della somministrazione. Vanno ricordati i diuretici, gli

ansiolitici, salicilati (ac. acetilsalicilico, da evitare comunque nel 3°trimestre per chiusura precoce del

dotto di Botallo con induzione di ipertensione polmonare acuta fetale), antidepressivi (ADT e I-MAO) (si

escludono amitriptilina e nortriptilina che presentano un alto rischio di malformazione), antipsicotici (si

escludono zotepina,quetiapina e proclorperazina che presentano un alto rischio di malformazione),

alcuni antibiotici (cloramfenicolo e rifampicina), antidiabetici orali, vaccini (per colera, epatite A e B,

morbillo, parotite, influenza, peste, poliomielite, rabbia, tetano, difterite, tifo, varicella, febbre gialla)-

consentiti solo se strettamente necessari.

 Teratogeni da evitare, in quanto causano una maggiore incidenza di difetti congeniti,tra cui si

annoverano alcuni ACE-inibitori, alcuni antimicotici come il ketoconaziolo, i retinodidi ecc. Data la loro

eclatante teratogenicità vanno ricordati la talidomide e il DES, tra l’altro itirati proprio dal commercio.

L’altro da annoverare tra i teratogeni è il trimetadione (un antiepilettico).

Nel caso di intossicazione si può procedere come segue: estremamente indicato è l’uso immediato e

generoso d’ossigeno. Se è richiesto lo svuotamento gastrico, possono essere utilizzati lo sciroppo di

ipecacuana, il carbone attivato ed il solfato di magnesio. L’impiego di antidoti specifici dipende dal

consueto rapporto rischio/beneficio relativo alla gravidanza.

Considerazione generali sull’uso di farmaci in gravidanza: dire che un farmaco è teratogeno non significa

sicuramente che la donna che l’ha assunto darà alla luce un bambino con malformazioni, ma solo che ha

una maggiore probabilità che ciò possa accadere.

Quasi tutti i foglietti illustrativi presentano l’indicazione “controindicato in gravidanza”, ma nella maggior

parte dei casi si tratta solo di una forma di cautela proprio perché il farmaco non possiede un’adeguata

documentazione sull’impiego durante l’attesa. 138

PERIODO POST-NATALE: ALLATTAMENTO

L’escrezione di sostanze tossiche nel latte materno rappresenta un rischio rilevante per il neonato. La

maggior parte delle sostanze (farmaci, inquinanti ambientali ed alimentari, additivi alimentari) assorbite

dalla madre si ritrovano nel latte. È buona norma considerare, così come avviene per il passaggio

transplacentare, che ogni farmaco assunto dalla madre passa nel latte.

Avviene principalmente per diffusione passiva, ed è influenzata da:

1. LIPOSOLUBILITA’

2. LEGAME ALLE PROTEINE PLASMATICHE

3. pH

Sostanze lipofile secrete nel latte insieme ai lipidi provenienti dalla circolazione sistemica materna.

Maggiore è la quota libera, maggiore sarà la quantità di sostanza che passa nel latte. Favorita l’escrezione di

basi deboli. Il pH del latte (6,5‐7,2) è più acido rispetto al pH plasmatico (7,4).

Il tipo e l’entità delle reazioni avverse che possono manifestarsi a carico

del lattante dipendono da:

1. Quantità di latte ingerita dal neonato

2. Quantità e tipo di xenobiotico presente nel latte materno

Durata e frequenza poppate nell’arco della giornata. La dose ingerita dal lattante può essere calcolata in

base alla concentrazione plasmatica della sostanza nella madre e al rapporto AUClatte/AUCplasma.

• condizione di salute materna (eventuali terapie farmacologiche)

• dieta

• stile di vita (alcol, fumo, obesità)

• esposizione a sostanze tossiche (anche nel periodo precedente l’allattamento)

3. Biodisponibilità orale dello xenobiotico nel lattante: farmaci a stuttura γ-globulinica sono degradati nel

tratto GI del neonato

4. Stato di salute del neonato: la febbre aumenta la permeabilità della BEE

5. Clearance dello xenobiotico nel neonato: nel bimbo è minore rispetto all’adulto

Il neonato mantiene per un periodo di tempo post-natale molte caratteristiche fetali. I sistemi di

eliminazione (funzioni renali, secrezione biliare, coniugazione con acido glucuronico e solfoconiugazione)

non sono completamente sviluppati. Pertanto, dosi non tossiche per l’adulto possono esserlo per il

neonato. In genere i farmaci possono ritenersi sicuri se: dose/Kg lattante < 10% dose/Kg madre.

Per farmaci molto tossici, quali gli antitumorali e gli immunosoppressori è necessaria la sospensione

dell’allattamento.

I targets principali sono i sistemi ancora non completamente sviluppati:

• Sistema nervoso centrale (SNC)

• Sistema immunitario

• Sistema riproduttivo

Gli ormoni sono importanti regolatori delle fasi di sviluppo cerebrale nel periodo post-natale. In particolare,

gli ormoni tiroidei regolano lo sviluppo di ippocampo e corteccia, quelli steroidei la crescita neuronale e

il sistema riproduttivo. 139

La maggioranza dei contaminanti ambientali nel latte materno sono neurotossici e comportano disturbi

neuro comportamentali, tra cui autismo, disabilità cognitive e ritardo mentale.

Gli xenobiotici che possono passare nel latte sono: contaminanti organici persistenti (POPs) come le

diossine; metalli come mercurio, cadmio, piombo; pesticidi come gli organo fosforici e i carbammati;

inquinanti vari di natura lipofila.

Tra i farmaci che possono passare nel latte ricordiamo:

Le droghe da abuso che possono passare nel latte sono: 140

Inoltre, nel latte possono passare:

POPs: (PCB/diossine/furani e pesticidi organoclorurati) i quali mimano gli ormoni ed inducono: effetti

diretti su neuroni e cellule gliali (legame al recettore arilico Ah ed alterazione omeostasi Ca²⁺ e sequenza

degli eventi intracellulari Ca²⁺-dipendenti) ed effetti indiretti perché inducono riduzione dei livelli di

ormone T4 ed interagiscono con i recettori degli ormoni steroidei portando allo sviluppo di deficit cognitivi

e dimorfismi sessuali.

Attraverso l’allattamento vengono trasferite al bambino quantità più elevate di contaminanti lipofilici di

quanto avvenga in utero. Tuttavia nel caso dei PCB i deficit nella crescita e nelle funzioni motorie e

cognitive sono stati osservati solo in seguito ad esposizione transplacentare, anche quando il latte materno

era significativamente contaminato. Studi animali confermano che gli effetti avversi sullo sviluppo

neurocomportamentale si verificano per esposizioni PRENATALI.

Metalli: piombo e mercurio vengono escreti in grandi quantità nel latte.

Data la persistenza di molti contaminanti nell’organismo, una modifica delle abitudini alimentari della

donna in gravidanza potrebbe non essere sufficiente a proteggere il feto e il neonato. Tuttavia va segnalato

alle donne che la dieta può contribuire a ridurre il rischio per il feto e il neonato. Alimentazione variata,

ridurre il consumo di grassi animali, frutta e verdura da coltivazioni biologiche certificate.

I benefici dell’allattamento al seno sono, nella maggior parte dei casi, significativamente maggiori dei rischi.

