Appunti tossicologia

Tossicologia

È la disciplina che studia le interazioni tra i composti chimici e i sistemi biologici, al fine di determinare i possibili effetti avversi causati da agenti chimici e fisici in organismi viventi e di comprendere la natura, l’incidenza, il meccanismo d’azione e la reversibilità di tali effetti. Lo scopo della tossicologia è la valutazione, in termini quali e quantitativi, della probabilità, frequenza e complessità degli effetti tossici causati dalle sostanze chimiche, in rapporto alle reali condizioni di esposizione, al fine di stimare il rischio per l’uomo e l’ambiente e di definire le adeguate misure restrittive e preventive.

La tossicologia è una scienza multidisciplinare che vede l’integrazione di varie competenze; infatti, essa può essere suddivisa in aree di maggiore specializzazione. Ad ognuna di queste aree contribuiscono competenze farmacologiche, cliniche, sperimentali e normative. Obiettivo della tossicologia è quindi la protezione della salute umana (e dell’ambiente) nei confronti di agenti potenzialmente nocivi, che possono essere chimici, di sintesi e naturali, fisici, biologici. Pertanto, la tossicologia può essere considerata la scienza che definisce i limiti di sicurezza di un agente chimico.

Va sottolineato che anche gli agenti naturali possono essere tossici, in quanto naturale non è sinonimo di sicuro. Infatti, bisogna sempre tener presente il rapporto rischio/beneficio. Non tutto rientra direttamente nel campo della tossicologia ma può influenzare la sensibilità alle sostanze potenzialmente tossiche. Si parla allora di “determinanti” di malattia, che possono essere: fattori genetici, malnutrizione, carenze igienico-sanitarie, fattori socio-economici ecc.

La protezione della salute pubblica si attua mediante interventi normativi che prevengono o limitano l’esposizione agli agenti potenzialmente nocivi (anche i farmaci).

Ecotossicologia

L’ecotossicologia si occupa di valutare l’impatto delle sostanze tossiche sull’ecosistema, per affrontare i problemi derivanti dalla contaminazione e dall’inquinamento. Esiste una differenza concettuale tra contaminazione ambientale ed inquinamento: nel primo caso si tratta di una conseguenza di un’azione umana in grado di modificare le proprietà delle condizioni o la disponibilità e la qualità delle risorse in un determinato intervallo di spazio e di tempo. La contaminazione ambientale non comporta necessariamente il manifestarsi di danni misurabili a carico di organismi viventi. Nel secondo caso, invece, si ha un danno misurabile a carico di un sistema biologico, sia esso a carico di un processo biochimico cellulare o tissutale di un organismo, o a carico di una popolazione o di una comunità biologica.

Riassumendo, l’ecotossicologia riguarda l’identificazione, la quantificazione e la gestione del danno sugli organismi a diversi livelli di organizzazione, dovuti a fenomeni di alterazione degli ecosistemi che portano ad inquinamento ambientale, servendosi anche di metodi predittivi.

Finalità degli studi tossicologici

Le finalità degli studi tossicologici sono innanzitutto capire se una sostanza tossica sia indispensabile o meno in una determinata preparazione/circostanza. Nel caso in cui tale sostanza tossica possa essere sostituita con una analoga meno tossica, la sostituzione è auspicabile; in caso contrario, si regolamenterà la quantità di tale sostanza, nell’ottica di preservare la sicurezza dei suoi utilizzatori.

Inoltre, sono necessarie valutazioni economiche sulla sostanza in esame, così come considerazioni sul suo impatto ambientale, con l’obiettivo di preservare le risorse naturali. Un esempio è la produzione ed impiego di pigmenti a base di Cr VI (coloranti, vernici, inchiostri e plastiche). I cromati sono aggiunti come agenti anticorrosivi nelle vernici e nei primer per alluminio o altri rivestimenti superficiali. Data la sua tossicità, dovuta al fatto che ha capacità ossidante, attività tossica sul citoplasma e proprietà mutagene (è stato dichiarato cancerogeno se inalato), ma poiché non si può prescindere dalla sua presenza, è stato necessario fissare dei limiti che ne regolamentino l’utilizzo.

