Appunti Tossicologia

TOSSICOLOGIA> studia gli effetti indesiderati delle sostanze chimiche sugli esseri

viventi. Uomo in > ecosistema(ambiente)>influenza stato di salute.

SICUREZZA> non è un fattore assoluto> ma probabilità> importante trovare mezzi e

modi di utilizzo di una sostanza in maniera sicura. Tossicologia si pone questo

obiettivo(individuazione). Sostanza(struttura/caratteristiche chimico fisiche)>

esposizione> ingresso nell’organismo> distribuzione organi/tessuti> target biologici>

interazione di tipo chimico(non è la risposta biologica)> reazione primaria> se si

esprime> danno con conseguenze. Diverse modalità di esposizione: singola, ripetuta,

brevi periodi, tutta la vita, alta bassa dose. Solitamente> ambiente e alimenti> bassa

esposizione. Esposizione occupazionale> dovuta al lavoro. Avvelenamenti,

intossicazioni> possono portare alla morte.

RISCHIO> azzardo x esposizione. Azzardo> possibilità che un danno derivi da una

sostanza> proprietà tossicologica intrinseca di una molecola(anche l’evento

pericoloso). Esposizione è legata alla probabilità.

VALUTAZIONE RISCHIO> identificazione dell’azzardo> quantificazione(dose risposta)>

valutazione esposizione e susciettibilità individuo> caratterizzazione rischio e analisi

costo beneficio.

TOSSICOLOGIA MODERNA> definisce limiti di sicurezza agenti chimici> scienza di

prevenzione per salute uomo e ambiente

TIPI DI ESPOSIZIONE

- Acuta: singolo episodio, alta dose

- Ripetuta: multipla. Può essere: subacuta(<5% vita), subcronica(tra 5-20% vita),

cronica(intera o gran parte della vita).

Modalità di esposizione diverse possono dare effetti tossici diversi.

EFFETTO TOSSICO

- Immediato> si sviluppa dopo una singola esposizione

- Ritardato> periodo di latenza

- Reversibile o irreversibile> dipende da capacità rigenerative tessuto

Anche

- Persistente

- Transiente> certo tempo

- Cumulativa> conseguenza ad un altro effetto tossico> fibrosi x alcolismo

cronico

Tossicità> descrizione>

- Locale o sistemica

- Natura e meccanismo tossico

- Organo/tessuto bersaglio

- Esposizione(specie, via, entità)

RELAZIONE DOSE RISPOSTA

Alcuni casi come cancerogenesi, tox. Immunologica e genetica> indipendenti da dose

Normalmente aumento dose= aumento probabilità= aumento rischio

Requisiti x determinare dose-risposta> metodo che li quantifichi, aumento dose=

aumento rischio, assicurarsi che l’effetto sia dovuto dall’agente tossico studiato.

2 Rappresentazioni: graduale(sigmoide) o quantale(curva a campana)

RELAZIONE GRADUALE> % risposta in funzione della dose: fascia iporeattivi(risposta a

dosi più alte), risposta media e fascia iperreattivi(rispondono a dosi più basse). DE50>

dose efficace nel 50% della popolazione. Indice terapeutico> DL50/DE50. Margine di

sicurezza: DL1/DE99> più efficace.

RELAZIONE QUANTALE> distribuzione risposta nella popolazione> variabilità dovuta a

suscettibilità individuale.

Effetto tossico> aumentare dose aumenta l’eff. Tossico

Eff. Protettivo> aumento dose, diminuisce eff. Tossico

Eff. Combinato> basse dosi eff. Protettivo, alte dosi eff. Tossico> curva a campana

rovesciata ( effetto ormetico vitamine e micronutrienti essenziali> equilibrio

omeostatico)

Curva graduale> info su potenza ed efficacia. Efficacia> effetto maggiore(altezza

curva). Potenza> dose minore(curva spostata a sinistra), stesso effetto.