Il latte materno rappresenta il nutrimento ottimale per il bambino, ma occorrono politiche di educazione e

prevenzione per mantenerlo “pulito”:

• Monitoraggio della qualità

• Modifica stili di vita

• Messa al bando delle sostanze pericolose a livello globale

Effetti benefici dell’allattamento al seno: a patto che vengano rispettate queste tre condizioni, il latte

materno rappresenta il nutrimento ottimale per il bambino, offre, infatti molti benefici dal punto di vista:

• nutrizionale (carboidrati, proteine, grassi, minerali, vitamine, elementi in tracce);

• immunologico (anticorpi ed altri fattori immunitari che mancano al neonato, citochine ed altri agenti anti-

infiammatori);

• endocrinologico (prolattina, corticosterone, cortisolo, insulina);

• neurologico (fattori di crescita e neurotrofine);

• neuropsicologico (in generale, l’allattamento al seno, soprattutto se prolungato, sarebbe associato ad una

migliore qualità della relazione parentale). 141

PROTOCOLLI SPERIMENTALI

La sperimentazione animale di farmaci, pesticidi, ed altre sostanze chimiche per l’individuazione di effetti

indesiderati sull’embrione è oggi resa obbligatoria in tutti in paesi, anche se con linee guida e protocolli

sperimentali diversi. Nella maggior parte dei protocolli sperimentali è previsto il sacrificio delle madri 1 o 2

giorni prima del parto, in modo che lo sperimentatore possa avere una visione generale, al momento

dell’esame necroscopico, di tutto l’apparato riproduttore. In questo modo può registrare immediatamente

alcuni parametri quali il numero di corpi lutei, il numero degli impianti, riassorbimenti, dei feti vivi, ecc...

Generalmente, una parte dei feti vivi viene esaminata attraverso tecniche necroscopiche, speciali per

evidenziare malformazioni agli organi interni ed una parte viene utilizzata per l’esame dello scheletro.

Protocolli più sofisticati, quali quello giapponese, prevede che una parte delle femmine sia lasciata

partorire, e che i nati vengano allevati fino alla pubertà e poi accoppiati, onde verificare alterazioni

comportamentali nella prima generazione F1 o alterazioni funzionali nella sfera riproduttiva.

Data la complessità del ciclo riproduttivo, per le prove di tossicologia si è dimostrato utile distinguere tre

stadi di sviluppo:

1) stadio del pre-differenziamento: l’oocita fecondato sembra non essere suscettibile alle azioni tossiche di

sostanze chimiche. Queste possono comunque provocare la morte dell’oocita per l’uccisione di tutte o della

maggior parte delle cellule. In questo caso i danni sono di lieve entità poiché le cellule superstiti, grazie agli

intensi processi proliferativi propri di questo periodo, sono in grado di formare un embrione normale

2) stadio embrionale: le cellule subiscono un intenso processo di differenziazione, mobilizzazione e

organizzazione. In questo periodo si verificano le fasi più importanti dell’organogenesi e l’embrione è più

suscettibile agli agenti teratogeni. Questo stadio ha termine generalmente fra il 10° e il 14° giorno nei

a

roditori e alla 14 settimana di gestazione nell’uomo

3) stadio fetale: caratterizzato dall’accrescimento e dalla maturazione funzionale. È poco probabile che gli

agenti teratogeni provochino alterazioni morfologiche in questo stadio, mentre possono indurre alterazioni

funzionali. Le alterazioni morfologiche sono generalmente identificate alla nascita o nel periodo

immediatamente successivo, mentre i deficit funzionali, come quelli del SNC, possono restare misconosciuti

per un certo periodo di tempo dopo la nascita

Il problema che si pone allo sperimentatore che deve definire l’eventuale tossicità di xenobiotici sul ciclo

riproduttivo è quello di decidere se utilizzare un test specifico per ognuna delle fasi del ciclo riproduttivo,

oppure di utilizzare un unico test che permetta di valutarne complessivamente le interferenze.

Si può quindi parlare di un approccio continuo e di un approccio differenziato. Con il primo si tende ad

esaminare tutto quanto il ciclo riproduttivo con un test cumulativo, cioè con studi di fertilità di tipo

multigenerazionale; con il secondo tipo di approccio invece si utilizzano test ad hoc per le diverse fasi del

ciclo riproduttivo. In pratica, si tratta dei famosi “tre segmenti” già individuati dalle prime linee guida del

1966 dall’americana Food and Drug Administration (FDA):

- segmento 1: FERTILITA’

- segmento 2: TERATOGENESI

- segmento 3: PRE- E POSTNATALE 142

SEGMENTO 1: fertilità e sviluppo embrionale precoce

Per questo studio vengono di solito usati ratti o topi di entrambi i sessi. Gli animali maschi vengono trattati

per un periodo di 2-4 settimane prima dell’accoppiamento, mentre le femmine vengono trattate ad iniziare

da 2 settimane prima dell’accoppiamento fino al giorno dell’impianto (7° giorno di gravidanza). Durante

l’esperimento gli animali vengono controllati regolarmente per la sintomatologia, per il peso corporeo, il

consumo di cibo, nonché per i cicli estrali (per le femmine). Al sacrificio (previsto a fine accoppiamento per i

maschi e in una data pre-parto stabilita per le femmine) tutti gli animali devono essere controllati per

poterne rilevare eventuali patologie dovute al trattamento. In caso si siano manifestati problemi di fertilità,

gli organi genitali vengono prelevati per un eventuale esame istologico.

SEGMENTO 2: sviluppo embriofetale

Lo scopo di questo studio è quello di verificare il potenziale teratogeno od embriotossico di un prodotto.

In questo studio vengono trattate femmine precedentemente accoppiate nel periodo della organogenesi,

vale a dire dal 5° al 6° giorno di gravidanza nel caso di roditori e dal 6° al 18° giorno nel caso del coniglio.

Al fine di ottenere sufficienti dati statistici è necessario che il numero di animali gravidi per gruppo sia

compreso tra 16 e 20. Nel corso dello studio la dose può essere mantenuta costante e riferita al 1° giorno di

trattamento, oppure, adeguata alle variazioni di peso dell’animale. Degli animali trattati vengono controllati

il peso corporeo, il consumo di cibo e di acqua ed eventuale sintomi patologici.

Al sacrificio viene effettuata un’accurata autopsia della madre e viene esaminato l’apparato genitale in

toto, ed in modo particolare:

- il numero di corpi lutei

- il numero di impianti

- il numero di riassorbimenti precoci e tardivi

- il numero e il sesso dei feti vivi e dei feti morti

- il peso individuale dei feti e delle placente

SEGMENTO 3: pre- e postnatale inclusa la funzione riproduttiva

Lo scopo di questo studio è quello di valutare gli effetti di un prodotto sull’organogenesi, nonché sul parto,

sull’allattamento e sullo sviluppo dei piccoli. In questo studio gli animali precedentemente ingravidati

vengono trattati dal 6° giorno di gravidanza al 21° giorno di allattamento. Particolare attenzione viene data

allo sviluppo dei piccoli controllandone la vitalità e lo sviluppo fisico e funzionale con l’utilizzazione di una

serie di parametri come la comparsa del pelo, l’eruzione degli incisivi, alcuni riflessi per la funzione visiva e

la capacità di coordinamento motorio. Viene inoltre osservato lo sviluppo comportamentale tramite test

idonei a valutare la capacità di apprendimento e di memoria, e il test dell’open field che valuta l’attività

spontanea in campo aperto. Viene infine studiata la capacità riproduttiva della prima generazione (F1), per

cui alcuni animali per nidiata vengono lasciati sopravvivere, raggiungere la maturità sessuale e poi

riaccoppiati per produrre una seconda generazione (F2).

Allo scopo di poter meglio estrapolare i dati all’uomo devono essere utilizzati almeno tre livelli di dose. Il

dosaggio più elevato dovrebbe indurre lievi ma chiari effetti tossici a livello della madre e/o del feto, come

una riduzione del peso corporeo. Il dosaggio più basso non dovrebbe indurre nessuna alterazione

osservabile dello stato di salute; tra queste due dosi dovrebbero essere, con appropriato intervallo, inclusi

uno o più livelli di dosi.

Sono necessari inoltre due gruppi di controllo: uno da trattare con il veicolo o con soluzione fisiologica

(controllo negativo) e l’altro con una sostanza dotata di conosciuta capacità teratogena (controllo positivo).

Questi gruppi forniranno informazioni sull’incidenza delle malformazioni spontanee (controllo negativo) e

143

sulla sensibilità, nelle condizioni sperimentali adottate, del lotto di animali impiegato nello studio (controllo

positivo).

Per quanto riguarda la via di somministrazione, viene privilegiata quella che si prevede sarà usata nell’uomo

o attraverso la quale l’uomo possa venire in contatto.

