Appunti Biochimica e biologia molecolare - primo parziale

B

fonte principale di energia libera usata dall’enzima per abbassare l’energia di

attivazione della reazione. Interazioni covalenti tra l’enzima ed il substrato (diverse

reazioni chimiche tra i gruppi funzionali del substrato e dell’enzima (catene laterali di

aa, ioni metallici e coenzimi). Queste interazioni non covalenti tra enzima e substrato

diventano ottimali nello stato di transizione. È stata formulata una prima ipotesi, il

modello “chiave-serratura”, diceva che gli enzimi sono strutturalmente complementari

ai loro substrati. Un enzima complementare al suo substrato non sarebbe un buon

enzima. È necessario che l’enzima faccia interazioni con il substrato di transizione e

non con quello normale, per essere ottimale. Lo stato di transizione dura un momento.

L’enzima si deve adattare, il modello della chiave serratura è stato sostituito da quello

dell’adattamento indotto. Le interazioni deboli sono importantissime. La cinetica

enzimatica studia la velocita di una reazione come questa cambi in risposta a

variazioni dei parametri sperimentali. Lo stato pre-stazionario è il primo stato dove il

complesso enzima-substrato aumenta e a un certo momento si stabilizza, quando

l’enzima è completamente saturato. La velocita varia in funzione della concentrazione

del substrato, anche se è difficile da calcolare; dato che varia di continuo,

trasformandosi in prodotti. Si valuta la velocità iniziale, V0, quando [S]>>>P. Velocità

iniziale, V0 = tangente a ciascuna curva che passa per il tempo = 0, studiata come

funzione di [S]. All’inizio della reazione [S] può essere considerata costante perché

solo una piccola percentuale è convertita in prodotto. L’effetto di [S] su

V0: a concentrazioni basse di [S], V0 aumenta in modo lineare con

l’aumento di [S]. A concentrazioni di [S] più

elevate V0 aumenta in misura sempre minore in funzione dell’aumento di [S]. Gli

aumenti di V0 diventano di entità sempre minori. La velocità della reazione si avvicina

alla velocità massima, Vmax. Il complesso ES è la chiave per la comprensione del

comportamento cinetico degli enzimi (l’equazione di Michealis e Menten è da sapere a

memoria). Vmax= velocità massima della reazione a [S] molto elevate, quando

l’enzima è stato saturato dal substrato. Km = costante di Michaelis, concentrazione di

S a cui la velocità è 1⁄2 della velocità max della reazione. Ha le unità di una

concentrazione molare. Km alta, quindi dobbiamo dare tanto substrato, poca affinità

dell’enzima. Le implicazioni fisiologiche della Km possono essere illustrate da questo

esempio riguardante la sensibilità di alcune persone all'etanolo. Alcune con piccole

quantità iniziano a mostrare i primi segni. Questo è dovuto all’alcool deidrogenasi del

fegato che converte l’alcool in acetaldeide e poi in acetato dall’aldeide deidrogenasi.

La maggior parte delle persone ha due forme dell’alcool deidrogenasi, una

mitocondriale (Km bassa) e una citoplasmatica (Km alta). Nell’enzima mitocondriale,

che lavora di più, è meno attivo. Lavorando un solo enzima dei due, si ha un accumulo

di acetaldeide. Si può determinare quantitativamente la Vmax e la Km con equazioni

che convertono la curva in una forma lineare. Questa equazione non è altro che il

reciproco dell’equazione di Michaelis-Merten.

Si otterrà il grafico dei doppi reciproci o di Lineweaver-Burk.

L’intercetta con l’asse X ci rappresenta -1/Km, l’intercetta con l’asse

Y ci dà 1/Vmax. Efficienza catalitica: Kcat/Km costante di specificità,

definisce l’efficienza catalitica di un enzima relativamente ad un

substrato. In reazioni a più substrati due molecole diverse di

substrato si legano all’enzima e partecipano alla reazione, si

distinguono in quelle in cui un gruppo viene trasferito ad un altro o in

red-ox. La formazione di un complesso ternario si ha quando l’enzima

si lega ai due substrati. Possono essere ordinate se seguono una sequenza specifica o

casuale. Anche il rilascio può avvenire in maniera ordinata o casuale.

14/03

Altri enzimi non formano un complessai ternario col substrato ma il primo viene

convertito in prodotto, viene rilasciato e si dissocia, poi successivamente si associa

l’altro substrato. Questo è il meccanismo a doppio spiazzamento. L’enzima subisce

una modificazione della conformazione temporanea a seguito del legame con il primo

substrato ma alla fine l’enzima torna alla conformazione originale.

Nomenclatura di cleland per abbreviare le reazioni con più substrati: il primo substrato

che si lega è A, il secondo B, il terzo C e così via in ordine alfabetico, lo stesso vale per

i prodotti, il primo prodotto che si dissocia è P, poi Q,R,S… e l’enzima è E ma se si

modifica durante le reazioni le forme successive vengono indicate con la lettera F,G…

Trasformazione del piruvato in lattavo nella fermentazione lattica (assenza di O): è una

redox catalizzata dalla lattato deidrogenasi. Cosa succede? Il piruvato è il prodotto

della glicolisi che in questa fermentazione si riduce (C=O —> COH2) prendendo glie

elettroni dal NADH che si ossida a NAD+. È una reazione sequenziale ordinata in cui si

forma un complesso ternario con i due substrati, piruvato e NADH, si lega per primo

con il NADH che viene indicato quindi con la lettera A. Il piruvato è il secondo e si

indica con B e il complesso ternario formato è EAB. Nel sito catalitico avviene la

reazione per trasformare i reagenti in prodotti cioè lattato (P, è il primo ad essere

rilasciato dall’enzima) e NAD+ (Q), quindi il complesso ternario che forma con i

prodotti è EPQ.

