Biologia cellulare - Appunti completi

Biologia cellulare

Argomenti trattati

• Apoptosi, necrosi, autofagia, metodi di studio
• Divisione cellulare, comunicazioni cellulari, trasduzione del segnale
• Ematopoiesi, cellule staminali, fattori di crescita, eritropoiesi, emoglobina
• Metabolismo del ferro, granulopoiesi, piastrinopoiesi
• Esame emocromocitometrico, striscio di sangue periferico, formula leucocitaria
• Esame del midollo
• Reazioni citochimiche
• Test dell’emostasi, fattori della coagulazione, coagulazione plasmatica

Apoptosi

L'apoptosi è una forma di morte cellulare chiamata anche "morte cellulare programmata". È regolata geneticamente e non suscita reazioni infiammatorie. La cellula apoptotica va incontro a una serie di modificazioni morfologiche: riduzione del volume cellulare, comparsa di protrusioni della membrana citoplasmatica, addensamento della cromatina, frammentazione del nucleo e, infine, si ha la fagocitosi dei corpi apoptotici dai macrofagi.

È un processo attivo che richiede consumo di energia e un’espressione genica de novo. Questo processo è molto importante anche fisiologicamente, come nell’invecchiamento e nell’embriogenesi, serve a mantenere il bilancio tra morte cellulare e produzione. Disregolazioni del processo apoptotico sono causa di molte condizioni morbose.

Distinzione tra necrosi e apoptosi

Occorre fare distinzione tra necrosi e apoptosi: la necrosi è passiva senza consumo di energia mentre l’apoptosi è attiva. La necrosi è solo patologica, l’apoptosi è sia fisiologica che patologica. Durante l’apoptosi la cellula va incontro a condensazione, quindi diminuisce il volume, nei fenomeni necrotici si ha un rigonfiamento cellulare e la cellula va incontro a lisi, i corpi apoptotici vengono fagocitati mentre nella necrosi non vi è intervento dei macrofagi, si ha dispersione dei residui cellulari. L’apoptosi non determina infiammazione, la necrosi si accompagna sempre all’infiammazione. Nell’apoptosi colpisce singole cellule mentre la necrosi in genere colpisce tutto il tessuto.

L’apoptosi è un fenomeno conservato evolutivamente e avviene in tutti gli animali studiati, la cellula va incontro ad apoptosi in assenza di opportuni stimoli per crescita, in assenza dei cosiddetti "fattori di crescita".

Ruolo dell'apoptosi

Il ruolo dell’apoptosi è cruciale per lo sviluppo embrionale, infatti errori nell’apoptosi possono causare difetti di nascita. È importante per mantenere l’omeostasi cellulare cioè mantenere il numero di cellule, la mitosi è bilanciata dall’apoptosi per regolare il numero totale di cellule. Una disregolazione dell’apoptosi contribuisce all’insorgenza di determinate condizioni morbose, l’eccesso di apoptosi porta alle malattie neurodegenerative, una deficienza di apoptosi si osserva nei tumori.

L’apoptosi ha un ruolo importante durante la morfogenesi, serve ad eliminare le cellule in eccesso ad esempio nella delimitazione delle dita della mano o ad eliminare cellule non funzionali. È critica anche nel rimuovere i cloni di linfociti che riconoscono il "self". Anche cellule infettate da virus vengono eliminate con l’induzione dell’apoptosi, conserva il volume e dimensioni di un determinato organo eliminando l’eccesso cellulare.

Stadi dell'apoptosi

Gli stadi dell’apoptosi sono rappresentati dall’iniziazione, dalla modulazione o regolazione genetica e dai meccanismi effettori. Sono considerati stimoli tutti quegli eventi che danno inizio al programma apoptotico, i segnali di morte includono: farmaci citotossici, radiazioni gamma e UV, agenti chemioterapici che danneggiano il DNA o sottrazione di fattori di crescita, varie citochine che attivano i fattori di morte come il FAS o TNF.

Attraverso una varietà di percorsi questi stimoli generano espressione genica, il destino della cellula viene determinato dai cosiddetti "modulatori" molecole pro o anti apoptotiche, si tratta di proteine regolatrici del ciclo cellulare, enzimi ad attività chinasina, fattori di trascrizione...

Meccanismi effettori dell'apoptosi

Qualora una cellula scelga di morire vengono attivati i meccanismi effettori, i principali sono una famiglia di proteasi denominati "caspasi", l’attivazione a cascata di questi enzimi porta all’attivazione di altri effettori o direttamente al clivaggio di componenti fondamentali della cellula come il DNA o le proteine del citoscheletro. Con la rottura di questi substrati si riconoscono alterazioni biochimiche o morfologiche che portano la cellula alla morte.