Le specie animali più usate sono il ratto, il topo (che però è più sensibile e ha maggiore incidenza di

malformazioni spontanee) e il coniglio. I primati vengono utilizzati solo quando i risultati degli studi

condotti sulle altre specie sono di dubbia interpretazione.

ONTOGENESI DEL COMPORTAMENTO

A differenza delle malformazioni di tipo morfologico, che sono già evidenziabili alla nascita, le alterazioni di

tipo funzionale non sono prontamente evidenti, ma compaiono tardivamente durante lo sviluppo e la

crescita della prole. Per verificare eventuali danni di tipo funzionale, esistono diversi test condotti durante

la vita postnatale, atti a valutare ad esempio l’apprendimento, la memoria, l’attività esplorativa ecc. Uno

degli obiettivi della teratologia comportamentale è quello di sviluppare metodi con i quali i teratogeni

comportamentali possano essere riconosciuti. A questo scopo sono stati messi a punto diversi saggi.

Esistono comunque difficoltà nella loro valutazione in quanto una larga varietà di fattori ambientali

concernenti la salute ed il comportamento delle madri e della prole nelle fasi precoci e tardive dello

sviluppo possono inficiare i risultati.

Da una visione globale della letteratura che si occupa di tale argomento si evince che la maggior parte dei

saggi sono condotti sui ratti, il che risulta essere un dato positivo considerato che questi animali

costituiscono anche una delle specie più comunemente usate per gli studi di teratogenesi.

I saggi utilizzati in teratologia comportamentale vengono suddivisi in gruppi, relativamente agli obiettivi

prioritari dei saggi stessi.

SAGGI PER LA VERIFICA DELLO SVILUPPO DEI RIFLESSI: in questi saggi, la situazione più semplice si ha

quando si osservano movimenti spontanei o indotti da semplici manipolazioni. I principali tipi di riflessi che

vengono osservati nel ratto sono i seguenti:

• il riflesso di raddrizzamento che consiste nel valutare la capacità del ratto di raddrizzarsi sulle quattro

zampe quando viene sistemato sulla schiena.

• la geotassi negativa che consiste nel valutare la capacità del ratto di rigirarsi una volta che sia posto a

testa in giù su una superficie inclinata del 20%.

• l'evitamento del dirupo che consiste nel valutare la capacità del ratto di ritrarsi dall'orlo di un banco.

• la presa palmare che consiste nel valutare la capacità del ratto di afferrare una graffetta con le zampe

anteriori se colpito sulle palme.

• l'allarme fonico che valuta la reazione dell'animale ad uno stimolo sonoro (battito di mani, suoni di

diapason).

• la stimolazione delle vibrisse che consiste nel valutare la capacità del ratto, tenuto sospeso per la coda in

modo tale che tocchi con le vibrisse una superficie, di sollevare la testa e di estendere le zampe anteriori in

direzione della superficie.

• il raddrizzamento in caduta libera che consiste nel valutare la capacità dell'animale di cadere sulle quattro

zampe se rilasciato da 35 cm di altezza, con il dorso rivolto verso il suolo.

• la stimolazione visiva che è uguale all'esperimento della disposizione delle vibrisse con la sola differenza

che le vibrisse non debbono toccare la superficie. 144

SAGGI PER LA VERIFICA DEI MOVIMENTI SPONTANEI: è importante, per questo gruppo di saggi che gli

animali studiati siano lasciati in un ambiente familiare, che non li impaurisca. I parametri valutati sono il

tempo di comparsa dei diversi movimenti e la loro frequenza. Questi due parametri dipendono anche dallo

svolgimento degli esperimenti e devono essere uniformati per ogni procedura. I principali movimenti

osservati sono:

• il pivoting che è una tecnica di deambulazione in cui le zampe anteriori e posteriori si muovono in modo

non coordinato

• il crawling che è un movimento di propulsione da parte delle zampe anteriori che fungono da remi.

Questo movimento compare all’ottavo giorno post-natale

• il walking che è un movimento tipico dell’animale quadrupede e compare al 12° giorno

• il saggio del salto che prevede la discesa dell’animale da una piattaforma posta all’altezza di 7,5 cm o 50

cm dal suolo. Normalmente a 15 giorni di crescita si osserva che l’animale diminuisce la sua capacità di

saltare dalla piattaforma posta a 50 cm a causa della apertura degli occhi e quindi alla fuga del “vuoto”.

Una semplice prova che misura il comportamento spontaneo dei ratti e che può fornire informazioni su

diversi fattori neuromuscolari ed emozionali è quella della fuga dalla gabbia che consiste nel togliere la

copertura della gabbia e misurare il tempo che l’animale all’interno di essa impiega ad uscire.

SAGGI CHE VALUTANO IL COMPORTAMENTO IN AMBIENTE NON FAMILIARE: i saggi più importanti

consistono nella prova del campo aperto (open field) e del labirinto residenziale. Nella prima prova

l’animale viene posto al centro di una gabbia ovale in cui il pavimento è suddiviso in settori. A questo punto

si segue il suo comportamento per un periodo di non oltre 3 minuti. Il ratto, posto al centro della gabbia,

dopo un breve periodo di latenza (intervallo di tempo che trascorre tra l'introduzione dell'animale nel

nuovo ambiente ed il primo movimento) inizia la sua attività esplorativa che si valuta in base al numero di

settori che l'animale attraversa. Si osserva inoltre quante volte l'animale si drizza sulla zampe posteriori

(rearing) essendo anche questo un segno dell'attività esplorativa. Se invece è impaurito tende a restare

immobile. Altri sintomi di emotività sono la presenza di urina e feci ed il verificarsi del grooming

(sfregamento del muso con le zampe anteriori).

Nella seconda prova l’animale viene posto in un dispositivo computerizzato che consente di rilevare ogni

movimento mediante 18 fasci di raggi infrarossi. La forma del labirinto è varia e presenta delle diramazioni

in relazione alle quali l’animale deve fare delle scelte.

SAGGI DI COMPORTAMENTO SOCIALE: un altro gruppo di prove è collegato con la rilevazione dei

movimenti degli animali che vengono posti a contatto con altri animali. L'importanza di questi saggi è

dovuta al fatto che la capacità di un ratto di interagire con un suo simile può essere alterata da lesioni

cerebrali prenatali così come il comportamento sociale dipende in gran parte dalle circostanze

sperimentali.

SAGGI DI VOCALIZZAZIONE ULTRASONICA: un altro parametro che può essere valutato è la vocalizzazione

ultrasonica. I ratti, infatti, emettono ultrasuoni di 20-50 KHz in specifiche condizioni: nel periodo neonatale

e nella vita adulta in situazioni di ansia o di attività sessuale. Nel periodo neonatale l’emissione ultrasonica

garantisce un rapporto madre-piccolo costante. Per esempio, quando la madre si allontana dalla nidiata per

un certo periodo di tempo, i piccoli lanciano richiami ultrasonici. Questo tipo di comunicazione,

nell’ambiente naturale, evita il richiamo contemporaneo di predatori. L’emissione ultrasonica dei neonati

sembra essere strettamente legata all’abbassamento della temperatura corporea che si verifica in seguito

all’allontanamento della madre; dall’età di 16-17 giorni, con il raggiungimento dell’omeotermia, le 145

chiamate ultrasoniche dirette alla madre scompaiono. Gli ultrasuoni vengono registrati per mezzo di una

opportuna strumentazione che consente una specifica e dettagliata valutazione; inoltre se si utilizza un

trasformatore di frequenza è possibile rendere udibili i richiami allo sperimentatore. Le sostanze che

alterano l’emissione ultrasonica modificano la comunicazione madre-piccolo, determinando gravi

conseguenze nello sviluppo neonatale. Un minor richiamo, infatti, significa come prima conseguenza una

riduzione della temperatura corporea e dell’allattamento.