Farmaco

Farmaco, dal greco, indica qualsiasi sostanza capace di produrre in un organismo vivente modificazioni funzionali, utili o dannose, mediante un’azione chimica, fisico-chimica o fisica. Fondamentalmente non esistono differenze tra il farmaco in senso stretto ed il “tossico”, ma vale la regola di Paracelso secondo cui ogni rimedio può diventare di per se stesso un veleno se viene dato a dosaggi sufficientemente alti (dosis sola facit venenum).

Non appena si presenta una sostanza di interesse medico, viene impegnata per prima la farmacologia descrittiva; si indaga e si descrive l’effetto della sostanza. Contemporaneamente, la tossicologia descrittiva descrive la tossicità della sostanza e la sintomatologia relativa.

Definizioni e concetti chiave

Una sostanza chimica diventa tossica, a livello locale o sistemico, quando supera le barriere naturali dell’organismo ed interagisce con determinati organi e tessuti bersaglio, a dare effetti dannosi. Va sottolineato che la maggior parte delle sostanze tossiche non causa alterazioni della stessa gravità in tutti gli organi, ma in genere evoca una tossicità più marcata su uno o due siti che vengono appunto definiti “bersaglio dell’azione tossica”. L’organo bersaglio non è necessariamente quello in cui il composto tossico si concentra maggiormente.

Le sostanze chimiche possono presentare diversi gradi di tossicità, anche in relazione alla loro struttura chimica (stereochimica). Nel caso di farmaci o sostanze tossiche chirali (non sovrapponibili alla loro immagine speculare) somministrati o diffusi nell’ambiente come miscela racemica (coppia di enantiomeri), può capitare che una sola delle strutture molecolari dia luogo all’effetto desiderato, mentre l’altra, a causa di una diversa interazione proteica, sia inerte o provochi addirittura effetti tossici. Dato l’elevato costo della separazione delle miscele racemiche nei loro enantiomeri, è indispensabile valutare con precisione se è preferibile che una sostanza chirale sia commercializzata come miscela racemica o in forma isolata e purificata. Obiettivo finale è preservare sempre la sicurezza di chi ha a che fare con determinate sostanze tossiche e minimizzarne il rischio di esposizione.

Normative e sicurezza

Per descrivere i rischi per la salute umana, animale ed ambientale connessi alla manipolazione di sostanze chimiche, sono state introdotte le frasi R (frasi di rischio), ossia frasi convenzionali, codificate dall'Unione Europea. La normativa prevedeva che ogni confezione di prodotto chimico recasse sulla propria etichetta le Frasi R e le Frasi S corrispondenti al prodotto chimico ivi contenuto. In seguito la direttiva 1999/45/CEE è stata abrogata dal Regolamento (CE) n° 1272/2008, che sostituisce le frasi R con le Frasi H. Ad ogni frase è associato un codice univoco composto dalla lettera R seguita da un numero. Ad ogni codice corrispondono le diverse traduzioni della frase in ogni lingua ufficiale dell'Unione Europea.

Ambito alimentare

In ambito alimentare la sicurezza e la tossicità diventano importanti nel momento in cui vengono utilizzati gli additivi alimentari. Essi sono definiti per legge a livello europeo come "qualsiasi sostanza normalmente non consumata come alimento in quanto tale e non utilizzata come ingrediente tipico degli alimenti, indipendentemente dal fatto di avere un valore nutritivo, che aggiunta intenzionalmente ai prodotti alimentari per un fine tecnologico nelle fasi di produzione, trasformazione, preparazione, trattamento, imballaggio, trasporto o immagazzinamento degli alimenti, si possa ragionevolmente presumere che diventi, essa stessa o i suoi derivati, un componente di tali alimenti, direttamente o indirettamente".

• Additivi che aiutano a preservare la freschezza degli alimenti: conservanti, che rallentano la crescita di microbi, e antiossidanti, che prevengono i fenomeni di irrancidimento.
• Additivi che migliorano le caratteristiche sensoriali degli alimenti: coloranti, addensanti, emulsionanti, dolcificanti, esaltatori di sapidità.
• Additivi tecnologici, usati per facilitare la lavorazione degli alimenti ma che non hanno una specifica funzione nel prodotto finale (definiti anche adiuvanti): agenti antischiuma, antiagglomeranti ecc.

