Appunti biochimica, primo semestre

RECETTORI ASSOCIATI A PROTEINE GI

Recettori classificati come recettori a 7 domini transmembrana (7 eliche) sono associati a proteine G eterotrimeriche: subunità α (attiva nella segnalazione, interagisce con adenilato ciclasi), e βγ (proteine scaffold di sostegno). Il nome proteine G indica che queste βγ sono in grado di legare nucleotidi guanosinici. Usano secondi messaggeri. Quando il ligando si lega al recettore, questo cambia conformazione e la variazione si ripercuote sulla proteina G associata. Il complesso ligando-recettore fa da fattore di scambio GDP-GTP → quando è legato GTP la subunità si attiva e si stacca da α β-γ. La subunità si muove nel piano della membrana grazie alla sua ancora lipidica, interagisce con l'adenilato ciclasi che genera cAMPα che attiva PKA. La subunità ha attività GTPasica intrinseca ed è capace di idrolizzare GTP in GDP; nella forma GDP legata,

laαsubunità si riaggancia a e torna inattiva.α β-γEsistono subunità diverse:

• α- stimola adenilato ciclasi
• α-s:- inibisce adenilato ciclasi, utilizzo cAMP in modo negativo. Si distingue in 1, 2 e 3.
• α-i: α-i- ha come bersaglio un enzima legato al signaling mediato da proteina C calcio
• α-q:- α-12Le subunità e non variano molto. Le proteine G sono tantissime, hanno input e output diversi.

Modulazione patologicaLa subunità può essere bersaglio della tossina colerica che ne inibisce l'ADP ribosilazione (modificazione covalente) → inibisceα-sattività GTPasica. La subunità non può seguire il ciclo di spegnimento e rimane sempre attiva (GTP legata). Continua la produzioneαdi cAMP, portando a totale squilibrio nei meccanismi di assorbimento a livello intestinale e generando disidratazione.La tossina della pertosse è in grado di agire sulle

subunità regolatorie dalle subunità catalitiche, attivando così la PKA. La PKA attiva può fosforilare vari bersagli cellulari, tra cui enzimi, canali ionici e fattori di trascrizione, influenzando così diversi processi cellulari. Le tossine del colera e della pertosse agiscono interferendo con la via di signaling del cAMP. La tossina del colera inibisce la GTPasi Gαi, che normalmente inibisce l'adenilato ciclasi, portando così ad un aumento dell'accumulo di cAMP. La tossina della pertosse, invece, inibisce direttamente l'adenilato ciclasi, aumentando anch'essa i livelli di cAMP. La PKA è composta da due subunità regolatorie e due subunità catalitiche. Quando la PKA è inattiva, le subunità regolatorie mantengono il sito catalitico nascosto e quindi inattivo. L'AKAP (A-kinase anchoring protein) è una proteina scaffold che lega le due subunità regolatorie di PKA, permettendo così un'organizzazione spaziale precisa della PKA all'interno della cellula. Quando il cAMP si lega alle subunità regolatorie di PKA, queste si distaccano dalle subunità catalitiche, permettendo l'attivazione della PKA. La PKA attiva può poi fosforilare vari bersagli cellulari, influenzando così diversi processi cellulari. In conclusione, la ribosilazione inibisce lo scambio GDP/GTP, inattivando la subunità αi. Questo porta ad un accumulo di cAMP, che a sua volta attiva la PKA. Le tossine del colera e della pertosse sono state utilizzate nella ricerca per studiare la via di signaling del cAMP. La PKA è composta da subunità regolatorie e catalitiche, e la sua attivazione avviene quando il cAMP si lega alle subunità regolatorie.subunità regolatorie da quelle catalitiche, che possono raggiungere e fosforilare il loro bersaglio. Amplificazione risposta cellulare La concentrazione di molecola segnale in grado di determinare la risposta cellulare è molto bassa rispetto alla risposta perché per tutto il tempo che il segnale rimane legato al recettore, la proteina G continua a ciclare stimolando (o inibendo) l'adenilato ciclasi più volte. cAMP continua ad essere prodotto e attiva PKA; PKA è in grado di fosforilare un numero elevatissimo di proteine. Spegnimento segnale Un sistema di segnalazione efficace deve avere meccanismi di terminazione del segnale (switch off). La diminuzione della concentrazione di ligando nell'ambiente extracellulare provoca la dissociazione ligando-recettore e lo spegnimento di quest'ultimo. Le proteine G sono in grado di disattivarsi grazie all'attività GTPasica intrinseca della subunità α. Anche se spengo il recettore, ilil suo ambiente interno attraverso la formazione di diverse strutture cellulari specializzate. Questa compartimentazione consente alla cellula di separare e coordinare diverse funzioni cellulari. Una delle strutture cellulari più importanti è il nucleo, che contiene il materiale genetico della cellula, come il DNA. Il nucleo è circondato da una membrana nucleare che separa il suo contenuto dal citoplasma. Il citoplasma è la regione all'interno della cellula che si trova tra la membrana plasmatica e il nucleo. È composto da un gel chiamato citosol, che contiene varie molecole e organelli cellulari. Gli organelli cellulari sono strutture specializzate all'interno del citoplasma che svolgono funzioni specifiche. Alcuni esempi di organelli includono il reticolo endoplasmatico, l'apparato del Golgi, le mitocondri e i lisosomi. Il reticolo endoplasmatico è una rete di tubi e sacchetti membranosi che si estende in tutto il citoplasma. Esistono due tipi di reticolo endoplasmatico: il reticolo endoplasmatico ruvido (RER), che è ricoperto di ribosomi e svolge un ruolo nella sintesi delle proteine, e il reticolo endoplasmatico liscio (REL), che è coinvolto nella sintesi dei lipidi e nella detossificazione delle sostanze nocive. L'apparato del Golgi è un sistema di sacchetti membranosi appiattiti che si trova vicino al nucleo. Svolge un ruolo nella modifica, nell'ordinamento e nel trasporto delle proteine prodotte dal RER. I mitocondri sono gli organelli responsabili della produzione di energia nella cellula. Sono circondati da una doppia membrana e contengono una serie di reazioni chimiche che convertono i nutrienti in energia utilizzabile. I lisosomi sono sacche membranose che contengono enzimi digestivi. Svolgono un ruolo nella digestione e nel riciclaggio dei materiali cellulari. Oltre a questi organelli, ci sono anche altre strutture cellulari come i perossisomi, i microtubuli e i filamenti di actina che svolgono funzioni specifiche all'interno della cellula. In conclusione, la compartimentazione cellulare è essenziale per il corretto funzionamento della cellula. Le diverse strutture cellulari lavorano insieme per svolgere le varie funzioni cellulari e mantenere l'omeostasi all'interno della cellula.

