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Tecniche in anatomia patologica

Introduzione all'anatomia patologica

L'anatomia patologica è una branca specialistica della medicina che studia le malattie umane mediante l’esame morfologico macro-microscopico e molecolare degli organi, dei tessuti e delle singole cellule. Questa branca si è sviluppata con l’analisi visiva, prima macroscopica e poi microscopica grazie a microscopi. Accanto all’esame morfologico si è sviluppato negli ultimi 30 anni l’esame molecolare di tutto ciò che viene prelevato dal corpo umano, permettendo l’analisi a livello della singola cellula. Posso distinguere ciò che accade in cellule normali e nelle cellule patologiche in cui si ha un’alterazione.

L’esame microscopico è uno strumento insostituibile. Con l’introduzione dell'anatomia digitale si sta passando ad anatomia patologica su immagini digitalizzate che consentono potenziamenti che non possono essere fatti semplicemente dall’immagine al microscopio.

Importanza dell'indagine anatomopatologica

L’indagine anatomopatologica consente di distinguere cellule e tessuti normali da quelli in cui si sia sviluppata un’alterazione valutabile morfologicamente, qualunque essa sia: infiammatoria, neoplastica, dismetabolica o regressiva. Se le lesioni indotte da una malattia sono caratteristiche, il loro riscontro comporta la diagnosi di malattia, risultato di un ragionamento logico che deve mettere insieme informazioni desunte con la vista.

La diagnosi anatomopatologica non è fatta da una macchina o è una procedura di laboratorio, ma è fatta da un essere umano come frutto di un “ragionamento” deduttivo/induttivo. La diagnosi di malattia è un processo complesso.

Anatomia patologica e medicina di laboratorio

L’anatomia patologica fa parte delle medicine di laboratorio, intesa come reparto ha un laboratorio in cui sono gestite le componenti che consentono di arrivare alla diagnosi; la diagnosi è sempre frutto di un ragionamento e necessita di mettere insieme informazioni. Gli strumenti dell’intelligenza artificiale riducono la soggettività di interpretazione che porta alla variabilità del risultato a seconda dell’osservatore. L'intelligenza artificiale ha accesso a tutto lo scibile.

La diagnosi non è equiparabile a un test di laboratorio; prende in considerazione varie condizioni. Ad esempio, l’iperglicemia non vuol dire diabete, la glicemia può variare per vari motivi, l’iperuricemia non è gotta, la presenza di germi non vuol dire malattie infettive. Il patologo utilizza strumenti diversi che possono essere chiamati biomarcatori; mettendo insieme i biomarcatori si arriva alla diagnosi patologica di malattia.

Richiesta esame

Bisogna partire da una richiesta: istanza inviata a un reparto di anatomia patologica in cui si chiede analisi di un campione tissutale prelevato dal corpo umano. Eliminare campioni tissutali o citologici senza adeguata analisi si può tradurre in mancata diagnosi che può avere implicazioni importanti, come un non trattamento adeguato, se la malattia maligna si presenta a distanza di tempo.

Deve essere esplicitato il tipo di materiale, il motivo della richiesta, informazioni cliniche per capire come procedere nel percorso diagnostico. Sulla domanda ci sono dati del paziente, il tipo di materiale inviato con la sua descrizione e dopo la diagnosi che è il risultato del percorso e che porta all'identificazione di una malattia precisa.

Diagnosi anatomopatologica nel contesto clinico

La diagnosi anatomopatologica è usata in ambito clinico ed è una consulenza medica comunicata; consulenza che si chiede a uno specialista. Le diagnosi AP sono importanti: il 95% delle decisioni prese in ambito clinico sono basate su una diagnosi AP. Per procedere con l’opportuna terapia bisogna sapere di cosa si tratta. La diagnosi AP consente di avvicinarci alla malattia nel paziente.

Bisogna organizzare bene il percorso tra richiesta e diagnosi per rendere tracciabili e rintracciabili tutti gli eventi nel laboratorio, dall’accettazione del campione a tutte le fasi successive che hanno una successione spazio-temporale precise, fino ad arrivare alla diagnosi. La tracciabilità consente di avere rintracciabilità: recuperare lo step lavorativo a cui si è giunti. Una volta era tutto fatto manualmente usando dei registri che erano compilati e consultati manualmente. Adesso si usano strumenti che vanno nella logica della patologia digitale; si usano codici a barre in maniera tale da ottenere la possibilità di rintracciare e recuperare tutti gli step lavorativi che il campione subisce nel laboratorio; vanno a contrassegnare richieste e vetrini man mano che sono prodotti ed elaborati; se voglio recuperare informazioni riesco a farlo. Questo è uno standard minimo per l’accreditamento del laboratorio di AP. Esistono disposizioni a livello regionale che sono rese obbligatorie per i laboratori del SSN, esistono laboratori che agiscono al di fuori del SSN ma vengono controllati per avere gli stessi standard di qualità.