I protocolli sperimentali effettuati su modelli animali ci consentono di estrapolare dati sulla teratogenesi e

suoi effetti tossici da applicare anche all’uomo. In particolare, la presenza nell’uomo di alterazioni di natura

neurologica possono essere identificate applicando la scala di Apgar, che dà un’indicazione sulla stato

neurologico del neonato alla nascita, valutando reattività, tono muscolare, intensità del pianto, frequenza

cardiaca e respiratoria. Un altro indice importante è la batteria di Brazelton: una scala per la valutazione

dello sviluppo sensorimotorio del neonato.

Misurare lo sviluppo neonatale serve a stabilire le tappe di uno sviluppo normale e ad evidenziare

alterazioni significative (per esempio ritardi nella maturazione dei riflessi, o nella coordinazione motoria).

ESEMPI: ritardo nella maturazione sensoriale e motoria nei bambini pretermine, perdita di tono muscolare

nei neonati esposti in utero a psicofarmaci, alterazioni del pianto predittive di ritardo mentale. 146

FITOTERAPICI IN GRAVIDANZA: RAPPORTO RISCHIO BENEFICIO.

La fama di maggior sicurezza rispetto ai farmaci allopatici considerati più nocivi e con più effetti avversi,

l’autoprescrizione e il fatto che non sia necessaria la ricetta per acquistarli li rende nella credenza popolare

più utilizzati.

Tuttavia è necessario monitorarne le reazioni avverse per i seguenti motivi:

1) Il fenomeno è sottostimato e sottovalutato

2) I lavori epidemiologici sono pochi e i dati a disposizione sono scarsi

3) Rischio di reazioni avverse:

Tipo A: dose-dipendente e farmacologicamente predicibili (es. ipertensione data da estratti di yoimbina),

Tipo B: non dose-dipendenti ed imprevedibili (reazioni allergiche)

Tipo C: si sviluppano durante terapie a lungo termine(es. ipokalemia da lassativi antrachinonici come

l’aloe,la senna ,la cascara,la frangula)

Tipo D: effetti teratogeni evidenziabili solo con una sorveglianza appropriata

4) Interazioni negative tra farmaci (la maggior parte dei pazienti non mette al corrente il medico dell’uso

concomitante di fitoterapici)

Nel 2012 il Ministero della Salute ha valutato la sicurezza dei fitoterapici in relazione al loro beneficio ed ha

dichiarato che l’eventuale impiego di derivati vegetali e integratori in età pediatrica, gravidanza e

allattamento non dovrebbe avvenire senza consultare il pediatra o il medico.

Il Ministero consiglia di non assumere prodotti a composizione sconosciuta, privi di etichetta, o senza

consiglio di un esperto. In campi, prati o boschi non raccogliere erbe spontanee per farne preparati ad uso

medicinale.

Tra le piante imputate:

ECHINACEA:

 Ci sono 9 tipi di specie di Echinacea tutte native degli Stati Uniti e sud Canada,la più usata e ritenuta

la più potente è l’E. purpurea

 Proprietà immunostimolanti

 Proprietà antivirali:l’attività antivirale è dovuta all’inibizione della Neuraminidasi virale,che

permette al virus di penetrare nelle cellule

 Proprietà cicatrizzante:si evidenzia con l’inibizione dell’enzima Ialuronidasi

 Va usato con cautela nei soggetti con patologie autoimmuni,non va associato a farmaci

immunosopressori come la ciclosporina e i corticosteroidi

 Per un uso prolungato può dare epatotossicità

 Allergie, rash, asma

Studi indicano che l’E. non sembra prevenire raffreddori o altre infezioni. Studi datati non hanno provato

che l’E. accorcia il corso delle malattie da raffreddamento,altri invece hanno mostrato un’azione benefica

nel trattamento delle infezioni respiratorie superiori. Su questa azione ci sono studi in corso.

In trial clinici sono molto comuni effetti gastrointestinali. La commissione di esperti presso il ministero della

sanità tedesco consiglia cicli non superiori a 6-8 settimane per evitare fenomeni di epatotossicità. Si

consiglia di consultare il medico durante la gravidanza e nel periodo precedente poiché ad alte dosi può

danneggiare gli oociti. 147

GINKGO BILOBA:

 E’ l’albero più antico della terra usato per millenni nella medicina tradizionale cinese

 Ricca di flavonoidi e ginkgolidi, sostanze che agiscono regolando la circolazione, dalle sue foglie si

ricava l’estratto secco nebulizzato e titolato in ginkgo flavonoidi (minimo24%) e in terpeni totali

(minimo 6%) secondo la FU tedesca

 Molteplici azioni: azione antiallergica, nell’arteriopatia periferica degli arti inferiori

 Indicato per curare la vasculopatia arteriosclerotica cerebrale, la demenza senile (morbo di

Alzheimer, alterazioni della memoria)

 Vertigini, ronzio auricolare cronico

 Claudicatio intermittens (dolore alla gambe causato dal restringimento delle arterie)

La letteratura riporta uno studio nel quale è stato osservato che il ginkgo durante la gravidanza può causare

danni al feto dovuti all’accumulo di colchicina nella placenta. Il consiglio botanico americano in seguito ha

trovato dei difetti nelle metodologie di ricerca di questo studio mentre un ulteriore rapporto ha sollevato

interesse riguardo alla presenza nella placenta di questa sostanza.

Deve essere sottolineato che l’eventuale assunzione come alternativa all’acido acetilsalicilico, spesso

utilizzato dalle donne con gravidanza a rischio, potrebbe aumentare il rischio di sanguinamento durante e

dopo il parto, quindi andrebbe interrotta almeno una settimana prima del parto e dovrebbe essere evitato

anche durante l’allattamento. Va evitato precauzionalmente durante il primo trimestre di gravidanza;

attraversa la placenta ed è stato implicato in anomalie fetali.

Può interferire con antiepilettici, anticoagulanti, antiaggreganti. Studi più piccoli per il miglioramento della

memoria hanno dato risultati promettenti, ma un trial condotto dall’istituto nazionale “on Aging” su più di

200 adulti in salute con età superiore ai 60 anni ha dimostrato che il ginkgo preso per più di 6 settimane

non rafforza la memoria. Si sta conducendo un grande trial clinico con più di 3000 volontari, lo scopo è di

dimostrare se il Ginkgo previene l’esordio della demenza e specificatamente del morbo di Alzheimer.

GINSENG (PANAX GINSENG):

 Pianta originaria della Cina,Giappone e Corea paesi dove da oltre 2000 anni il ginseng è considerato

un tonico, un afrodisiaco ed un elisir di longevità

 Astenia fisica e mentale

 Trattamento della disfunzione erettile, epatite C, e sintomi relativi alla menopausa

 Discreta attività ipoglicemizzante, diminuisce il colesterolo nel sangue

Tra i suoi effetti collaterali:

 Emorragia vaginale, gonfiore, insonnia, tachicardia, mal di testa

 Rischio di cancro al seno

 E’controindicato l’uso concomitante di estrogeni, antiipertensivi, corticosteroidi, warfarin (altera il

tempo di sanguinamento)

 Interferisce con l’asse ipotalamo-ipofisi-surrene

 Si consiglia l’uso per un periodo non superiore a 3 mesi per evitare lo sviluppo di effetti collaterali

(GAS= Ginseng Abuse Syndrome)

Studi su 88 donne in gravidanza sembrano dimostrare un aumento di rischi di effetti avversi sul feto, sono

stati condotti pochi trial clinici e per la maggior parte sono piccoli studi o studi con difetti nel protocollo,

oppure studi condotti solo su animali. Studi hanno mostrato che diminuisce i livelli di glucosio nel 148

sangue e che ha una azione benefica sulla funzione immunitaria. Studi dichiarano che c’è una cosi piccola

evidenza della sua efficacia e della sua sicurezza che non dovrebbe essere usato per nessuna condizione

patologica.

HYPERICUM PERFORATUM (erba di San Giovanni):

Pianta erbacea perenne dai suoi fiori gialli si ricava l’estratto secco titolato in ipericina (min. 0,2% FU

Tedesca), anche se il vero responsabile dell’attività sembra essere l’iperforina.

