Appunti completi Biomolecules structure and functions

ELISA: Metodo di analisi immunologica

Il metodo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) è utilizzato in biochimica per rilevare la presenza di una sostanza utilizzando uno o più anticorpi, di cui uno è legato a un enzima.

Il processo di ELISA avviene in diversi passaggi:

1. L'Anticorpo Primario (Ab) viene collegato ad una matrice solida inerte. Questi anticorpi sono piccole proteine capaci di riconoscere altre proteine.
2. Viene effettuata un'incubazione con una complessa miscela proteica. L'Anticorpo Primario (Ab) riconosce specifiche proteine per quantificarle e legarsi ad esse. Le interazioni che si formano sono deboli e avvengono a pH noto.
3. Successivamente, il sistema viene lavato per rimuovere le proteine non collegate, e viene incubato con anticorpi secondari. L'Anticorpo Secondario (Ab) è caratterizzato da due fattori: un sito di legame per il riconoscimento della proteina e un legame covalente con l'enzima, che causa una reazione di fluorescenza visibile. La luce emessa dall'ELISA kit esprime la dipendenza dalla concentrazione, dove la fluorescenza è

proporzionale alla concentrazione dellaproteina.

4. Determinazione della quantità di Substrato. Si effettua il lavaggio edil dosaggio dell’attività dell’enzima. L’Enzima riconosce il substrato ecatalizza la reazione che genera un prodotto rilevabile da unoSpettrofotometro. La quantità di substrato convertito in prodottoindica la quantità di proteina presente.

Legge di Lambert-Beer

Lo Spettrometro misura l’assorbanza emessa dalla trasformazione del prodotto, catalizzata dall’enzima. Laconcentrazione proteica viene calcolata dell’assorbanza. L’assorbanza si misura con:

A=log (I /I) = ε*c*L in cui: I è l’intensità dell’onda incidenteo oI è l’intensità dell’onda emittenteε è il coefficiente di estinzionec la concentrazione proteicaL la lunghezza del passo ottico.

Purificazione proteica

Dopo l’estrazione proteica si ha una soluzione complessa in cui,

• Ultracentrifugazione: la separazione avviene in base al peso e alla densità e serve a separare la parte solubilizzata da quella non (come i lipidi). L'ultracentrifugazione non è usata per normali soluzioni proteiche, ma per estratti cellulari iniziali, caratterizzati dalla presenza di organelli vari.
• Cromatografia: si intende un vasto numero di tecniche che includono più categorie, in cui la separazione avviene in base a diverse caratteristiche chimico-fisiche. Quello che però le unisce è la compresenza di diverse fasi stazionarie (fase solida simil gel) e mobili (tampone acquoso) all'interno della colonna. Le fasi

Mobili possono attraversare le fasi stazionarie che sono in grado di adsorbire selettivamente i componenti. Le proteine con meno affinità con la fase stazionaria vanno verso il fondo mentre quelle con più affinità interagiscono con la fase stazionaria e vengono rallentate/intrappolate. Nel caso della cromatografia a gas le fasi mobili sono appunto gassose e sono efficienti nel caso in cui si vogliano separare piccole proteine. La fase finale è l'eluizione delle proteine in tempi diversi a seconda della loro forza di interazione con la fase stazionaria a causa della loro carica, della massa molecolare o dell'Idrofobicità (in base al tipo di cromatografia). In questo modo quindi abbiamo frazioni distinte composte da più proteine con le stesse caratteristiche. Nel caso delle proteine si parla di HPLC ovvero cromatografia liquida ad alta pressione (tramite delle pompe) in modo da ottenere le portate più elevate con un tempo di separazione.

minimo.o SEC (cromatografia ad esclusione di taglia): le proteine sono separate in base alla grandezza molecolare tramite l'utilizzo di una fase stazionaria a gel con pori; quelle che hanno una dimensione maggiore si muovono molto velocemente nella colonna perché non interagiscono con la fase stazionaria e formano una prima frazione; quelle con una dimensione minore entrano nei pori e si muovono più lentamente quindi si diffondono e rimangono nei pori della fase stazionaria e vengono eluitati per ultimi nella fase finale.