I fattori che “attivano” con un meccanismo estrinseco l’apoptosi sono: recettori di superficie come i FAS che si lega ad un ligando specifico, il recettore del TNFR, il recettore di TRAIL... Invece stimoli intrinseci sono rappresentati da: danno del nucleo, dal DNA nucleare, presenza di sostanze tossiche nel citoplasma oppure ad uno stress del Reticolo Endoplasmatico per l’accumulo di proteine anomale oppure può essere dovuta ad una mutazione di particolari geni come il gene p53.

Vie apoptotiche

Nella via apoptotica estrinseca il legame del ligando con il suo recettore induce la formazione di un complesso chiamato "complesso di morte" con conseguente attivazione delle Caspasi: iniziatrici ed effettrici. Che agiscono sui substrati apoptotici distruggendoli. La via intrinseca è mediata dai mitocondri e controllata dalla famiglia del Bcl-2, alcuni di loro hanno azione pro apoptotica, altri contro. Quando prevalgono i pro, si ha un aumento della permeabilità della membrana mitocondriale e si ha il rilascio dal mitocondrio di citocromo C e altri fattori pro apoptotici, il citocromo C nel citoplasma si lega ad un fattore pro apoptotico citoplasmatico Apaf-1 e alla Caspasi 9 attivandola, come conseguenza si ha l’attivazione delle Caspasi effettrici che distruggono i substrati apoptotici.

Il dialogo tra la via estrinseca ed intrinseca avviene tramite una proteina denominata "Bid", una terza via apoptotica (sempre intrinseca) è innescata da stress del Reticolo endoplasmatico per accumulo su di esso di proteine anomale, lo stress comporta l’attivazione di Caspasi 12 e, a catena, delle Caspasi effettrici.

Fattori pro e anti apoptotici

I fattori che promuovono la vitalità delle cellule (anti apoptotici) sono le cellule emopoietiche, sono i fattori di crescita come l’eritropoietina, il fattore di crescita granulocitario macrofagico. Mentre hanno un’azione pro apoptorica agenti chemioterapici, radiazioni, citochine come il TNF, gli ormoni steroidei, agenti ossidanti e le cellule T citotossiche.

Le cellule citotossiche nell’induzione dell’apoptosi agiscono producendo un enzima, la granzime B e mediante perforina passa all’interno della cellula bersaglio e attiva le Caspasi che con un meccanismo di attivazione a cascata portano all’attivazione dell’effettori di morte con distruzione dei substrati apoptotici.

Regolazione dell'apoptosi

Il fenomeno dell’apoptosi è finemente regolato a vari livelli, esistono numerosi inibitori di ciascuno delle diverse tappe. Anche alcuni membri della famiglia del Bcl-2 hanno una funzione inibitrice dell’apoptosi come il Bcl-2 stesso la cui espressione è stata scoperta in cellule di un particolare tipo di linfoma.

I mitocondri intervengono nel fenomeno apoptotico non soltanto rilasciando il citocromo C ma anche rilasciando endo G e AIF che agiscono direttamente sul DNA nucleare oppure fattori come Omi o Smac che hanno azione pro apoptotica inibidendo i fattori inibitori. Un ruolo importante lo riveste la proteina p53, i cui livelli cellulari aumentano in conseguenza di un danno del DNA, se quest’ultimo è irreversibile i livelli di p53 aumentano in modo tale da portare all’attivazione dei fattori pro-apoptotici della famiglia del Bcl-2, attraverso questi membri si ha un aumento della permeabilità della membrana mitocondriale e la fuoriuscita di fattori pro-apoptotici.

Ruolo delle caspasi

Le caspasi sono proteasi (cisteina aspartato proteasi) che hanno la funzione di clivare i loro substrati in posizione C-terminare a residui di acido aspartico, nelle cellule vengono sintetizzati come proenzimi inattivi e sono localizzati in genere nel citosol, possono essere localizzati anche in corrispondenza di organuli del citoplasma come nei mitocondri o lisosomi. L’attivazione è indotta da clivaggio proteolitico tra domini con formazione di complessi tetramerici. Le caspasi iniziatrici si autoattivano, quelle effettrici sono attivati dalle iniziatrici. Le caspasi sono formate da due subunità che formano un eterodimero e due di questi dimeri si uniscono a formare il tetramero attivo, formato una reazione a catena chiamata “cascata delle caspasi”.

