Biochimica e biologia molecolare - Appunti

C ONFRONTO DEL DNA

Quali sono i principali campioni biologici da cui è possibile ricavare DNA? Fondamentalmente qualsiasi

campione che può contenere tracce di cellule, vale a dire sangue, saliva, urine, feci, capelli, peli,

sperma, ossa, denti o in generale tessuti biologici; molto valido come campione è il sangue il cui

prelievo però è leggermente invasivo ed è quindi spesso sostituito dalla saliva, dalla quale si può

comunque ottenere DNA di ottima qualità. Inoltre il DNA è una molecola molto stabile, che si degrada

solo in minima parte nel tempo e questa sua proprietà permette di portare avanti studi anche su reperti

molto antichi come le mummie; in casi come questi la molecola sarà ovviamente frammentata ma è

comunque possibile condurre indagini senza problemi.

Ai fini dell'identificazione non occorre indagare l'intera sequenza ma è sufficiente analizzare un numero

ristretto di marcatori polimorfici, ossia una forma elementare di DNA ripetitivo in cui è caratteristico il

numero di ripetizioni delle corte sequenze, dette STR (Short Tandem Repeats). I marcatori utilizzati

sono 13 loci genici racchiusi nel CODEX (Combined DNA Index System) e approvati dalla comunità

scientifica; queste sequenze si trovano sparse su quasi tutti i cromosomi e sono altamente ipervariabili

e quindi molto identificative.

Il DNA utilizzato per le indagini è detto DNA fingerprint, che consente di confrontare il profilo genetico

di un individuo col campione rinvenuto; l'analisi delle molecole viene usata per determinare l'ampiezza

dei tratti composti dalle sequenze ripetute dei marcatori polimorfici. Il primo passaggio è quello di

purificazione del DNA e in seguito di accertamento della provenienza umana; a tal fine si usa tagliarlo

con l'enzima di restrizione ALUI, che taglia in corrispondenza della sequenza ALU, tipica del genoma

umano. In seguito vengono amplificate le sequenze corrispondenti ai marcatori tramite PCR,

avvalendosi dell'utilizzo di primer complementari alle zone immediatamente adiacenti alle estremità

della sequenza. Il passo seguente è seguire un'elettroforesi in modo da determinare il peso molecolare

dei marcatori e determinare il numero di ripetizioni (conoscendo la lunghezza del marcatore e della

singola unità ripetitiva si tratta di una semplice divisione); viene utilizzata solitamente un'elettroforesi di

tipo capillare, più precisa di quella su gel di agarosio perché i frammenti vengono separati dal

macchinario in base al peso molecolare e un laser permette, grazie a sostanze fluorescenti, di generare

un profilo a picchi. Il profilo ottenuto è la base per il confronto, in quanto è costituito da una serie di

picchi la cui intensità dipende da quanto la sequenza sia stata amplificata, dato in realtà inutili ai fini del

processo; importante è invece la localizzazione in orizzontale dei picchi perché, grazie al confronto con

un marcatore di peso molecolare, permette di stabilire il peso e dunque la lunghezza in basi della

sequenza.

Se per un gene si riscontrano due picchi anziché solamente uno è solo indice di eterozigosi perché le

sequenze hanno peso praticamente identico ma vengono riconosciute come diverse. In seguito a

questa analisi viene stilata una tabella in cui per ogni gene si riportano i numeri di ripetizioni per ogni

allele; questa tabella viene poi confrontata con quella del sospettato per vedere la percentuale di

corrispondenza. Tra i marcatori utilizzati si trova ame, gene per l'ameloglobina, una proteina che si

trova nella polpa dentaria; la particolarità di questo marcatore è quella di non essere un STR ma di

presentare una lunghezza diversa sui cromosomi sessuali e quindi il numero di picchi in

corrispondenza di questo marcatore serve per identificare il sesso.

L'ultima fase del test, dopo il confronto dei profili, è quello del calcolo tramite il teorema di Bayes delle

probabilità che il DNA campione appartenga al sospettato; è a tal fine che sono stati individuati 13

marcatori, in quanto è questo il numero minimo di sequenze necessario per ottenere una sicurezza

maggiore del 97% che le due molecole di DNA provengano dallo stesso individuo. Se ottengo un profilo

parzialmente corrispondente a quello del sospettato una delle possibilità, oltre a quella mai scartabile di

aver commesso errori, è che il campione provenga da un familiare.

Confronto di DNA in caso di stupro. In caso di violenza sessuale, per risalire al DNA dell'assalitore

solitamente si utilizza un tampone vaginale della vittima in modo da poter ottenere lo sperma o tracce

biologiche; la difficoltà in questi casi è costituita dal fatto che il campione conterrà cellule sie del

colpevole sia della vittima. Per vedere se ci sono cellule spermatiche nel tampone si usa un marcatore

che produce immediatamente fluorescenza, il metil-umbelliferil-fosfato. Successivamente si procede ad

un'estrazione selettiva del DNA: con particolari enzimi vengono lisate le cellule epiteliali femminili e il

“mix” viene sottoposto a centrifugazione e successiva eliminazione del sopranatante in modo che

restino solamente le cellule spermatiche sul fondo della provetta. Si parla in casi come questi di

frazione maschile e frazione femminile.

Quantità di DNA. La quantità di DNA ideale per svolgere indagini di confronto si aggira intorno ad 1ng.