 È utilizzato per il trattamento della depressione da mite a moderata (apatia, sintomi premestruali o

della menopausa), ma la sua azione per la depressione severa non è confermata

 Agisce inibendo in parte la MAO responsabile della disattivazione delle catecolamine, ma

soprattutto il re-uptake della serotonina, dopamina, noradrenalina

 Induce l’enzima CYPA3 attraverso il quale circa il 50% dei farmaci viene metabolizzato, in questo

modo riduce l’emivita dell’indinavir e della ciclosporina

 Modula l’attività dell’interleuchina 6 ma il meccanismo di azione non è noto

E’ stato messo sotto accusa in tutto il mondo per i suoi effetti collaterali:

 Inibisce l’assorbimento di ferro

 Ad alte concentrazioni può danneggiare gli oociti e nell’uomo la motilità dello sperma

 Interferisce con warfarin, digossina, teofillina, farmaci per la cura dell’ HIV, rimedi atti a prevenire il

rigetto dei trapianti, pillola contraccettiva ed antiipertensivi

 Dosi elevate provocano: allergie, disturbi G.I., ansia, attacchi di panico

Il suo uso durante l’allattamento come preventivo della depressione post partum sembra accettabile,

anche se non sono stati ancora intrapresi studi a lungo termine degli effetti sugli infanti. Il dipartimento

della salute ha prodotto linee guida per avvisare il personale sanitario dei possibili problemi per i pazienti

che ne fanno uso. Da evitare in gravidanza e nel periodo precedente a questo ; stimola le contrazioni

dell’utero.

ZINGIBER OFFICINALE (ZENZERO):

 E’ un’antica spezia della FU indiana e cinese poi diffusasi in Europa; erba perenne di cui si utilizza il

rizoma da cui si ricava l’estratto secco in olio essenziale min. 0,8% secondo la FU inglese.

 E’ un antiemetico noto per la nausea gravidica, gli effetti si esplicano probabilmente a livello G.I.

con azione anticolinergica e antistaminica

 Potenzia l’effetto dei farmaci antiaggreganti e anticoagulanti; i fattori della coagulazione

dovrebbero essere regolarmente valutati in donne che lo usano per un periodo prolungato

Mediante trial del 2001 sono stati riportati significativi miglioramenti nella nausea e nel vomito severo

durante la gravidanza ed è stato visto che è particolarmente efficace per la iperemesi quando comparata al

placebo. Un altro studio ha identificato un aumento della perdita dell’embrione in ratti sottoposti a

trattamento con zenzero. Uno studio prospettico comparativo, benché numericamente non grande,

dimostra un’incidenza di eventi gravi (malformazioni e morti) più alta nelle donne che assumevano zenzero

rispetto a quelle che assumevano farmaci.

I suoi effetti fetali sono dose-dipendenti e si suggerisce cautela mantenendo dosi ad un max di 1 gr al

giorno. Alcuni studi hanno dimostrato la presenza nello zenzero di alcune sostanze antinfiammatorie che

149

hanno un meccanismo di azione simile a quella dei FANS,per cui viene usato nella cura dell’artrite e della

cefalea.

LINEE GUIDA

 Il medico ed il farmacista dovrebbero informarsi riguardo alle donne che fanno uso di fitoterapici

nel periodo precedente o durante la gravidanza

 Le donne con patologie mediche maggiori come il diabete mellito, epilessia, malattie cardiache

dovrebbero essere prudenti nell’assumere qualsiasi fitoterapico poiché possono influire sulla loro

condizione o interferire con altri medicinali

 Le donne che assumono antiipertensivi ed anticoagulanti dovrebbero evitare l’assunzione di

fitoterapici se non dietro consiglio medico

Alcune autorità mettono in guardia sull’uso di quasi tutte le erbe medicinali durante la gravidanza, altre

evidenziano la necessità di migliorare sia l’educazione dei professionisti (specialisti, medici, farmacisti) sia

quella dei consumatori, ma anche di migliorare la legislazione (es. maggiori controlli di qualità, attuare

protocolli ben designati) per stabilire sicurezza ed efficacia di questi rimedi. La maggior parte degli

specialisti non raccomanda rimedi fitoterapici in gravidanza poiché la sicurezza non è stabilita da ricerche

adeguate, molti integratori e vitamine non sono testati prima dell’immissione in commercio. 150

Distruttori endocrini o Endocrine Disrupting Compounds (EDC)

Eterogeneo gruppo di sostanze esogene caratterizzate dalla capacità di interferire con il funzionamento del

sistema endocrino, causando effetti dannosi su un organismo o sulla sua progenie. La riproduzione e lo

sviluppo pre- e postnatale sono le fasi biologiche più sensibili agli effetti endocrini degli EDC

Gli effetti indesiderati degli EDC finora osservati, mediante studi in vivo e in vitro, sono:

-la compromissione della capacità riproduttiva

-la presenza di difetti morfologici o funzionali alla nascita

-lo sviluppo del cancro

-alcune alterazioni del sistema immunitario e altri effetti

Le ricerche finora condotte nel campo dei distruttori endocrini hanno dato risultati che portano a cinque

conclusioni principali:

1) I livelli di esposizione sufficienti a causare profondi e significativi effetti a livello fisiologico in esperimenti

di laboratorio non sono molto elevati.

2) I distruttori endocrini sono un gruppo di contaminanti persistenti e bioaccumulanti che si ritrovano

all’interno di numerose classi di sostanze chimiche, dei quali fino a poco tempo fa si ignoravano gli

effetti sul sistema endocrino.

3) L’esposizione dell’uomo a queste sostanze è ubiquitaria.

4) Tutti i sistemi ormonali finora esaminati sono risultati sensibili alla distruzione endocrina.

5) L’esposizione in utero a un numero crescente di sostanze chimiche ha avuto un grosso impatto sullo

sviluppo producendo risultati visibili precocemente alla nascita o tardivamente in età adulta.

Classificazione dei distruttori endocrini

L’enorme quantità di composti che potrebbero interferire con il sistema endocrino umano e animale non

ne facilita la classificazione.

In via generale è possibile raggruppare questi composti in cinque categorie principali

1) Farmaci o estrogeni sintetici (come ad esempio il 17-b estradiolo o l’estrogenosintetico dietilstilbestrolo,

DES).

2) Pesticidi, a loro volta distinguibili in:

 organofosforici;

 carbammati;

 piretroidi sintetici;

 organoclorurati;

3) Plastificanti e prodotti derivanti dalla combustione del PVC (ma anche della carta e delle sostanze

putrescibili) come le diossine

4) Sostanze di origine industriale come:

 fenoli;

 ritardanti di fiamma;

 acido perfluorooctanico e suoi sali;

 diossine;

 alcuni metalli pesanti (piombo, cadmio e mercurio). 151

Sono stati dimostrati effetti estrogeno-simili (sia in vivo che in vitro) anche per alcune sostanze naturali

(incluse alcune micotossine), potenzialmente presenti in diverse componenti della dieta.

Ci sono svariati tipi di meccanismi d’azione dei EDC:

 Legame ed attivazione del recettore degli estrogeni (quindi agendo come un estrogeno)

 Legame e inattivazione del recettore degli estrogeni (quindi agendo come un anti-estrogeno)

Diversi composti possono agire come estrogeni o come anti-estrogeni in funzione delle condizioni

cellulari.

Alcuni PBC legano recettori degli estrogeni ed attivano la trascrizione genica ad elevate concentrazioni.

Comunque questi PBC ad appropriate concentrazioni sono deboli agonisti e possono interferire con il

sistema endocrino, competendo con estrogeni endogeni per i siti di legame. Legame ad altri recettori (es:

recettori degli androgeni), provocando attivazione o inattivazione del recettore

DDT: induce alterazioni riproduttive. Il metabolita DDE agisce come un anti-androgeno bloccando il

recettore per il testosterone. Si producono effetti che sono fenotipicamente simili agli effetti causati da

estrogeni.

 Modificare il metabolismo di ormoni naturali: I EDC possono provocare alterazioni del metabolismo

o della sintesi degli steroidi.