Il sistema di signaling. Nello schema riportato, la proteina piattaforma AKAP5 lega PKA e PP2A (fosfatasi) alla membrana. PKA e PP2A lavorano in questo caso solo su quella precisa proteina bersaglio.

Guanilato ciclasi: Recettore con un dominio transmembrana con attività catalitica che genera un secondo messaggero, il dominio citoplasmatico è un dominio con attività guanilato ciclasi -> usa GTP al posto di ATP come substrato e forma cGMP che attiva il pathway delle proteine chinasi G.

FOSFOLIPASI C: Le fosfolipasi C sono una famiglia di isoenzimi, tra cui i primi due possono catalizzare la stessa reazione ma hanno β, γ, δ meccanismi di attivazione completamente diversi.

La subunità di una proteina G associata ad un recettore a sette domini transmembrana attiva la fosfolipasi C che genera inositolo αβtrifosfato (IP3, frammento idrosolubile) e DAG (diacil glicerolo, frammento di membrana) a partire da PIP3.

La fosfolipasi C viene attivata

Attraverso l'attivazione di un recettore a un dominio transmembrana con attività tirosin-chinasica, si attiva l'attività tirosin-chinasica per dimerizzazione dei recettori (transfosforilazione) e consiste nella produzione di regioni ricche in fosfotirosina, complementari a un dominio presente sulla fosfolipasi C detto dominio SH2. L'interazione fosfotirosina-dominio γ,SH2 attiva la fosfolipasi C che scinde PIP e genera IP e DAG. IP e DAG possono lavorare sia in modo sinergico sia disgiunto.

IP non ha proteina bersaglio diretta, ma è in grado di aumentare la concentrazione di calcio. IP si lega a canali calcio presenti sul reticolo consentendone l'apertura. Il calcio collabora con il DAG per l'attivazione di protein chinasi C (PKC) e attiva chinasicalcio-dipendenti.

PKC, DAG e calcio collaborano sulla conformazione di PKC e sulla sua associazione alla membrana. In PKC ci sono un dominio pseudo-substrato, tre domini C (C1A, C1B)

E C2) e un dominio chinasico. Esistono 7 tipologie di PKC, tutte con i medesimi dominima in ordine diverso. PKC inattiva è citoplasmatica e lo pseudo-substrato maschera il dominio chinasico. I domini C1A e C1Briconoscono e si associano a DAG in membrana; una volta è legata alla membrana espone il dominio C2, che si lega agli ioni calcioancorati alla membrana attraverso residui di fosfatidilserina. La conformazione della proteina è ora forzata, lo pseudo-substrato sistacca e smaschera il sito attivo.