MECCANISMI DI TOSSICITA’> 3 principali

- Sostanza tossica + target> tossicità diretta. Pochi casi, es: acido forte cade

sulla mano.

- Sostanza tossica entra nell’organismo> organi/tessuti> target o alterazione

ambiente biologico> disfunzione cellulare/danno

- Meccanismo più complesso(es. cancerogeni)> distribuzione organi/tessuti>

target o alt. Ambiente> danno> tossicità solo se non abbiamo capacità

adattativa o falliscono meccanismi di riparazione.

EFFETTO TOSSICO> dipende da dose che raggiunge il target, no da dose di

esposizione> DOSE EFFETTIVA> dipende da proprietà chimico fisiche e da percorso

ADME> formato da meccanismi che facilitano e meccanismi che si oppongono alla

distribuzione al target.

MECCANISMI + > porosità endotelio capillare, trasporto specializzato attraverso

membrane, accumulo in organelli cellulari.

MECCANISMI - >legame proteine plasmatiche, barriere specializzate, efflusso dalla

cellula, distrubuzione siti di deposito, legame proteine intracellulari.

INTOSSICAZIONE E DETOSSIFICAZIONE

Maggior parte composti hanno bisogno di attivazione metabolica> tradotta in> gruppi

elettrofili, radicali liberi, nucleofili, intermedi di ciclo ossido e riduttivi.

Detossificazione> eliminano o prevengono la sostanza tossica finale:

- Detox sostanze prive di gruppi funzionali> 2 passaggi

- Detox nucleofili> coniugazione diretta

- Detox elettrofili> coniugazione glutatione(soprattutto nel fegato)

- Detox radicali liberi> SOD, CAT, GPX

- Detox proteine> proteasi intra e extra cellulari

Diversi nuclei di vulnerabilità> sesso, bambini, anziani> diversa capacità metabolica.

INTERMEDIO TOSSICO-TARGET

Interazione che avvia l’evento tossico> diverse caratteristiche, es: legame covalente o

non covalente, reazione enzimatica, trasferimento e-.

Target principali: acidi nucleici, proteine, lipidi> caratt. Fondamentali> reattivi(siti o

gruppi funzionali) + configurazione sterica accessibile a una conc sufficiente per

esplicare l’effetto. NB: tossicologia studia patologie iatrogene perciò non si

considerano recettori ma proteine strutturali come enzimi ecc.

CONSEGUENZE INT. TOSSICO/TARGET

- Disfunzione> soprattutto con target proteico, alterazioni citoscheletriche

- Distruzione> int. Acidi nucleici> legami crociati tra proteine, proteine/dna

- Formazione neoantigeni> int proteine di superficie> nuovo asset genetico,

riconosciuto come estraneo.

TOX NON CAUSATA DA INTERAZIONE> agiscono sul microambiente biologico. Es:

alcoli(metanolo> dissipazione gradiente ionico per sintesi ATP), detergenti( alterano

fase lipidica membrana). Causate anche da precipitazione sostanze> es. sulfamidici a

livello del tubulo prossimale.

DISFUNZIONE CELLULARE> dipende dal bersaglio> cellule elettricamente eccitabili>

alterazione attività cellulare. Es. neurone> alterazione trasmissione impulso. Dipende

dal ruolo nelle fisiologia del sistema.

RIPARAZIONE E ADATTAMENTO> tossicità si esprime solo se falliscono

- Meccanismi di riparazione> molecolare, cellulare, tissutale> alterazioni

chimiche revertite, riparazione proteine ossidate, denaturate, aggregate,

riparazione DNA.

- Meccanismi di adattamento> aumentate capacità di difesa al tossico> es.

diminuzione della concentrazione del tossico al sito bersaglio, aumento

riparazione, diminuzione della risposta cellulare.

Se falliscono> possibili conseguenze> Cancerogenesi, fibrosi, necrosi tissutale.

FENOMENO COMPLESSO> possono generarsi più tossici> più interazioni con diversi

target che possono anche influenzarsi tra loro.