Composti che agiscono attraverso recettori Ah (recettore arilico per gli idrocarburi)hanno mostrato attività

anti-estrogenica. TCDD è uno di questi composti. Geni indotti dal recettore Ah comprendono CYP1A1,

CYP1A2 e CYP1B1 che sono coinvolti nel metabolismo ossidativo del 17b-estradiolo L’attività anti-

estrogenica di alcuni ligandi del recettore Ah può essere spiegata da un incremento nel metabolismo degli

estrogeni.

 Modificare il numero di recettori:

Cellule in coltura trattate con TCDD mostrano una diminuzione di recettori per estrogeni.

I EDC hanno carattere lipofilo e questo permette loro di diffondere attraverso la membrana cellulare, di

legare eventualmente i recettori per ormoni steroidei e di accumularsi a livello del tessuto adiposo.

Numerose di queste sostanze derivanti dall’inquinamento ambientale vengono assunte attraverso la

sostanza grassa consumata insieme alla carne, al latte ecc. 152

La valutazione del rischio per la salute umana e l’ambiente derivante da esposizione a EDC deve tenere

conto di due ordini di problemi:

1) Sistemi sperimentali in vitro e in vivo per identificare e caratterizzare con precisione gli effetti sul sistema

endocrino

2) Effetti degli EDC sulla salute della popolazione generale, considerando la presenza di situazioni di

maggiore suscettibilità (gravidanza, sviluppo intrauterino, sviluppo postnatale) e di gruppi particolarmente

esposti (per attività lavorative o abitudini alimentari).

Occorre acquisire conoscenze su:

a) I livelli di inquinamento ambientale attraverso programmi di monitoraggio

b) L’esposizione della popolazione generale e dei gruppi a rischio attraverso programmi di monitoraggio

biologico

c) La relazione tra dose assorbita e insorgenza di condizioni patologiche attraverso studi epidemiologici

d) L’insorgenza di alterazioni patologiche in modelli sperimentali animali e/o cellulari

Molte sostanze chimiche inquinanti sono in grado di interferire con il sistema endocrino.

Alcune hanno una struttura chimica simile a quella degli estrogeni naturali, e possono avere affinità per il

loro recettore.

È possibile identificare l’attività estrogenica utilizzando saggi in vitro:

 Saggio di legame al recettore estrogenico

 Saggio di proliferazione cellulare

 Saggio di regolazione del promotore endogeno 153

Saggio di proliferazione cellulare: per esempio si può eseguire su una linea cellulare di carcinoma di

mammella (MCF-7).

a) Determinazione del tasso di crescita relativa, il quale misura il rapporto tra minima concentrazione di

estradiolo necessaria per la massima resa in termini di crescita cellulare e la minima concentrazione di

xenobiotico necessario per ottenere lo stesso effetto.

b) Determinazione dell’effetto proliferativo relativo, il quale indica se il composto testato induce una

risposta proliferativa quantitativamente simile o inferiore a quella ottenuta con l’estradiolo

Questo test suggerisce, ma non permette di dimostrare inequivocabilmente l’azione estrogenica di una

sostanza. Insieme al saggio di legame al recettore, rappresenta il primo test che viene effettuato su uno

xenobiotico sospetto.

SAGGIO DI REGOLAZIONE DEL PROMOTORE ENDOGENO.

Questo test consiste nell’utilizzare dei costrutti contenenti i promotori di geni che rispondono all’azione

degli estrogeni e dei geni cosiddetti “reporter” quali per esempio, la b-galattosidasi o la luciferasi.

L’induzione del promotore sensibile all’estrogeno ad opera del composto oggetto del test (in presenza

ovviamente del recettore per gli estrogeni) viene rivelata come maggiore livello di trascrizione del gene

“reporter” rispetto al controllo ed è quindi facilmente quantificabile (per esempio fornendo il substrato al

primo enzima e valutando la concentrazione del prodotto formatosi o misurando con un luminometro, la

fluorescenza cellulare data dalla luciferasi). 154

REAZIONI DI IPERSENSIBILITA’

Sebbene la disciplina dell’immunotossicologia

sia relativamente recente, considerevoli

progressi sono stati fatti nel dimostrare che

alcuni xenobiotici possono influenzare il

sistema immunitario. I composti

immunotossici appartengono a categorie

diverse, sia dal punto di vista strutturale che

funzionale. Comprendono infatti farmaci

appartenenti a classi terapeutiche diverse,

contaminati ambientali e composti microbici.

Gli effetti degli xenobiotici sul sistema

immunitario possono risultare in una

soppressione o in una stimolazione. L’eccessiva stimolazione può comportare reazione di ipersensibilità o

autoimmunità, mentre l’immunosoppressione può indurre suscettibilità alle infezioni o aumentatore

l’incidenza di neoplasie.

Una reazione di ipersensibilità è una RISPOSTA INAPPROPRIATA ED ESAGERATA DEL SISTEMA

IMMUNITARIO. Le reazioni di ipersensibilità costituiscono meccanismi generali attraverso cui una varietà di

xenobiotici esercitano effetti tossici sul sistema immunitario o mediati dal sistema immunitario. In

generale, l’ipersensibilità è uno stato di immunità acquisita in cui la ristimolazione con lo stesso antigene

sensibilizzante induce reazioni patologiche. Tutte le reazione di ipersensibilità necessitano di un’esposizione

iniziale che porta alla sensibilizzazione in grado di indurre una reazione al contatto successivo con l’agente

sensibilizzante. Diversi xenobiotici possono indurre reazioni di ipersensibilità; essi sono rappresentati in

genere da composti chimici a basso peso molecolare come metalli o farmaci. In tal caso, lo xenobiotico non

ha di per sé proprietà antigeniche, ma si comporta come un aptene, cioè una molecola che da sola non è in

grado di innescare una risposta immunitaria ma che è in grado di farlo solo se legata a macromolecole

dell’ospite. Tale complesso è quindi in grado di indurre una risposta immunitaria aptene specifica

responsabile della reazione di ipersensibilità. In origine, sono state distinte risposte di ipersensibilità

immediate e ritardate, sulla base del tempo di latenza e la comparsa dei sintomi in seguito all’iniezione 155

scatenante dell’antigene. Di regola le reazioni di tipo immediato sono mediate da anticorpi e i sintomi

compaiono dopo alcuni minuti. Al contrario, quelle di tipo ritardato sono cellulo-mediate e i sintomi

richiedono ore o giorni per manifestarsi.

Gell e Coombs hanno classificato le reazioni di ipersensibilità in 4 tipi.

Ipersensibilità di primo tipo (Ipersensibilità

Immediata o Anafilassi- allergia): questo tipo di

reazioni sono associate alla generazione di IgE in

risposta a diversi antigeni, come pollini, derivati

della cute di animali, cibi e altre sostanze presenti

nell’ambiente. Le IgE prodotte dai Th2 in risposta

all’esposizione ad un antigene si legano a specifici

recettori (FcɛRI) espressi sulla superficie di mast cellule e basofili. La successiva interazione con l’antigene

determina il rilascio di granuli citoplasmatici contenenti fattori pro infiammatori e vasoattivi come istamina

leucotrieni ecc. Nel caso di antigeni inalati (pollini, muffe, dermatofagoidi), tali mediatori inducono

broncospasmo edema della mucosa, aumentata produzione di muco. Nel caso di antigeni ingeriti (alimenti,

farmaci) i mediatori rilasciati dalle mast cellule tissutali inducono ipermotilità intestinale e dispepsia

addominale. Nel caso di antigeni che vengono a contatto con la pelle anche a seguito di puntura di insetti

(farmaci, veleni di insetti, cosmetici, metalli) la reazione indotta si presenta come eruzione maculopapulare,

eczema, orticaria. Infine, nel caso di antigeni che raggiungono il sangue in quantità tali da attivare i basofili

circolanti (vaccini, farmaci) si può avere un quadro di reazione anafilattica sistemica con shock ipotensivo e

insufficienza respiratoria. NB. Non tutti gli antigeni sono allergeni infatti perché un allergeni sia considerato

tale esso deve presentare le seguenti caratteristiche: stimolare la produzione di IL-4 a cui fa seguito lo

switch isotipico dei linfociti B in plasmacellule che produrranno IgE. Inoltre devono essere bivalenti cioè

presentare 2 siti di legame per l’anticorpo. Un esempio tipico di reazione di ipersensibilità di tipo I è quella

scatenata dai pollini, la quale prevede la SENSIBILIZZAZIONE (primo contatto con l’antigene in cui non si ha

alcuna risposta allergica) e la fase di SCATENAMENTO (secondo contatto con l’antigene). 156

157

La reazione di ipersensibilità indotta da farmaci è una reazione avversa provocata dalla somministrazione di

un farmaco, ma causata da un’abnorme attivazione del sistema immunitario, che è stato sensibilizzato da

un precedente contatto con quel farmaco (o con un farmaco simile per struttura chimica). Al primo

contatto si ha la sensibilizzazione; quindi nell’arco di 7-14 giorni avviene l’elaborazione della risposta

immunitaria. Il contatto evocatore causerà di seguito la comparsa dei sintomi caratteristici della reazione

allergica.