Una quantità di DNA molto inferiore può essere indice di una frammentazione della molecola, che può

compromettere i loci e portare a profili alterati. Viceversa un DNA troppo abbondante può determinare

picchi doppi e sfasati.

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NDAGINI DI PARENTELA

Marcatore del cromosoma Y. I geni presenti sul cromosoma Y sono in realtà piuttosto pochi, poco

ricombinanti (ad eccezione di una piccola regione distale che ricombina con l'X) e dunque con un

potere discriminativo minore del 13%. Possono essere utilizzati per determinare il sesso o, dato che

sono identici tra padre e figlio, determinare legami di questo tipo; bisogna sempre tenere presente il

fatto che in caso di più figli non permettono discriminazione. Vengono usate in caso di persone

scomparse per l'identificazione tramite il DNA paterno o per stilare linee genealogiche maschili.

Marcatori XSTR. I cromosomi X vengono ereditati in doppia copia dalle figlie femmine e in copia singola

dai maschi. Confronti di sequenze STR su questi cromosomi sono utilizzati per determinare parentela

presunto padre/figlia ma soprattutto madre/figlio.

DNA mitocondriale. Il DNA mitocondriale viene ereditato sempre dalla madre e risulta più abbondante di

quello nucleare (basti pensare al numero di mitocondri in una cellula). E' circolare a doppia elica e

presenta due sequenze, HV1 e HV2, che variano molto ma che essendo non ripetitive sono

mediamente identificative. Il DNA mitocondriale è utilizzato solo in casi particolari in quanto si può

verificare un'eteroplasmia, ossia la presenza

all'interno della stessa cellula di mitocondri

con DNA leggermente diverso e la

proporzione con cui le diverse sequenze sono

presenti non è ereditata in modo costante da

madre a figlio.

Test di paternità. Si confrontano i profili

genetici del figlio e del presunto padre.

Considerando che il padre fornisce il 50% del

DNA ci deve essere una corrispondenza del

50% tra il genoma del padre e quello del figlio;

se non sono riscontrate incompatibilità si può

procedere ad un test probabilistico. Si ottiene

così una certezza fino al 99,9%.

B ANCHE DATI PER I PROFILI GENETICI

Le banche dati dei profili genetici sono database in cui sono contenuti tutti i profili dei DNA analizzati

per qualsiasi motivo; contengono quindi tutti gli indagati per qualche reato, oppure, come avviene negli

USA, tutti gli individui della nazione. In Italia una banca dati non è presente per problemi ovviamente

economici e di privacy; si ha infatti il timore che questi campioni vengano utilizzati non solo a scopo

criminalistico ma anche da agenzie assicurative e datori di lavoro. In realtà vengono conservati nella

banca dati solamente i profili contenenti quindi informazioni riguardanti sequenze non codificanti,

mentre il resto della molecola non viene tenuta. E' stata di recente firmata l'approvazione per la

costituzione di una banca dati in molti paesi europei, compresa l'Italia; il paese è però indietro sul

progetto.

Negli USA esiste l'Innocence Project, che si pone come obiettivo quello di rintracciare tracce

biologiche a distanza di tempo in modo da scagionare i condannati a morte che si sono sempre

dichiarati innocenti; in questo modo sono stati salvati quasi 300 individui.

SNP COME MARCATORI

Utilizzare SNP al posto di STR permette di codificare sequenze più brevi e usare dunque anche DNA

più degradato; il problema degli SNP è che sono molto meno identificativi rispetto agli STR perché

spesso sono presenti solamente due varianti che peraltro sono molto più stabili da generazione a

generazione. Un altro svantaggio è costituito dal fatto che fino ad oggi le banche dati sono state

compilate utilizzando STR e non SNP. E' comunque possibile, grazie a studi recenti, dedurre alcuni

tratti fenotipici in base al profilo ottenuto con gli SNP: sono presenti ad esempio kit che con 6 SNP in 6

geni diversi permettono di stabilire con buona sicurezza il colore degli occhi e con 13 SNP quello dei

capelli.

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NCIDENZA DELL AMBIENTE SUI GENI E RICERCHE SULL AGGRESSIVITÀ

Negli ultimi anni sono state riscontrate evidenze di collegamenti tra il patrimonio genetico degli individui

e il loro comportamento. Ad esempio esistono due alleli possibili per il gene della serotonina, un

neurotrasmettitore correlato anche alla depressione, uno “s” (short) e uno “l” (long); nel 2003 una

ricerca ha dimostrato che a parità di quantità di eventi negativi nell'arco di un'esistenza le persone che

presentano l'allele s hanno una tasso di incidenza della depressione molto maggiore rispetto a quelle

che presentano l'allele l. Quando è stato cercato il motivo di questa differenza è stato visto che l'allele s

comporta un maggiore livello di attivazione dell'amigdala in presenza di stimoli di paura.

Un altro esempio è costituito dal gene MAOA, che codifica per le monoammino ossidasi. Un caso

eclatante su una famiglia olandese in cui tutti gli individui maschi presentarono episodi di violenza

anche gravi; fu trovata poi una mutazione di stop nella sequenza che causava un enzima tronco e non

funzionante. Solo i maschi presentarono questo problema perché la sequenza si trovava sul

cromosoma X, dominante sull'Y. Sul gene MAOA è stata trovata anche una mutazione VNTR; il numero

di ripetizioni della s