Le caspasi iniziatrici sono attivate da stimoli extracellulari o da rilascio di citocromo C nel citosol, mentre quelle effettrici sono responsabili della rottura proteolitica di importanti substrati citoplasmatici e nucleari vengono attivati dalle iniziatrici. Le Caspasi degradano proteine del citoscheletro con modificazione della struttura cellulare, degradano la laminina del nucleo e sono responsabili del collasso della Cromatina, degradano enzimi coinvolti nella riparazione della cellula la cui attività viene inibita, infine degradano proteine che inibiscono endonucleasi.

Fagocitosi dei corpi apoptotici

I corpi apoptotici vengono poi fagocitati dai macrofagi, questi ultimi li riconoscono perché le cellule apoptotiche estrinsecano sulla superficie cellulare una molecola, la fosfatidilserina che si solito è sulla superficie interna della membrana citoplasmatica e quindi può legarsi ad un recettore specifico situato sulla superficie dei macrofagi che in tal modo riconoscono la cellula apoptotica e la fagocitano.

Inibitori dell'apoptosi

Gli inibitori dell’apoptosi o proteine IAP che agiscono a vari livelli. In genere inibiscono l’attività delle Caspasi.

Il proteasoma, presente in tutte le cellule, è un complesso proteico piuttosto voluminoso che serve a distruggere con un meccanismo proteolitico le proteine pro apoptotiche, quindi se vi è un eccesso di attività del proteasoma si ha inibizione dell’apoptosi, su questo concetto si basa l’utilizzo di farmaci biologici per la terapia di alcune neoplasie.

Importanza dell'apoptosi

L’apoptosi è importante per mantenere l’omeostasi nei tessuti in condizioni fisiologiche, il numero di cellule di un tessuto deriva dall’equilibrio tra proliferazione cellulare e morte cellulare, sia l’una che l’altra sono regolate da meccanismi che le favoriscono e meccanismi che le inibiscono. Un aumento dell’apoptosi si ha nel corso di malattie neurodegenerative, con lesioni ischemiche come ad esempio nell’infarto del miocardio oppure nella distruzione delle cellule infette, rappresenta un importante meccanismo patogenetico nelle sindromi mielodisplastiche che sono condizione pre-leucemiche, che precludono all’insorgenza di una leucemia acuta.

Sono malattie molto particolari caratterizzate da una particolare ricchezza della popolazione midollare e una citopenia periferica, riduzione di numero di globuli rossi, bianchi e piastrine che contrasta con la cellularità del midollo. Questo paradosso è dovuto al fenomeno dell’apoptosi, le cellule midollari non vanno incontro alla morte e non riescono a maturare in modo completo così da passare in circolo. Una riduzione dell’apoptosi si osserva invece nelle malattie autoimmuni per la persistenza di cloni che non riconoscono il self, nel diabete mellito di tipo I e nelle neoplasie.

Apoptosi e tumori

Alcuni tumori possono insorgere come risultato diretto di difetti di apoptosi, con conseguente alterazione tra il bilancio delle cellule e la loro morte, questo ha grande importanza dal momento che la risposta alle terapie neoplastiche come la chemioterapia dipende dalla tendenza all’apoptosi delle cellule, ha anche implicazioni terapeutiche.

Un difetto di apoptosi svolge un ruolo nella patogenesi delle neoplasie per diversi fattori:

• Riduzione di citochine che promuovono l’apoptosi o che promuovono la sopravvivenza
• Possibile "down regolazione" dei recettori di morte
• Sovraespressione di geni anti-apoptotici (Bcl-2, survivina)
• Difetti nel segnale apoptotico
• Mutazioni di geni apoptosi-correlati (p53 o caspasi)
• Incontrollata degradazione di proteine da parte del proteasoma

Ruolo della proteina p53

La proteina p53 ha un ruolo cruciale nell’induzione dell’apoptosi. La p53 è un oncosoppressore che mediante attivazione trascrizionale del gene p21 causa l’arresto nelle fasi g1 e g2 del ciclo cellulare di cellule esposte ad agenti che danneggiano il DNA, rivestendo una funzione critica nel preservare l’identità del genoma in risposta a trattamenti con fattori citotossici, è un potente induttore della morte programmatica in cellule con DNA danneggiato.

È il gene più frequentemente mutato nelle neoplasie umane, circa il 50% presentano la mutazione di questo gene.

Survivina e apoptosi

La survivina appartiene alla famiglia delle proteine IAP che inibiscono l’apoptosi, è importante per la divisione cellulare, si lega ai microtubuli del fuso mitotico e consente la formazione della piastra equatoriale, la sua espressione è correlata al ciclo cellulare, è più elevata nelle fasi g2 ed M, l’espressione di survivina è elevata in tessuti fetali ed embrionali, la sua espressione che è bassa nei tessuti normali aumenta in varie neoplasie umane.