I criteri diagnostici per una reazione immunologica ad un farmaco prevedono che la reazione dovrebbe:

 Non assomigliare all’effetto farmacologico della sostanza

 Essere evocata da piccole dosi del farmaco

 Si manifesta solo dopo una seconda esposizione all’antigene o a sostanza affine (cross reazione)

 Avere i classici sintomi di una reazione di ipersensibilità

 Ripetersi immediatamente dopo una risomministrazione di piccole dosi del farmaco

 Ripetersi con farmaci aventi struttura chimica simile

Le reazioni allergiche da farmaci possono essere di vario tipo:

1. SISTEMICHE: Anafilassi; Malattia da siero; Vasculite; Lupus (LES)

2. CUTANEE: Orticaria-angioedema; Rash maculopapulare e morbilliforme; Fotosensibilità; Eritema

multiforme (SSJ); Dermatite da contatto; Dermatite atopica

3. POLMONARI: Asma bronchiale; Edema laringeo; Reazioni fibrotiche

4. MIDOLLARI: Aplasia midollare; Anemia emolitica; Trombocitopenia; Granulocitopenia; Iperplasia linfatica

5. RENALI: Glomerulonefrite; Nefrite interstiziale

6. EPATICHE: Ittero colostatico; Ittero epatocellulare; Epatite cronica attiva

I fattori che favoriscono l’insorgenza di reazioni immunologiche sono:

 Grado di esposizione al farmaco (grado e n° dei cicli del trattamento)

 Via di somministrazione

 Soggetti atopici (con predisposizione genetica)

 Storia di precedenti reazioni allergiche

 Età

 Sesso

 Variabilità individuale di assorbimento e metabolismo

 Patologie concomitanti 158

Patologie a base allergica nell’uomo:

1. RINITE ALLERGICA (febbre da fieno)

2. ASMA BRONCHIALE

3. DERMATITE ATOPICA

4. ALLERGIE ALIMENTARI

5. ANAFILASSI SISTEMICA

RINITE ALLERGICA: è probabilmente la più comune patologia allergica. Pur non essendo una malattia grave,

essa influisce sulla vita sociale ed altera le prestazioni scolastiche e lavorative. Gli allergeni responsabili

sono: pollini (graminacee, parietaria, betulla), acari della polvere. La via di ingresso dell’allergene è quella

inalatoria. Tra le manifestazioni clinico-patologiche si riscontrano: edema mucosa nasale, irritazione della

mucosa nasale, infiltrato leucocitario con abbondanti eosinofili, ipersecrezione muco, tosse, difficoltà

respiratorie.

ASMA BRONCHIALE: Circa il 70% dei casi di asma è dovuto a ipersensibilità immediata IgE-mediata.

Gli allergeni responsabili sono: pollini (graminacee, parietaria, betulla) e acari della polvere. Via d’ingresso:

inalazione. Risposta: broncocostrizione, aumentata secrezione di muco, infiammazione delle vie aeree.

ALLERGIE ALIMENTARI: sono causate da reazioni di ipersensibilità immediata nei confronti di alcuni

alimenti che inducono il rilascio di mediatori da parte dei mastociti mucosali e submucosali.

Allergeni comuni sono: crostacei, latte, uova, pesce, frumento, arachidi. La loro via d’ingresso è quella

orale. L’organismo risponde con: vomito, diarrea, prurito, orticaria, anafilassi.

DERMATITE ATOPICA: disordine cutaneo caratterizzato da lesioni altamente pruriginose con andamento

cronico-recidivante e da età-dipendenza per TIPOLOGIA e per SEDE di tali lesioni. E’ il più comune disordine

infiammatorio cutaneo dell’infanzia (10-20% della popolazione pediatrica nei paesi sviluppati)

Presenza di ATOPIA fino al 50-80% dei casi:

- Storia personale/familiare di allergie IgE-mediate

- Elevati livelli di IgE-Specifiche (prick/rast)

Nella diagnosi occorre tenere conto di segni clinici propri della malattia quali: prurito e secchezza cutanea;

lesioni da grattamento; lesioni infiammatorie (eritema, essudazione, edemi, desquamazione);

papuleprurigo (papule eritematose, dure, spesso escoriate); lichenificazione. Sarà quindi l’esame obiettivo

delle lesioni cutanee e la storia personale e familiare del paziente definiti sulla base di criteri diagnostici 159

cosiddetti maggiori e minori, a permettere la definizione di DA. A questi si aggiungerà l’eventuale

individuazione dei fattori scatenanti medianti test diagnostici. La presenza di tre criteri maggiori e di tre

minori sarebbe diagnostica.

OTICARIA E ANGIOEDEMA: L’ORTICARIA è una

manifestazione cutanea patologica caratterizzata

da pomfi (aree circoscritte di cute edematosa o

eritemo-edematosa, pruriginose, dovute ad

edema del

derma papillare). L’ANGIOEDEMA è

caratterizzato da un’unica o da poche ampie

aree di edema profondo che istologicamente

coinvolge il derma reticolare ed il sottocutaneo.

Sono manifestazioni dello stesso processo

edematoso che però nelle due forme coinvolge

differenti livelli della cute. Tempi di insorgenza:

poche ore o giorni. I farmaci che possono indurre

orticaria sono schematizzati accanto. In tali casi,

la terapia prevede la sospensione del farmaco o

antistaminici come sintomatici. In alcuni casi

possono essere somministrati steroidi sistemici.

ANAFILASSI SISTEMICA: è una reazione di ipersensibilità immediata di tipo sistemico caratterizzata da

edema diffuso e caduta della pressione sanguigna causata da intensa e diffusa vasodilatazione.

Questi effetti sono classicamente determinati da un antigene che viene introdotto tramite iniezione,

punture d’insetto o da assorbimento attraverso una superficie epiteliale come la cute o la mucosa

intestinale. Si liberano quantità elevate di istamina e di altri mediatori in diversi distretti corporei.

La riduzione del tono vascolare e la perdita di plasma indotti da questi mediatori portano ad una caduta

della pressione arteriosa o shock definita shock anafilattico, condizione spesso fatale. Tali alterazioni a

carico del sistema cardiovascolare sono accompagnati da: broncocostrizione, ipersecrezione muco bronchi

e intestino, orticaria. 160

Farmaci che causano più di frequente reazioni di tipo anafilattico:

Una tipica reazione che da anafilassi IgE mediata, e quindi non atopica, è quella che può seguire la puntura

di insetti imenotteri (api, vespe, calabroni, formiche ecc…) con rilascio di veleno che può avere a seconda

della specie animale diversa composizione.