Esempio reazione di doppio spiazzamento: qui non si forma complesso ternario ma

prima viene rilasciato un prodotto poi l’enzima si lega al secondo substrato, qui

l’intermedio può essere un enzima modificato.

Gli enzimi sono soggetti a inibizione reversibile o irreversibile cioè possono essere

regolati. Possono essere inibito da inibitori enzimatici cioè molecole (ad esempio

farmaci) che interferiscono con l’attività catalitica di un enzima rallentando la o

bloccandola. Ne esistono due classi di inibitori:

- reversibili: si legano mediante legami non covalenti ma con interazioni deboli

così da potersi dissociate e far recuperare all’enzima l’attività catalitica.

Possono essere di diversi tipi:

competitivi: entra in competizione col substrato per legarsi al sito attivo.

o L’inibitore ha una struttura diversa dal substrato ma comunque simile

quindi può legarsi al sito catalitico. Se aumento concentrazione substrato

riduco l’inibizione

incompetitivi: l’inibitore si lega solo al complesso E-S. Si lega in un sito

o diverso dal sito di legame del substrato.

non competitivi o misti: anche qui l’inibitore si lega ad un sito diverso dal

o sito attivo però in questo caso l‘inibitore si può legate o all’enzima libero

o al complesso enzima substrato.

- irreversibili (penicillina e aspirina): l’enzima viene modificato e non può più

recuperate l’attività catalitica. Non avendo più la giusta conformazione non avrà

la sua giusta funzione.

18/03 COMPETITIVA

L’INIBIZIONE è riconoscibile dal grafico dei doppi reciproci: grafico dei

reciproci della velocità rispetto al substrato (devi ave chiaro

come è fatto). L’intercetta della retta con asse y: 1/Vmax

mentre con l’asse x è -1/aKm. Se e aumenta la

concentrazione dell’inibitore l’intercetta sull’asse x aumenta

verso destra. Applicazione inibizione competitiva: per curare

l’avvelenamento da metanolo. L’alcool deidrogenasi

trasforma il metanolo in formaldeide che può provocare

morte. Per risolvere l’avvelenamento si fa una terapia basata sull’infusione lenta di

etanolo perché questo è un substrato che compete con il metanolo per l’alcool

deidrogenasi. Il metanolo così non può essere più trasformato in formaldeide tossica e

può essere eliminato come tale con le urine.

INCOMPETITIVA:

INIBIZIONE l’inibitore si lega in un sito diverso dal sito di legame per il

substrato e si lega solo al complesso enzima substrato. Gli

inibitori incompetitivi diminuiscono la velocità massima è la

Km. Là si riconosce anche dal grafico dei doppi reciproci

perché abbiamo tutte rette parallele alla retta senza inibitore.

INIBIZIONE MISTA o NON COMPETITIVA: l’inibitore si può legare:

- all’enzima, e quindi blocca l’enzima come tale, ma

legandosi ad un sito diverso quindi il substrato si lega

ma non funziona l’enzima

- al complesso enzima substrato

La V max diminuisce in entrambi i casi mentre la Km può

aumentare o diminuire, diminuisce se inibitore si lega al

complesso enzima substrato o aumenta se inibitore si lega

all’enzima. È la più rara. Anche questa si riconosce dal grafico

dei doppi reciproci, sono rette in cui la V max diminuisce sempre quindi non si

intersecano nell’asse y. Se si intersecano sotto l’asse x la Km diminuisce.

In tutti questi casi l’enzima non viene modificato quindi l’attività catalitica può essere

recuperata.

ENZIMI ALLOSTERICI o REGOLATORI: Molto enzimi sono sottoposti a regolazione che

permette un controllo dei processi che avvengono all’interno della cellula e modularli

in base all’esigenze dell’organismo in risposta a segnali. Sono costituiti da più subunità

solitamente. La modulazione avviene secondo diversi meccanismi:

1. modulatori/effettori allosterici sono piccole molecole che si legano in maniera

reversibile cioè non covalente

2. modifica covalente reversibile

3. legame con specifiche proteine

4. attivazione tramite scissione proteica: perché alcuni enzimi vengono sintetizzati

in forma inattiva e a seguito del taglio del peptide si trasforma nella forma

attiva.

1)Regolazione degli enzimi allosterici tramite modulatori: i modulatori convertono

l’enzima da una forma all’altra, se lo trasformano nella forma attiva sono stimolatori o

modulatori positivi, al contrario sono inibitori. Se il modulatore è lo stesso substrato si

chiama modulazione omotropica se invece è diverso si chiama modulazione

eterotropica. Generalmente il sito dove si leva il substrato e io modulatore sono

diversi. Esempio: enzima aspartato transcarbamilasi (ATCasi): catalizza una delle

reazioni iniziali che servono per la sint