Tipologie di esami

• Esami citologici
• Esami istologici: differiscono in base alle modalità di prelievo
• Esami complessi:
  • Combinazione di esami citologici ed istologici
  • Esami estemporanei o intraoperatori: esami fatti mentre il paziente dorme in un intervento chirurgico perché è necessaria una diagnosi rapida per gestire correttamente la strategia chirurgica
  • Esame post mortem suddiviso in:
    • Riscontro diagnostico
    • Autopsia

Esame citologico (3-24h)

Esame diagnostico effettuato su un campione citologico. Un campione citologico è un insieme di cellule che sono disaggregate rispetto allo status natio in cui si trovavano nel tessuto, viene meno l'architettura originaria del tessuto/organo.

Sulla base di come vengono ottenute le cellule sono distinti in:

• Citologia esfoliativa: cellule ottenute per esfoliazione spontanea o provocata (grattando delicatamente la superficie dell’organo) o una combinazione di spazzolamento ed esfoliazione spontanea come si evidenzia nel pap test in cui le cellule sono raccolte a partire dalla cervice uterina
• Citologia agoaspirativa (FNAB/FNAC): c’è un ago inserito in una lesione che può essere un nodulo palpabile superficiale identificato con tecniche manuali oppure un nodo non palpabile profondo, uso tecniche di centratura basate su ecografia e TAC. Per capillarità usando una depressione ottenuta con lo stantuffo della siringa sono prelevate delle cellule. La siringa serve solo a creare la depressione, le cellule rimangono nell’ago e non vanno nel cilindro della siringa.

Ho marcatori di tipo citologico che mi permettono di riconoscere la cellula. Per esempio, nella citologia agoaspirativa ho:

• C1: insufficiente o inadeguato
• C2: negativo
• C3: dubbio probabilmente benigno
• C4: probabilmente maligno
• C5: maligno

Negli ultimi anni si è sviluppata la citologia in fase liquida; sospendo le cellule, indipendentemente dalla citologia usata per il prelievo, in un liquido e usando delle macchine particolari posiziono le cellule in un monostrato in un vetrino in maniera tale da allontanare ciò che può inficiare la validazione diagnostica, ottenendo un monostrato in una zona limitata del vetrino, con maggiore facilità di lettura.

Un'altra tecnica è il citoincluso; cellule inglobate in blocco di paraffina. Prima uso una sostanza che blocca le cellule in un qualcosa che consente di tenerle raggruppate, successivamente la matrice viene fissata e inclusa in paraffina in modo da avere il citoincluso. Una sostanza che si presta bene è l’agar; gelifica a temperatura ambiente e si scioglie a temperatura compatibile con le cellule senza coagulare. Posso inglobare le cellule in agar, che viene poi gestito come se fosse un campione istologico, in questo modo ottengo tante sezioni istologiche a partire dal blocchetto di paraffina. Faccio il prelievo, trasferisco le cellule in liquido, centrifugo e ottengo pellet che fisso per evitare che le cellule si degradino; uso fissativo per bloccare i meccanismi di autolisi, poi aggiungo agar fluido che ha una temperatura di 55-60°C, le cellule sono fissate e non si cuociono, aspetto che l’agar solidifichi, stacco il fondo dalla falcon, taglio con bisturi in fettine, le metto in una cassetta di inclusione e le tratto come se fossero delle biopsie; sono cellule disaggregate all’interno di una matrice, quando l'agar è sciolto viene sostituito da paraffina, le cellule rimangono all'interno del blocchetto di partenza. Le fettine si prestano bene ad esame istologico, immunoistochimico e molecolare sul DNA e RNA e microscopio elettronico.