Gli additivi subiscono a livello europeo e internazionale un processo di valutazione della sicurezza prima di essere autorizzati per l'uso alimentare. In Europa la valutazione viene effettuata dall'Agenzia per la Sicurezza Alimentare (EFSA), e a livello internazionale dal Comitato congiunto di esperti sugli additivi alimentari (JECFA - Joint Expert Committee on Food Additives) dell'Organizzazione per l'Alimentazione e l'Agricoltura (FAO) e dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS).

Gli additivi autorizzati a livello europeo sono contrassegnati da una sigla numerica preceduta dalla lettera E. Tra i conservanti rientrano nitriti e nitrati:

• Nitrati: di per sé sono innocui ma in particolari condizioni possono trasformarsi in nitriti (lunghi periodi di conservazione, calore, pH acido). Questa percentuale si aggira normalmente intorno al 20-30% e li rende molto meno pericolosi dei nitriti.
• Nitriti: hanno la capacità di legarsi all'emoglobina (la proteina del sangue che trasporta l'ossigeno nel nostro organismo) trasformandola in metaemoglobina e riducendo di conseguenza il trasporto di ossigeno ai tessuti. Questo aspetto è particolarmente pericoloso per i bambini ed i neonati che assorbono maggiori quantitativi di nitriti dall'alimentazione. La scarsa ossigenazione può, in questi casi, provocare asfissia e difficoltà respiratorie. La capacità dei nitriti di combinarsi con le ammine (composti organici presenti soprattutto negli alimenti proteici, come carne, salumi e formaggi) genera sostanze cancerogene chiamate nitrosamine. Queste sostanze si formano già nella cavità orale per opera di alcuni enzimi salivari. Nello stomaco viene invece secreta la vitamina C (o acido ascorbico) che impedisce la trasformazione delle ammine in nitrosammine, generando però acido nitrico, un potente agente mutageno. Inoltre, se da un lato la presenza di vitamina C impedisce questa reazione, dall'altro l'ambiente acido dello stomaco la favorisce.

Valutazione del rischio

La valutazione del rischio inizia dall’osservazione pratica in laboratorio dei potenziali effetti tossici di una determinata sostanza. Inizialmente il campione su cui testare l’agente tossico è l’animale da laboratorio (solitamente il topo) per poi passare all’uomo, estrapolando dalla letteratura e da misurazioni pratiche le concentrazioni della sostanza da testare.

La via di somministrazione della sostanza all’animale dipende dal modo in cui la tossicità di tale agente si esplica sull’uomo; ad esempio, se per l’uomo l’agente è tossico una volta inalato, si testerà tale agente sull’animale facendoglielo inalare. Se invece un agente è tossico per l’uomo per applicazione cutanea, sull’animale sarà applicato per via topica ecc. In questo modo si stabilisce se un agente è tossico o meno. In secondo luogo, si determina la relazione tra la dose e l’incidenza dell’effetto tossico sull’uomo, attraverso le curve dose-risposta.

Infine, una volta appurata la dose che determina la tossicità su una “popolazione campione”, il rischio va gestito attraverso lo sviluppo di una specifica normativa che tuteli la salute pubblica.

Test statistici

Una popolazione è un insieme di soggetti che hanno almeno una caratteristica comune. Misurando un parametro in una popolazione (es. peso) si ha inevitabilmente una variabilità del parametro tra i soggetti. In ambito biologico, la variabilità è determinata da moltissimi fattori, genetici, endogeni ed ambientali. In ambito tossicologico, tutti questi fattori fanno sì che la sensibilità individuale sia estremamente variabile.

Un parametro (o variabile) continuo si misura in modo quantitativo e può assumere un qualsiasi valore numerico (es. peso, altezza, pressione arteriosa, glicemia ecc). Un parametro discreto si misura in modo quantitativo ma può assumere solo un numero finito di valori numerici (es. numero di figli, numero di eventi patologici ecc). Per le variabili continue e discrete si può descrivere la distribuzione delle frequenze nella popolazione, da cui si ricavano i parametri che descrivono questa distribuzione.