RELAZIONE BIOCINETICA E TOSSICITA’

- Sostanza assorbita> torrente ematico> eliminazione rapida. Eliminazione è il

meccanismo primario, quindi no tossicità

- Sostanza> torrente ematico> induce effetto patologico/danno al DNA>

riparazione o danno

- Biotrasformazione> metaboliti detossificati/escreti oppure attivati> tossici>

danni patologici.

BIOTRASFORMAZIONE> reazioni>

- Fase 1> introduzione gruppo funzionale> ossidazione, idrolisi, riduzione

- Fase 2> coniugazione> con substrato endogeno come acido glucuronico,

glutatione, amminoacidi, metilazione, acetilazione

- Fase 3> metabolismo che riguarda coniugati con glutatione

- Citocromi P450

NB: se detox fallisce> accumulo metabolita tossico> saturazione capacità

metabolizzante, deplezione enzimi utili, consumo substrati, depauperamento

antiossidanti cellulari, reazioni di coniugazione revertite.

Metaboliti:

- Stabili> con attività superiore o diversa rispetto a composto iniziale

- Reattivi(elettrofilo)> in grado di interagire

- Prodotti secondari del metabolismo> reattivi e tossici> specie radicaliche

dell’ossigeno

INDUZIONE ENZIMATICA> incremento attività enzimi farmaco-metabolizzanti da parte

di una sostanza. Importante sapere quando si manifesta e quanto dura. Aumento

flusso ematico, aumento peso dell’organo, proliferazione REL, incremento citp450

totale, incremento sintesi proteica e RNA. Avviene x somministrazioni multiple, mai

singole. Si manifesta in circa 2-3 settimane.

INIBIZIONE ENZIMATICA> anche dopo somministrazione singola. Inibizione reversibile

o irreversibile: legame non covalente(serve tempo) e covalente(serve neosintesi). Max

inibizione a 24 ore, dura 4-5 giorni.

ATTIVAZIONE METABOLICA NEL SITO DI TOSSICITA’> paracetamolo>

- Normale> sulfo coniugato e glicoconuigato enzimi fase 2. 2% dà metabolismo

ossidativo> citp450> intermedio elettrifilo> n acetilparabenzochinonimmina>

detox con glutatione> eliminato come acido mercapturico

- Sovradosaggio> vie fase 2 saturate> solo via ossidativa> n

acetilparabenzochinonimmina> deplezione glutatione> dà legami covalenti con

le proteine epatiche> necrosi epatica.

MODULAZIONE METABOLICA DEGLI EFFETTI TOSSICI> meccanismi extracellulari che

influiscono sulla biocinetica> inibizione assorbimento gastrointestinale, inibizione

formazione composti reattivi x interazione chimica diretta, inibizione formazione

reattivi causata da flora intestinale.

MECCANISMI DI MORTE CELLULARE> necrosi e apoptosi> dipende da vari fattori> es.

condizione stressoria dovuta da interazione tra target e tossico> decisione di morte.

AUTOFAGIA> alla base del turnover dei componenti citoplasmatici tramite rimozione

degli organelli danneggiati. Lisosomi> formano vescicole a doppia membrana che

ingeriscono la sostanza da eliminare. Meccanismo di pulizia fisiologica.

NECROSI> evento patologico in seguito a esposizioni acute(alte dosi o severa anossia)

APOPTOSI> meccanismo fisiologico di morte programmata. Difesa rispetto a tipi

cellulari potenzialmente pericolosi> es. cellule infette da virus, cellule con DNA

danneggiato.

Diverse per quanto riguarda morfologia, funzioni e meccanismi.

ALTERAZIONI MORFOLOGICHE NELLA NECROSI> danno strutture

fondamentali(organelli), rigonfiamento cellulare, degradazione DNA, lisi cellulare e

liberazione contenuto con infiammazione cellule vicinali, genesi specie radicaliche,

amplificazione del danno.

