Appunti - Biochimica (modulo 2)

ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DEL DNA

La PCR deve avere fattori di amplificazione esponenziali; deve essere ragionevolmente specifica e capace di

enormi sensibilità. E, infine, richiede primer specifici e DNA di buona qualità e sufficientemente puro.

Quando si svolge la tecnica PCR su del DNA estratto da un alimento, è importante verificare che il DNA

contenuto in esso sia sufficientemente puro e integro per venire amplificato dalla DNA-polimerasi. Nei processi

alimentari il DNA potrebbe però:

a. subire trattamenti che lo degradano, rendendolo non analizzabile;

b. subire trattamenti che eliminino ogni sua traccia;

c. essere co-purificato con una serie di molecole inibitori della DNA-polimerasi.

Queste 3 casistiche di problemi allontanano il DNA dall’essere integro e purificato quindi diventa necessario,

nell’ambito alimentare, effettuare sempre dei controlli per escludere dei falsi negativi.

La verifica dell’integrità del DNA viene fatto attraverso un controllo positivo. Quando si ottiene un risultato

negativo, per verificare la sua validità, vengono ricercate con la PCR delle sequenze geniche sicuramente

presenti nel campione:

 risultato positivo: il campione ricercato si amplifica, allora il primo risultato è un vero negativo, quindi

il DNA è integro e puro; a questo punto si può dunque procedere per la ricerca di altre sequenze

genetiche che l’alimento potrebbe potenzialmente contenere.

 risultato negativo: il campione ricercato non si amplifica, allora il primo risultato è un falso negativo

e il DNA potrebbe essere degradato o con presenza di inibenti. Dunque, il risultato negativo può

essere considerato un vero negativo solo in presenza di una corretta amplificazione del controllo

positivo, ovvero di una sequenza di DNA sicuramente presente; per questo motivo si effettua un

controllo positivo. 21

*Lezione 27 - Mer 11/01/23 - Slide 06

Elettroforesi

Nel momento in cui voglio definire se una proteina è fatta di latte di bufala o altro, devo separare le molecole

che la compongono e, in base alle loro caratteristiche, traggo informazioni sulla proteina e quindi sul prodotto.

Questo è possibile grazie a due tecniche diverse: elettroforetiche oppure cromatografiche, per sapere quale

utilizzare è necessario conoscere come si differenziano le proteine.

Le proteine si differenziano grazie a diverse proprietà:

- dimensione e forma: peso molecolare;

- punto isoelettrico: ogni proteina ha il proprio punto isoelettrico,



corrispondente al pH che ha carica netta nulla pH < pI = +

 pH > pI = -

- carica: la quale è variabile perché dipende dal suo punto isoelettrico e

dal pH del mezzo in cui si trova, per questo motivo non è una costante.

L’elettroforesi prevede la migrazione delle proteine attraverso un mezzo fluido, ovvero un gel, e sotto l’impulso

di un campo elettrico di particelle, proteine o altre molecole, dotate di carica. Questa tecnica permette di

separare le diverse proteine in base a loro proprietà chimico-fisiche specifiche, mediante la loro migrazione in

un campo elettrico con velocità differenti.

Il gel è una struttura semisolida che trattiene acqua idratata, esso è formato da polimeri che formano una

matrice, cioè una rete tridimensionale, che trattiene acqua in quanto possiede polimeri idrofilici. Se il mezzo

fosse liquido, e non fluido, sarebbe incontrollabile in quanto il passaggio sarebbe troppo veloce.

Quando la proteina viene messa in un gel e viene applicato un campo elettrico, agiscono diverse forze. Il campo

elettrico esercita la forza a cui è sottoposta la particella che dipende dalla carica della proteina e dall’intensità

del campo elettrico.

Alla forza che spinge la particella si oppone una forza frizionale che dipende dalla dimensione della molecola e

dalla sua forma, più sarà grande maggiore sarà la fatica che farà a migrare verso il gel, e dalle dimensioni dei

pori del gel utilizzati. Dunque, più una molecola è carica e piccola, maggiore sarà la velocità con la quale migra

e viceversa nel caso di molecole con carica negativa e di grandi dimensioni.

Sono due i tipi di gel utilizzati in elettroforesi:

 Gel di Agarosio: l’Agarosio è un polimero lineare a base di galattosio. Esso è solubile a caldo e insolubile

a freddo, raffreddando forma un gel reversibile, mentre se viene riscaldato torna ad

essere una soluzione pura, stabilizzata da legami idrogeno tra le diverse catene del

polimero. Avendo però maglie troppo grandi, non viene spesso utilizzato per la

separazione delle proteine, al contrario del gel PAGE che è molto più utilizzato.

 Gel di Policrilammide: viene anche chiamato “PAGE”. L’acrilamide è una molecola tossica quando è in

forma base, una volta polimerizzata perde la sua tossicità. Questa molecola può polimerizzare grazie

a un meccanismo radicalico, che non forma però una rete tridimensionale.