Il veleno degli imenotteri serve, nel caso delle api, a difendere l'alveare dalla intrusione di altri invertebrati

o di piccoli mammiferi che aggrediscono questi insetti per il miele e, per quanto riguarda le vespe, ad

immobilizzare altri insetti catturati per potersene cibare. Durante una singola puntura d'ape o di vespa

viene iniettata una quantità di 0,5 - 2 ml di veleno. Tra gli elementi costitutivi del veleno imenottero vi è la

ialuronidasi, enzima necessario a permettere all’insetto la formazioni di canali attraverso i quali far defluire

il veleno nella “preda”. La ialuronidasi agisce come " fattore di diffusione del veleno" sciogliendo l'acido

ialuronico che è una sostanza presente nel tessuto connettivo e che lega fra di loro le cellule. Dopo la prima

puntura di imenottero il 62% dei soggetti sviluppa un Rast positivo. Le IgE specifiche così formate tendono a

scomparire entro qualche mese, ma se prima del loro declino si verifica una nuova puntura si ottiene un

ulteriore stimolo alla loro produzione (apicoltori).

Il veleno delle vespe presenta quindi:

SOSTANZE A BASSO PESO MOLECOLARE: l’istamina è la più comune amina biogena presente nel veleno

delle vespe. Essa provoca dolore e dilatazione dei capillari sanguigni.

PEPTIDI: i peptidi presenti nel veleno delle vespe provocano la degranulazione dei mastociti, si ha

pertanto la liberazione di mediatori chimici quali l'istamina, la serotonina, l'eparina, il fattore chemiotattico

per gli eosinofili e la sostanza a lenta reazione (SRS). Queste sostanze, insieme alle amine biogene viste

precedentemente, sono responsabili della maggior parte degli effetti locali causati dalla puntura di questi

insetti.

SOSTANZE AD ALTO PESO MOLECOLARE: nel veleno delle vespe sono stati identificati vari tipi di sostanze ad

attività enzimatica. La fosfolipasi, la ialuronidasi e la fosfatasi alcalina sono dei potenti allergeni che

possono provocare pericolose reazioni allergiche nei soggetti sensibili. 161

Il veleno delle api invece presenta:

SOSTANZE A BASSO PESO MOLECOLARE: l'istamina, la dopamina e la norepinefrina sono amine biogene

presenti nel veleno delle api in quantità consistente

PEPTIDI: circa il 50% dell'estratto secco del veleno d'api è rappresentato dalla MELLITINA. Essa provoca

delle lacerazioni nelle membrane cellulari che facilitano la diffusione degli ioni fra il liquido intracellulare e

l'ambiente esterno provocando una caduta del potenziale di membrana con conseguente insorgenza dello

stimolo doloroso. L' APAMINA blocca i canali del calcio e potassio nelle membrane cellulari potenziando

l'effetto della MELITTINA. Il PEPTIDE 401 provoca una liberazione massiccia di istamina dai mastociti.

SOSTANZE AD ALTO PESO MOLECOLARE: la fosfolipasi A2 insieme alla lisolecitina , che si forma in seguito

all'azione della fosfolipasi, provocano la citolisi cioè la morte cellulare.

TERAPIA DELLE REAZIONI ALLERGICHE AL VELENO DI IMENOTTERI:

• Prevenzione delle reazioni anafilattiche

• Terapia farmacologica d’urgenza delle reazioni anafilattiche 162

La TERAPIA IPOSENSIBILIZZANTE SPECIFICA si basa sul principio di evitare il contatto tra allergene e IgE.

Questo scopo si ottiene:

• Allontanando l’allergene responsabile

• Mediante TIS: somministrazione di dosi crescenti di allergene per modificare la risposta immunologica del

paziente atopico, stimolando la produzione di IgG e la diminuzione delle IgE specifiche. La TIS è

particolarmente indicata per: allergopatie respiratorie, ipersensibilità al veleno degli imenotteri, allergia

alimentare, allergia da farmaci.

Le vie di somministrazione della TIS possono essere: s.c., orale, sublinguale, inalatoria nasale e bronchiale

La via immunologica si utilizza per farmaci che provocano reazioni con meccanismo immunologico IgE-

mediato (antibiotici betalattamici, insulina). Si somministrano dosi crescenti di farmaco, opportunamente

purificato, in tempi brevi, fino a raggiungere i dosaggi terapeutici. Non esistono protocolli ufficiali.

La TIS va effettuata solo in situazioni gravi, quando non

c’è alternativa terapeutica, in ambienti specializzati.

Ipersensibilità di secondo tipo (Ipersensibilità mediata

da anticorpi citotossici): i mediatori più frequenti sono

anticorpi (citotossici e in particolare IgG) e complemento

(complemento-dipendente), anche se in alcuni casi

possono essere coinvolte cellule (sistema complemento-

indipendente). Il sistema del complemento è costituito

da una serie di proteine sieriche la cui attivazione a cascata induce chemiotassi, adesione cellulare, lisi

cellulare, fagocitosi, e degranulazione di mast cellule. Il meccanismo più frequente consiste nella lisi

cellulare dipendente dal complemento indotta da anticorpi presenti sulla superficie cellulare. I frammenti

del complemento che vengono così generati, specialmente il C3b inducono fagocitosi e rimozione della

cellula da parte di cellule fagocitarie. Anche in questo tipo di reazione immunitaria, l’antigene può essere

uno xenobiotico, e ne sono esempi l’anemia emolitica autoimmune, alcune neutropenie, e

trombocitopenie. Le reazioni citotossiche o citolitiche riguardano solitamente cellule del sangue

(soprattutto piastrine e globuli rossi) e cellule endoteliali. Le reazioni contro emazie sono esempi di reazioni

di questo tipo:

- reazioni da trasfusione (incompatibilità di gruppo)

- incompatibilità materno-fetale

- anemie emolitiche autoimmuni

- anemie emolitiche farmaco-indotte

Il problema delle trasfusioni è legato alla presenza

sulla superficie cellulare dei globuli rossi del

ricevente di antigeni identificati con il termine di

agglutinogeni (A e B) e alla presenza nel siero del

donatore di anticorpi anti-emazie, le agglutinine,

incompatibili con gli agglutinogeni stessi. 163

Più in dettaglio, la citotossicità indipendente dal complemento si esplica attraverso le seguenti tappe:

1. L’antigene “estraneo” è legato alla superficie di cellule normali (globuli rossi, piastrine)

2. L’anticorpo (IgG) è diretto verso l’antigene estraneo

3. Il legame IgG-antigene di superficie attiva le cellule citotossiche (cellule NK): queste si legano alla

porzione Fc dell’Ig stimolando il rilascio di granuli citotossici

4. Lisi delle cellule bersaglio

La citotossicità dipendente dal complemento si esplica attraverso i seguenti passaggi:

1. L’antigene “estraneo” è legato alla superficie di cellule normali (globuli rossi, piastrine)

2. L’anticorpo (IgG) è diretto verso l’antigene estraneo

3. Il legame IgG-antigene di superficie attiva il complemento: esso si fissa a recettori presenti sulla

membrana della cellula bersaglio;

4. Lisi delle cellule bersaglio

I farmaci possono dare anemia emolitica con tre tipi di meccanismi ben documentati:

Tipo metildopa: ibuprofen, levodopa, ecc. il farmaco si lega alla membrana del globulo rosso e agisce da

determinante “carrier” inducendo l’attivazione di linfociti T helper che cooperano con i linfociti B nella

produzione di anticorpi antieritrocita. Gli anticorpi attivano il complemento dando la lisi della cellula.

Tipo penicillina: penicillina, ampicillina, cisplatino, ecc. La penicillina si lega ad alcuni antigeni del globulo

rosso, modificandone la struttura generando epitopi nuovi. Tale evento richiama il complemento; i

macrofagi legano il complemento e presentano l’antigene alle cellule T. Si assiste quindi al richiamo delle

cellule B e al loro switch in plasmacellule che produrranno IgG contro i globuli rossi “modificati” a dare

l’anemia emolitica

Tipo “innocent bystander”: isoniazide, rifampicina, ecc. Il farmaco si lega alle proteine plasmatiche con

formazione di immunocomplessi che aderiscono alle emazie stimolando il complemento a dare lisi

cellulare.


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7 mesi fa


DETTAGLI
Esame: Tossicologia
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in farmacia (corso di laurea di 5 anni - a ciclo unico)
SSD:
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher ciuffo9226 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Tossicologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università La Sapienza - Uniroma1 o del prof Campolongo Patrizia.

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