ALTERAZIONI MORFOLOGICHE APOPTOSI> contrazione cellula, organuli integri, DNA

frammentato, formazione di corpi apoptotici con recettori specifici x fagociti.

Condizione stressoria> bilancio stimoli positivi e negativi> apoptosi> recettori>

trombospondina, proteine desialilate(x fagocita), fosfatidilserina.

Stimoli positivi> IL-2, fattori di crescita neuronali

Stimoli negativi> danno DNA, aumento livello ossidanti

GENI NEL CONTROLLO DELL’ APOPTOSI> geni costitutivi> oncogeni> a livello

nucleare, mitocondriale, 1 a livello della membrana(ci sono recettori di morte

APO1/FAS)> p53, bcl2, myc> variamente rappresentati.

Condizioni di salute cellulare> p53 attivo(nucleo)> silenzia bcl2(mitocondrio), gene

antiapoptotico. Quindi p53 mantiene la possibilità di dare apoptosi ed esprime

proteine bax proapoptotiche. Inoltre riconosce la condizione stressoria> induce

attivazione geni x espressione dell’apoptosi; agisce(rallenta) tra fase G1-

S(prereplicativa) e G1-M(divisione).

VIE APOPTOTICHE> intrinseca> danno a mitocondrio e DNA/ ed estrinseca>

interazione con recettori della morte.

DESTINO CELLULA DANNEGGIATA> dipende da entità esposizione e danno. Dipende

dallo stato del mitocondrio poiché apoptosi richiede ATP.

- Pochi mitocondri danneggiati> autofagia li rimuove, con sopravvivenza

cellulare.

- Numero discreto di mitocondri>ho abbastanza ATP e si attiva apoptosi.

- Numero troppo grande di mitocondri danneggiati> crollano livelli ATP> necrosi

TOSSICITA’ GENETICA> a livello degli acidi nucleici> agenti chimici e fisici(radiazioni

ionizzanti e non) in grado di interagire con essi e causare alterazioni delle componenti

geniche, senza dare citotossicità.

Caratteristiche meccanismo:

- Acuto> esposizione singola

- Dose indipendente

- Probabilistico

- Irreversibile

Danni> siti apurinici, apirimidinici, alchilazione, formazione radicali liberi, rotture

singolo o doppio filamento, addotti DNA, dimeri tra pirimidine, danni basi azotate,

legami crociati inter, intrafilamento e DNA/proteine. Risultato> mutazioni> alterazioni

stabili e irreversibili, inaspettate e casuali.

Agenti mutageni possono causare:

- MUTAZIONI GENICHE> modificazioni struttura DNA di singoli geni

- ABERRAZIONI CROMOSOMICHE> delezione, riarrangiamento, duplicazione di

segmenti di cromosomi(alt. Strutturali)

- ALTERAZIONE NUMERO DI CROMOSOMI

PRINCIPALI MUTAZIONI GENICHE: sostituzioni qualitative(cambiano singole coppie di

basi), sostituzioni quantitative(aggiunte o tolte coppie di basi. Transizioni> ordine

purina pirimidina mantenuto, es. purina sostituita con purina. Trasversioni>

sostituzione di una purina con pirimidina o viceversa.

PRINCIPALI ABERRAZIONI CROMOSOMICHE

Su di un solo cromosoma

- Frammento acentrico o minute> rottura braccia cromatidiche

- Riarrangiamento per ottenere fusione delle estremità> anello o anello acentrico

Nb: nel caso di frammenti senza centromero> no divisione cellulare> perdita

informazione genica del frammento.

- Inversione pericentrica> frammenti migrano alle altre due braccia cromatidiche,

fondendosi> possono portare a stravolgere l’espressione genica, con

attivazione di proto-oncogeni o inattivazione di oncogeni.

Su due o più cromosomi

- Dicentrico> rottura braccia cromatidiche di 2 cromosomi che si fondono tra

loro> struttura con 2 centromeri e un frammento acentrico(si perderà)> spesso

causate da radiazioni.