Per legare insieme i diversi polimeri lineari e formare così la rete

tridimensionale, si aggiunge anche la bis-acrilamide, formando così un gel

irreversibile. Questa polimerizzazione è di tipo covalente ecco perché il gel

che si forma è irreversibile e non può essere effettuato il passaggio per

tornare alla forma nativa. Il gel sarà dunque costituito da catene lineari di

acrilamide “cross-linkate” dalle molecole di bis-acrilamide, le sue maglie

sono quindi molto più strette rispetto al gel di Agarosio. 22

 Page-Nativa

La tecnica Page-Nativa è la meno utilizzata poiché è difficile l’identificazione delle

proteine. Essa prevede la separazione di proteine in grado di conservare la loro

struttura nativa e, quindi, l’enzima conserva la sua funzionalità biologica grazie al

mantenimento delle sue strutture quaternarie. Dal nome deduciamo inoltre che,

oltre a conservare la loro struttura nativa, si utilizzerà il gel di Policrilammide. La

separazione avviene principalmente in base alla carica ma anche, in casi minori, in base alla massa.

La carica delle proteine dipende dal loro pI, generalmente neutro-acido, e dal pH del mezzo fluido,

generalmente basico. Il gel presenta due poli: l’anodo, che è positivo e quindi attira anioni negativi, e il catodo,

che è negativo e quindi attira cationi positivi. Le proteine vengono attratte verso l’elettrodo di carica opposta;

generalmente si carica dalla parte del catodo, essendo proteine con carica negativa nella maggior parte dei

casi, e quindi l’anodo viene messo come polo da raggiungere. Le proteine più cariche negativamente e di

dimensione minore migrano più velocemente.

La fine dell’elettroforesi corrisponde al momento in cui il campo elettrico viene fermato prima che le proteine

escano dal gel, perché, se aspettassimo, le proteine si scaricherebbero sul polo opposto. Le proteine in questo

modo si separano, ma rimangono all’interno del gel.

Il limite di questa tecnica è che non siamo sicuri divedere tutte le proteine contenute nel campione perché, le

proteine con carica opposta da quella da noi preimpostata in base alla direzione che vogliamo dargli, verranno

perse. Inoltre, facciamo anche fatica a riconoscerle quando separate a causa delle differenze di forma e

grandezza e non sempre capiamo se hanno corso perché a volte sono molto cariche o molto piccole.

Il vantaggio, allo stesso tempo, sarà la variabilità che si ha nel poter scegliere il verso, utilizzando soluzioni

appropriate e posizionando le proteine nella direzione da noi preferita.

 SDS-Page La SDS-Page è la tecnica più utilizzata che separa in basa alla massa e viene

effettuata su proteine già denaturate in presenza di SDS, Sodio-Dodecil-Solfato.

-

Questo detergente tensioattivo anionico , è una molecola anfipatica caratterizzata

-

da: testa polare idrofilica, caratterizzata dal solfato che forma il sale con il sodio, e

coda apolare idrofobica, avente una coda alifatica con 12 atomi di C. La sua struttura

corrisponde a quella classica del sapone.

L’SDS ha la caratteristica di: denaturare le proteine termicamente, attraverso la rottura di legami deboli (ma non

di quelli forti covalenti) e l’interazione di un riducente, che contribuisce alla rottura di ponti disolfuro, e riuscire

a stabilizzare la forma denaturata delle proteine, che generalmente sono meno solubili di una proteina nativa,

ma con la presenza di SDS diventano solubili seppur denaturate.

Quando l’SDS aderisce, attraverso delle interazioni idrofobiche, con delle regioni idrofobiche delle proteine

che si espongono durante la denaturazione, otteniamo una densità di carica negativa costante, lasciando come

unica variabile la massa che sarà la base per la loro separazione.

Per questo, il numero di cariche negative portate del SDS è molto maggiore delle

cariche della proteina, quindi la proteina ha complessivamente una carica

negativa data solo dall’SDS. Grazie a questo legame le proteine non tenderanno

più a legare con le altre proteine.

Le proteine denaturate termicamente in presenza di SDS, assumono tutte uguale

densità di carica negativa (*A). Tutte le proteine così trattate migrano verso

l’anodo (*B). Le proteine più piccole migrano più velocemente perché vengono

rallentate di meno dalle forze frizionali (*C).

In SDS-PAGE è possibile stimare il peso molecolare di una proteina per confronto con opportuni standard a

peso molecolare noto, separando i marker sul gel al fine di usarli come riferimento. 23

*Lezione 28 - Gio 12/01/23 - Slide 06 pag.15

 Isoelettrofocalizzazione - IEF

L’IEF non separa le proteine in base alla loro carica, ma le separa in funzione del loro punto isoelettrico.

Migrano grazie alla loro carica, ma la loro discriminanti di separazione è il punto isoelettrico.

La separazione avviene in un gel nel quale è stato creato un gradiente di pH, esso non è costante ma varia da



un’estremità all’altra (acido basico). Le proteine migrano fino a che raggiungono la zona di gel nel quale il

pH è uguale al punto isoelettrico della proteina stessa. La proteina si focalizza dunque dove il pH corrisponde

al suo pI.

Separazione campioni



Si utilizzano gel a bassa concentrazione di acrilamide, o di Agarosio, viste le loro maglie

larghe col fine di minimizzare le forze frizionali che agiscono in funzione della dimensione. 

Se la proteina ha un pH > del suo pI, avrà carica negativa e quindi da sx si sposterà verso dx (catodo anodo).

Nel momento in cui arriva a pH = pI, la proteina sarà elettricamente neutra, di conseguenza non viene più

attratta da nessun polo. La proteina si focalizza dunque in quel punto con pH e pI uguali.<