Esami istologici (24-48h)

Comprendono l’asportazione di un frammento tissutale dal corpo umano:

• Biopsia incisionale o escissionale: in base al fatto che venga asportata una parte o tutta la lesione. Una biopsia è escissionale se prelevo tutta la cute lesa ad esempio, mentre è incisionale se ne prelevo solo una parte. Nell’ambito delle biopsie incisionali si possono usare piccoli cilindri che hanno una parte tagliente che consente di ottenere biopsie punch, ovvero dei cilindretti tissutali in cui vedo epidermide e derma, si prestano bene alle malattie della pelle non oncologiche.
• Biopsia endoscopica: uso uno strumento inserito in cavità del corpo umano come intestino o vie respiratorie.
• Biopsia con ago: ago di calibro superiore a quello della citologia, consente di ottenere un dettaglio ancora presente anche se inferiore rispetto a quello ottenuto con biopsia endoscopia o escissionale. Ci sono indicazioni cliniche precise. È un prelievo carotiforme tissutale che esiste per arrivare a diagnosi, riesco ad ottenere informazioni da cui parte la terapia per il paziente.

Esami complessi

Esame intraoperatorio o estemporaneo

Devo ottenere una diagnosi in un tempo breve, 15-20 minuti, conformandomi alle esigenze cliniche. Serve un certo periodo di tempo per l’allestimento del preparato; devo comprimere i tempi di allestimento per avere una risposta in tempo breve compatibile con l’attività chirurgica mentre il paziente è sotto anestesia. L'esame può essere sia citologico sia istologico, nella maggior parte è istologico.

Bisogna mettere in piedi procedure di allestimento del preparato abbastanza rapide da consentire di avere la diagnosi in 15 minuti. Per un preparato istologico bisogna fare sezioni istologiche che solitamente sono tagliate quando il campione è duro, ma in questo caso non ottengo indurimento con tecniche tradizionali; indurisco con congelamento che avviene in pochi minuti. Il criostato è sia frigo sia microtomo; camera che mantiene la temperatura bassa che garantisce solamente e successivo taglio nelle sezioni. Posso usare azoto che congela più velocemente, ma si creano bolle nel citosol che rischiano di rompere le cellule. Uso poi una matrice che consente di avere sezioni che sono tagliate e poi analizzate.

Viene usato per:

• Stabilire presenza e natura di una lesione inaspettata con le tecniche di imaging prechirurgico
• Controllare margini di resezione chirurgica
• Stabilire la natura di una lesione; stabilire l’adeguatezza diagnostica di un campione

Lo scopo principale è guidare l’intervento chirurgico.

Esami post mortem (più di 48h)

È diviso in due categorie; sono la stessa cosa ma con intendimenti e persone che eseguono l'esame diversi.

Riscontro diagnostico

Esame sul cadavere con finalità clinico-scientifiche; accerta le cause della morte, va a riscontrare tutte le alterazioni a livello dei vari organi in modo da contestualizzare le cause della morte; epicrisi: ricostruzione della cronologia della morte. Il patologo identifica alterazioni a carico dei vari organi e le mette in fila da quella che ritiene essere la causa del decesso a tutte le altre condizioni che sono concausa o fanno parte della storia patologica del soggetto. Serve per controllare ad esempio l’effetto delle terapie. È svolta dal patologo.

Autopsia

È svolta dal medico legale, ha finalità giuridico-forense, serve a fare una datazione della morte e a stabilire le cause di morte. È una procedura antica.

Allestimento campioni

Allestimento campione citologico

Le cellule devono essere messe su un supporto rigido, vetrino portaoggetto, dopo devo fissarle, fondamentale per evitare che vengano attivati meccanismi di autolisi post mortale, se non ho un fissativo posso asciugare il vetrino agitando nell’aria in modo da togliere l’acqua necessaria alle idrolasi che degradano, devo evitare artefatti dell’essiccamento, devo fissare il più presto possibile. Su materiale ottengo una migliore morfologia e migliore diagnosi.

La colorazione standard è la colorazione di papanicolau; voleva ottenere una colorazione trasparente. Sono presenti:

• Ematossilina di Harris: colorante nucleare per gli AN
• Miscela EA: colora il citoplasma, contiene soluzione policroma di eosina, bruno bismarck e verde luce che sono combinati in modo differente; EA50 per preparati ginecologici ed EA65 per preparati non ginecologici. Colorano i citoplasma in maniera variabile, da blu a verde.
• Orange G6: colora cellule cheratinizzate non colorate dalla miscela EA. Grazie a OG6 si riconoscono cellule che non cheratinizzano, ma sono squamose da cellule squamose cheratinizzanti; distingue diversi stati di maturazione delle cellule squamose.

Questa colorazione è stata elaborata appositamente per il PAP test, finalizzata alle cellule della cervice uterina. È la colorazione di base per tutti i preparati citologici. Consente di vedere le cellule che stanno dietro.