o IEX (cromatografia a scambio ionico): le proteine sono separate in base al pI (pI<7 anioniche, pI>7 cationiche); le proteine anioniche sono prevalentemente formate da AA acidi mentre quelle cationiche sono formate prevalentemente da AA basici. La separazione avviene grazie all'utilizzo di una fase stazionaria carica positivamente che interagisce con le proteine cationiche che si muovono quindi più lentamente nella colonna; al contrario

le proteine anioniche si muovono più velocemente dato che non interagiscono con la fase stazionaria e quindi sono i primi ad essere eluitati. Quindi le proteine si muovono attraverso la colonna a una velocità che dipende dalla loro carica netta generata dal pH della soluzione usata.

HIC (cromatografia per interazione idrofobica): le proteine sono separate in base all'Idrofobicità. Queste sono in grado di relazionarsi con la fase stazionaria idrofobica attraverso le interazioni idrofobiche (legame debole) e quindi attraverso AAs idrofobici. Quindi proteine con un numero elevato di AAs idrofobici sono in grado di legarsi alla fase stazionaria grazie all'affinità e viceversa. Il principale problema è che gli AAs idrofobici sono presenti nel core della proteina e quindi l'interazione con la fase stazionaria non è favorita; per questo è necessario preparare il campione in modo da spostare gli AAs idrofobici dal core alla superfice.

della proteina. Questo è possibile aumentando la concentrazione di sale (e quindi gli ioni) in quanto, in condizioni fisiologiche, la superficie della proteina è ricoperta di uno strato detto di idratazione che si lega alle molecole d'acqua e favorisce la posizione degli AAs idrofobici nel core e quindi, aumentando gli ioni, queste molecole d'acqua si legano agli ioni stessi liberando la superficie della proteina (riducendo lo strato di idratazione) e favorendo quindi lo spostamento degli AAs idrofobici sulla superficie stessa. Quindi il sale è in grado di ridurre lo strato di idratazione. Infine, per favorire l'eluizione è necessario un eluente con una bassa carica ionica.

RPC (cromatografia a fase inversa): le proteine sono separate in base alle interazioni idrofobiche e permette di isolare le proteine senza cambiare la loro conformazione 3D (come nel caso del HIC). La fase stazionaria è idrofobica ma caratterizzata da gruppi chimici con

catene idrofobiche molto lunghe di C; questi sono capaci di entrare all'interno della struttura proteica fino al core della proteina stessa dove si trovano gli AAs idrofobici.

Durante l'eluizione si va a cambiare la fase mobile aumentando la concentrazione di solvente apolare (alta idrofobicità) usando ad esempio l'acetonitrile (solvente organico).

Questa tecnica è detta reverse phase perché si inizia con una fase mobile polare e si finisce con una fase mobile apolare. È attualmente una delle più usate e più efficienti perché è in grado di preservare la stabilità della proteina.

o AC (cromatografia per affinità): le proteine sono separate in base all'affinità con la fase stazionaria; all'interno di questo gruppo sono presenti differenti tipologie di cromatografia in base alla fase stazionaria scelta (e quindi le proprietà biochimiche). In ogni caso l'eluente deve contenere

preparare le proteine ed è composto da una lunga catena di Cche è utile per interagire con la maggior parte delle proteine presenti nel corpo (è in grado di formare legami H e interazioni idrofobiche) e una carica negativa che permette di conferire una carica negativa alla proteina che ha legato. Anche in questo caso la struttura 3D della proteina è completamente cambiata (denaturazione) ma, avendo una carica negativa, sono attratte al polo positivo che è all'interno del gel (mentre quello negativo è fuori) e quindi la proteina entra nel gel (grazie alla migrazione).

2D elettroforesi: a differenza del 1D (esempio PAGE), la separazione è possibile in due dimensioni ovvero in base a due diverse caratteristiche (più efficiente) che sono il pI e il peso molecolare. Quindi la prima separazione è fatta in base al pI (dipende dal numero di cariche); il campione viene messo in una piccola striscia di gel che può essere diviso