PKC-α è attiva solo se associata alla membrana attraverso DAG e calcio, ha bisogno di entrambi.

Protein chinasi calcio dipendenti

I sistemi alla base dell'aumento della concentrazione di calcio citoplasmatico sono:

• Canali calcio sulla membrana, flusso secondo gradiente
• Canali calcio su zona specializzata del reticolo endoplasmatico →rilascio IP mediato

Il sistema di sequestro ioni calcio è rappresentato da trasportatori attivi

calcio-ATPasi. Esiste un sistema che amplifica il segnale del calcio rappresentato dalla calmodulina; questa subisce un cambio conformazionale nel momento in cui lega 4 ioni calcio. Il complesso calmodulina-calcio interagisce con la calcio calmodulina chinasi che fosforila numerose proteine. Tutte le PKA, PKC, e calcio-calmoduline chinasi appartengono alla classe delle serina treonina-chinasi. Serina e treonina sono identificate sulla base di sequenze consensus per il residuo di fosforilazione, hanno un intorno costituito da particolari aa riconoscibile dalle chinasi. Non tutte le serine-treonine hanno le stesse sequenze consensus e vengono quindi fosforilate da diverse chinasi. La fosforilazione combinatoria porta ad un'attività maggiore delle singole fosforilazioni -> identifico una gerarchia di fosforilazione. 17 RECETTORI TIROSIN CHINASI CII recettori a un dominio transmembrana nella maggior parte sono recettori tirosin chinasi, possiedono un'attività.del recettore è un processo fondamentale per l'attivazione della sua attività enzimatica intrinseca. Diverse strategie possono essere utilizzate per generare la dimerizzazione del recettore: 1. Nel primo caso, due proteine distinte interagiscono con il ligando. Questa interazione provoca una modifica nella conformazione delle proteine, che si muovono nella membrana e si dimerizzano. 2. Nel secondo caso, il recettore è una singola proteina che mantiene le sue caratteristiche strutturali. Questo recettore presenta due eliche distinte, due domini extracellulari e due domini citoplasmatici distinti. Tuttavia, la catena e i domini extracellulari sono tenuti insieme da legami covalenti di ponte disolfuro. Strutturalmente, il recettore è un'unica proteina, ma ha le caratteristiche di due comparti. Il legame del ligando determina la dimerizzazione funzionale del dominio citoplasmatico. Un esempio di questo tipo di recettore è il recettore dell'insulina. 3. Nel terzo caso, due proteine distinte si legano a un ligando dimerico che richiede l'interazione con entrambe le proteine contemporaneamente per indurre la dimerizzazione. Queste strategie di dimerizzazione del recettore sono fondamentali per l'attivazione dell'attività enzimatica intrinseca del recettore e per la trasduzione del segnale cellulare.Il dominio citoplasmatico serve a generare risposta in termini di transfosforilazione del dominio citoplasmatico (A→B). Questo ha un ruolo determinante nel descrivere il fenomeno come attivabile: se A potesse fosforilare se stesso lo farebbe di continuo e la fosforilazione non sarebbe regolabile, la fosforilazione è il punto iniziale della trasduzione del segnale che quindi deve essere acceso e spento. RECETTORE INSULINA Regolazione espressione genica A livello del dominio citoplasmatico c'è un'ansa con tirosine (3) non fosforilate nello stato non attivo del recettore. Una volta fosforilato per transfosforilazione, l'ansa viene scomplessa → il gruppo OH della tirosina fosforilata è molto più acido e per stabilizzarsi porta a esclusione dell'ansa. Questa esclusione determina la modificazione conformazionale del recettore, che permette l'associazione al dominio tirosin chinasico di un substrato: IRS1 (Insuline).rmattato come IRS1. La fosforilazione di IRS1 è un evento chiave nella segnalazione dell'insulina e di altri fattori di crescita. Una volta fosforilato, IRS1 funge da piattaforma di ancoraggio per diverse proteine ​​che contengono domini SH2, come la fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) e il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF). Queste proteine ​​si legano a IRS1 tramite i loro domini SH2 e attivano ulteriori vie di segnalazione che promuovono la crescita cellulare e il metabolismo del glucosio. La fosforilazione di IRS1 può essere regolata da diverse chinasi, tra cui la tirosin-chinasi dell'insulina (IRTK) e la tirosin-chinasi del recettore dell'EGF (EGFR). Inoltre, IRS1 può essere degradato tramite ubiquitinazione e proteolisi, che può essere regolata da diverse proteine ​​come la proteina chinasi B (PKB) e la proteina chinasi C (PKC). La regolazione della fosforilazione e della degradazione di IRS1 è fondamentale per il corretto funzionamento della segnalazione dell'insulina e per il mantenimento dell'omeostasi del glucosio nel corpo.