Per preparati ematologici (striscio di sangue periferico o preparati midollari) non si utilizza la colorazione di Papanicolau perché ho la necessità di identificare tutti i granuli nei leucociti; a seconda del tipo di granulo identificare un tipo di leucocita. Si utilizza la colorazione May-Grunwald-Giemsa. Abbiamo effetto romanowsky - giemsa; colorazione metacromatica differenziale; un determinato bersaglio colorato si colora in modo diverso rispetto al colore del colorante. Contiene:

• Colorazione May-Grunwald: colorante primario; è una miscela di eosina y (anionica) e blu di metilene (cationico), vanno a colorare il nucleo
• Colorazione Giemsa: colorante secondario; è una miscela di eosina y (anionica), Azur B ed eosinato di blu di metilene

Allestimento campione istologico

I passaggi sono:

• Riduzione - inclusione
• Fissazione - taglio e colorazione
• Processazione - esame microscopico

Le tecniche istologiche iniziano con il campionamento; fase medica in cui prelevo il campione e lo rendo disponibile per le fasi successive che mi consentiranno di ottenere la sezione istologica. Devo ottenere pezzettini di dimensioni sufficienti perché possano essere gestiti nelle fasi successive e possono essere contenuti in un vetrino portaoggetto che ha dimensioni standard.

La fase iniziale è la fissazione che serve ad evitare fenomeni degradativi autolitici post mortali. Una cellula fissata è una cellula morta, ma è morfologicamente preservata e in condizioni ottimali; morta ma non necrotica. Il fissativo maggiormente usato è soluzione al 4% di aldeide formica, si usano soluzioni acquose sovrasature al 40%, poi faccio diluizione 1:10 per avere concentrazione d’uso.

Esistono altri fissativi come:

• Fissativi coagulanti: determinano la coagulazione delle proteine che è un cambiamento dello stato di solubilità con cui ottengo un allontanamento dell’acqua, le pp mantengono la conformazione nativa. Con la denaturazione le pp perdono la conformazione nativa. L’etanolo ad esempio allontana l’acqua e le pp sono più in grado di stare in una soluzione di sol ma in gel. Non abbiamo una modifica della biochimica ma della solubilità
• Combinazioni
• Fissativi che formano cross link: l’aldeide formica crea crosslink, è un fissativo che interagisce chimicamente modificando la biochimica della pp; si consuma e devo aggiungere nel tempo fissativo se voglio mantenere l'attività. Vari aa interagiscono chimicamente con l’aldeide formica attraverso una serie di step successivi che portano alla formazioni di ponti metilici tra radicali di aa adiacenti; si formano legami forti covalenti che mascherano i siti antigenici, modificano la conformazione della pp che non è più nella confezione nativa ma è in conformazione diversa. Il composto interagendo viene consumato, la fissazione in formalina è progressiva, il numero di ponti aumenta in funzione del tempo; è necessario un tempo minimo di fissazione in formalina, ha una potere di penetrazione di 1 mm all’ora; ha bisogno di x tempo per raggiungere la profondità dell'organo. A un certo punto devo interrompere la fissazione per evitare un eccesso di fissazione che si realizza dopo che un campione è rimasto 76-92 a bagno con formalina. Dopo la fissazione con formalina ottengo un campione di consistenza aumentata

L’aumento di consistenza ottenuto con la fissazione non è sufficiente ad ottenere sezioni istologiche sottili di 2 -3 micron, devo attuare la processazione istologica che consiste nell’inclusione in composto duro per ottenere sezioni istologiche sottili; paraffina o idrocarburi a lunga catena carboniosa solidi a temperatura ambiente, che si liquefanno a temperature accettabili con temperature biologiche e che servono per conferire durezza.

Se devo ottenere sezioni istologiche ancora più sottili come quelle per la microscopia elettronica ovvero nell’ordine di 1/10 di micron in ordine decimo di micron uso composti ancora più duri della paraffina; resine particolari che una volta indurite hanno una consistenza così dura che vanno ad incidere i metalli; lame di diamante che possono tagliare queste resine epossidiche; unico modo per ottenere lo spessore adatto.

Nell'attività di routine non è necessario questo tipo di strumentazione; strumenti che fanno impregnazione in paraffina con modalità automatica usando il fatto che la paraffina è solubile in solventi apolari e il campione è solubile in soluzione acquosa. Si fanno passaggi in scale crescenti alcoliche