- Scambio bilanciato> possono contribuire ad attivazione o soppressione di alcuni

geni

ABERRAZIONI NUMERICHE

Corredo diploide normale> n x 2

Poliploidia> n x m > m diverso da 2

Aneuploidia> perdita o aquisizione cromosomi > non genotossico, dose dipendente>

es. cromosoma non migra da piastra equatoriale ai poli della cellula

Trisomia> acquisizione cromosoma in nucleo diploide

Monosomia> delezione di un cromosoma in un nucleo diploide

Mutazioni> correlate a cancerogenesi, teratogenesi, disturbi ciclo riproduttivo,

patologie croniche degenerative.

FATTORI CHE INFLUENZANO IL DANNO GENETICO>

- concentrazione nell’ambiente> anche meccanismi dose indipendenti> x dose

dipendenti linearità, x dose indipendenti aumento probabilità

- percorso farmacocinetico/tossicocinetico

- capacità metabolizzanti dei tessuti>portano formazione ultimo tossico, nell’organo

bersaglio

- reattività acquisita dal composto> nucleofilo, elettrofilo, intermedio ciclo ossido-

riduttivo

- capacità riparative o di amplificazione danno

-opportunità di espressione danno genetico; esposizione> mutazione> espressione

danno> danno genetico. Mutazione non è danno genetico.

- abilità tessuto di sopprimere cellule aberranti> apoptosi post- replicativa,

meccanismi immunologici…

Esposizione> eventi multipli> danno genetico. Ultimo mutageno può non formarsi

nella concentrazione potenziale, convertito in metaboliti inattivi, essere talmente

reattivo da legare substrati non critici.

OPPORTUNITA’ DELLA CELLULA

Mutazione> conc. Sub citotossiche. Formazione addotto con DNA> lesione

premutazionale, no mutazione> apprezzata da network decisionale> p53> 3

possibilità:

- P53 agisce in fase G1-S> attivati sistemi di riparazione> se efficaci> nessun

danno> integrità cellulare

- Condizione non riparabile> apoptosi poiché pericoloso

- Lesione pre-mutazionale> replicazione cellulare> mutazione>espressione

danno genetico

Nb: negli studi di genotossicità è importante usare dosi sub-citotossiche

Ogni mutazione porta a instabilità genomica> DNA diventa più suscettibile ad

accusare un successivo danno> danni al DNA sono cumulativi> maggiori sono>

maggiore vulnerabilità.

SISTEMI DI RIPARAZIONE DNA

Intervengono prima della replicazione> singolo passaggio o multiplo passaggio. Es.

singolo pass: raggi UV> pelle DNA> due legami tra due pirimidine adiacenti> dimero

di pirimidina>foto-liasi(meccanismo)> rompe doppio legame> ripristino struttura. Es.

multiplo pass: escissione basi/nuclotidi(più basi interessate)>riconoscimento >enzimi

glicosilasi> taglio segmento DNA> neosintesi con l’altro filamento come template>

nuovo segmento cucito.

LEGAME MECCANISMI RIPARATIVI E DOSE DI ESPOSIZIONE

Meccanismi influenzati dalla dose di esposizione

Enzimi:

- Costitutivi> livello fisso

- Inducibili> specifiche esposizioni ripetute> aumento attività> ma maggior

inclinazione aall’errore, minore precisione nella riparazione che può essere non

corretta

Alto livello di esposizione acuta> saturazione enzimi costitutivi> danni

Basso livello di esposizione ma ripetuto> induzione enzimatica> posso avere errore

nella riparazione.

CLASSIFICAZIONE SOSTANZE CON QUESTO AZZARDO

AGENTE GENOTOSSICO> composto/metabolita che dà interazione con il DNA>

interazione diretta/primaria

AGENTE NON GENOTOSSICO> composto privo di attività genotossica(non ha int

diretta con DNA

STRUTTURE ALLARME> tramite cui