Il confronto tra due o più popolazioni consiste nel confronto dei parametri che descrivono la distribuzione delle frequenze. Un parametro nominale (o categorico) si misura in modo qualitativo (es. sesso, gruppo sanguigno, nazionalità, grado di istruzione ecc). Per variabili nominali si possono solo descrivere le frequenze di ciascuna variabile nella popolazione. Il confronto tra due (o più) popolazioni consiste nel confrontare le frequenze. Ad esempio, trattando 5 gruppi di 24 animali ciascuno con dosi di 5, 10, 20, 40, 80 mg/kg di una certa sostanza è stata riscontrata la morte dei seguenti animali:

Quando, come in questo esempio, le dosi sono ordinate in senso crescente, è facile vedere come all’aumentare della dose si riscontri un incremento del numero di animali morti. In termini intuitivi, l’altezza del “gradino” di incremento della mortalità relativa ad ogni dose corrisponde al contributo che l’incremento di dose rispetto alla precedente ha fornito in termini di mortalità degli animali. In altre parole, se con 20 mg/kg sono morti 16 animali e con 40 mg/kg ne sono morti 21, il contributo in termini di aumento di mortalità della variazione di dose da 20 a 40 mg/kg è pari alla differenza (21-16), ossia a 5 animali.

I numeri della colonna C rappresentano quella che in statistica si definisce una distribuzione di frequenza, derivata da una distribuzione cumulativa di frequenze. Il termine distribuzione cumulativa di frequenze sottolinea il fatto che il numero totale di animali morti, a seguito del trattamento con una certa dose di sostanza è uguale alla somma del contributo alla mortalità di quella dose più quelli di tutte le dosi più basse che la precedono. Gli eventi che si registrano in un esperimento di tossicologia sono quindi distribuzioni cumulative di frequenze del fenomeno “morte” in gruppi di animali trattati con dosi crescenti di una certa sostanza. Questo studio è incentrato sul tentativo di stabilire l’andamento della relazione dose-effetto.

Valori medi e distribuzioni

Il modo più semplice per descrivere in termini quantitativi la variabilità di queste risposte è quello di costruire un istogramma, una rappresentazione grafica nella quale l’area delle varie colonne è proporzionale alle frequenze di distribuzione. Partendo da una distribuzione di frequenze si può costruire un istogramma di una distribuzione cumulativa di frequenze. In pratica ciò è ottenibile semplicemente “sovrapponendo” le colonne in modo tale che la seconda colonna parta dove finisce la prima e così via. L’espressione grafica risultante sarà una “sovrapposizione” cumulativa di frequenze.

Valori statistici

Al “centro” di una distribuzione di frequenza si possono identificare dei valori molto indicativi delle caratteristiche dei dati in studio, detti valori medi:

• Media aritmetica: è la somma dei valori delle osservazioni diviso per il loro numero. È un descrittore eccellente quando la distribuzione è gaussiana. Peraltro è molto sensibile ai valori estremi, il che la rende talora fuorviante in presenza di una distribuzione fortemente asimmetrica. In questi casi, infatti, si ricorre alla mediana.
• Mediana: è il valore che divide la serie di dati in due metà di numerosità uguale. Ha il vantaggio di non essere influenzata da una eventuale asimmetria nella distribuzione dei dati, infatti è usata in caso di distribuzione non gaussiana. È sempre il valore che la divide in due parti ad ugual numero di osservazioni. Essa appartiene ad un modo così detto “non parametrico” di rappresentare la distribuzione, quello basato sulla classifica, ad esempio in ordine di grandezza crescente, dei dati che vengono poi suddivisi in frazioni uguali: i quantili, i decili e i percentili. La mediana è il secondo quartile, il quinto decile e il cinquantesimo percentile.
• Moda: è il valore più frequente di una distribuzione. Si può apprezzare soltanto in serie molto numerose di dati, raggruppabili in classi di frequenza piuttosto nutrite. Il valore modale è il valore di picco. È applicabile sia ai dati quantitativi che qualitativi. Se vi sono più picchi vi saranno diverse mode.

In una distribuzione simmetrica, media, mediana e moda coincidono. Il percentile è il valore della variabile al di sotto del quale cade una determinata percentuale della distribuzione. Nell'esempio, il 25° percentile corrisponde a 58.8 cm circa, il 50° a poco meno di 61 cm ed il 75° a 63.3 cm circa. Ciò significa che il 25% dei nostri bracchi era più basso di 58.8 cm, il 50% era più basso di 61 cm ecc. Significa anche che, dato un bracco di altezza A, possiamo calcolare come esso si colloca nella popolazione da cui deriva. Per esempio, il 90% dei bracchi è più basso di 65 cm, e quindi un cane alto 65 cm...