Alcuni studi hanno dimostrato in vari tumori come quelli del colon o ovaio la sua espressione condiziona una prognosi favorevole.

Tecniche di studio dell'apoptosi

L’espressione della survivina è stata studiata con una tecnica di immunofosfatasi alcalina in pazienti normali completamente negativi, si possono notare nuclei colorati con ematossilina ma sia il nucleo che il citoplasma sono completamente negativi, non esprimono la proteina. La sua espressione aumenta nelle sindromi mielodisplastiche e nelle leucemie acute, dove si nota una positività intensa.

Patogenesi delle neoplasie

Per la patogenesi delle neoplasie si ritiene che in fasi iniziali vi sia un aumento sia degli eventi proliferativi che apoptotici, intervengono mutazioni geniche che portano a una riduzione dell’apoptosi e un prevalere della proliferazione cellulare, subentrano nuove alterazioni genetiche che portano all’acquisizione da parte della neoplasia di caratteristiche di invasività con la formazione di metastasi a distanza.

Approcci terapeutici

Gli approcci terapeutici alla diregolazione apoptotica sono:

• Utilizzo di oligonucleotidi anti-senso che inibiscono l’RNA di proteine anti apoptotiche come Bcl-2 o survivina
• Utilizzo di ligandi per i recettori di morte
• Utilizzo di inibitori delle Caspasi
• Uso di terapia genica come up-regolazione ovvero aumento di espressione di elementi pro apoptotici della famiglia di Bcl-2
• Utilizzo di inibitori degli inibitori dell’apoptosi, inibitori delle proteine IAP
• Inibitori del proteasoma (risultati più importanti soprattutto nel mieloma multiplo, una neoplasia delle plasmacellule ovvero che producono anticorpi)

Percentuale delle cellule apoptotiche

La percentuale delle cellule apoptotiche in una popolazione cellulare può essere effettuata tramite:

• Fattori morfologici: microscopia ottica, elettronica
• Fattori biochimici: elettroforesi, elettroforesi a campi pulsanti
• Fattori istochimici: TUNEL
• Citometria a flusso: ipodiploidia, permeabilità a coloranti, frammentazione del DNA
• Western blotting: caspasi

Tecniche di evidenziazione

Una delle tecniche più utilizzate è l’evidenziazione della fosfatidilserina mediante tecniche citofluorimetriche con coniugati dell’annessina V. L’annessina V ha una notevole affinità con la fosfatidilserina che si trova sulla superficie delle cellule apoptotiche e quindi, se si utilizza un annessina V marcata con un fluorocromo si può, incubando le cellule apoptotiche con l’annessina V fluorescinata, valutare l’acquisizione di fluorescenza da parte delle cellule apoptotiche mediante un citofluorimetro e contare il numero sulla percentuale delle cellule apoptotiche in una determinata sospensione cellulare.

La citofluorimetria a flusso permette di analizzare molteplici parametri in cellule che sono precedentemente marcate con sonde fluorescenti, in questo caso è stato usato un colorante fluorescente per il DNA quindi mediante l’analisi citofluorimetrica è stato possibile il contenuto di DNA ed evidenziare un picco ipodiploide corrispondente alle cellule apoptotiche che hanno un contenuto di DNA inferiore rispetto alle cellule normali.

Metodo TUNEL

La metodica TUNEL consiste nell’incubare un preparato istologico o citologico con oligonucleotidi fluorescenati in presenza dell’enzima TdT, se vi è frammentazione del DNA gli oligonucleotidi fluorescenati vengono incorporati tramite la TdT nel DNA frammentato e quindi la fluorescenza del DNA può essere valutata tramite un microscopio a fluorescenza o con un microscopio ottico se il preparato viene incubato con un anticorpo anti fluorescenina coniugato con un enzima come la fosfatasi alcalina.

Autofagia

L’autofagia è un processo degradativo in cui il materiale citoplasmatico da degradare viene portato ai lisosomi per la distruzione da parte degli enzimi lisosomiali. È controllato e comprende tre diverse fasi: induzione, esecuzione e maturazione. E avviene sempre in condizioni fisiologiche, i suoi livelli possono essere ridotti o aumentati. L’autofagia può essere inibita da condizioni di stress. Dall’1 al 5% delle proteine cellulari vengono catabolizzati tramite autofagia nel fegato da condizioni basali. La macroautofagia gli organuli citoplasmatici o le molecole da degradare vengono avvolte dalla membrana citoplasmatica.