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Propedeutica biochimica e biologia molecolare - Appunti Appunti scolastici Premium

Appunti di Propedeutica biochimica e biologia molecolare per l’esame del professor Calogero. Gli argomenti trattati sono i seguenti: i polipeptidi globulari, i polipeptidi fibrillari, l'amminoacido generico, la glicina, la prolina, i gruppi aromatici.

Esame di Propedeutica biochimica e biologia molecolare docente Prof. R. Calogero

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ESTRATTO DOCUMENTO

-[INTRAMOLECOLARi] --> All interno della stessa catena proteica

-[INTERMOLECOLARI ] --> Tra due catene proteiche diverse

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RIASSUMENDO :

[STRUTTURA TREDIMENSIONALE ] ---> .Interazioni idrofobiche del core

. Legami disolfuro

.Capacita di autorigenerare i legami

---> Per assumerla correttamente spesso sono presenti PROTEINE AUSILIARIE che aiutano a

creare la struttura funzionale .

---------------------

[SPESSO LA STRUTTURA PRIMARIA NON BASTA A DEFINIRE LA STRUTTURA FUNZIONALE

EFFETTIVA ]

----> SERVONO [FATTORI ADDIZIONALI ]

Possono essere :

-ioni

-metalli

-gruppi organici (EME )

---> La struttura tredimensionale della catena polipeptidica GENERA UN CORRETTO AMBIENTE

CHIMICO FISICO per accogliere il fattore addizionale --> ESEMPIO GRUPPO EME

------------------------------------

Negli eucarioti i polipeptidi sono strutturati in --> [DOMINI FUNZIONALI ]

---> che si conservano e hanno struttura e posizione costante

un esempio :

.[ELIX LOOP ELIX ] ---> è un dominio peptidico molto semplice comune a TUTTE LE PROTEINE

CHE LEGANO CALCIO .

(esempio troponina calmodulina ecc )

.Il legame con il calcio viene mediato da [LEGAMI A IDROGENO ] --> Mediati da ACQUA [h2o]

---> Gli amminoacidi di legame [ELIX LOOP ELIX ] del calcio sono conservati e costanti .

---> in caso di assenza di calcio non si assiste alla formazione di ALFA ELICA---> non si forma

struttura 3D funzionale !!! --> LOOPS continuo o RANDOM COILS

.Esistono altri domini particolari --->

.LE [ALFA ELICHE ] e i [FOGLIETTI BETA ] sono quindi associati in domini particolari e costanti

anche in proteine diverse ,come unita funzionali .

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[STRUTTURA GENERALE ] in ordine di complessita

I[STRUTTURA PRIMARIA ] sequenza amminoacidica necessaria alla formazione di secondaria

II[STRUTTURA SECONDARIA ] legami a idrogeno ALFA ELICA FOGLIETTI BETA [NON

COINVOLTE CATENE -R]

III[STRUTTURA TERZIARIA ] legami a idrogeno [COINVOLTE CATENE -R]

IV[STRUTTURA QUATERNARIA ] interazione fra piu subunita proteiche

.--> La ripetizione di strutture semplici va a formare con domini ripetuti strutture complesse

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ESEMPIO:

[CHIMOTRIPSINA ]

.è un enzima piuttosto generico che non ha funzioni specifiche , degrada proteine .

--> se alla chimotripsina aggiungiamo DOMINI SPECIFICI --> esso puo diventare sempre piu

[SPECIFICO]

[MEDIANTE DOMINI DIVERSI CREO STRUTTURE FUNZIONALI DIVERSE SEMPRE PIU

SPECIFICHE ]

[CAMBIARE DOMINIO=CAMBIARE FUNZIONALITA ]

-----------------

.le [MUTAZIONI PIU GRAVI per la struttura terziaria sono quelle che avvengono a livello di

amminoacidi che formano il [CORE IDROFOBICO ] della proteina --> esso fornisce l impalcatura

per la struttura funzionale

.Le mutazioni di amminoacidi in superficie hanno basso impatto sulla conformazione funzionale

della proteina .

--> Gli amminoacidi localizzati sulla superficie hanno basso impatto sulla struttura funzionale e

possono differire anche nella stessa proteina umana

---> il [CORE] è la struttura piu importante

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[PROTEINE BASATE SU ALFA ELICHE ]

.Proteine di trasporto

.Proteine di membrana

.Proteine strutturali (collagene )

-struttura [COILED COIL ]

--> Basata su [2 ALFA ELICHE ] che si avvolgono una sull altra

.Il passo dell elica invece che essere ogni [3.6 amminoacidi ] si trova a essere ogni [3.5

AMMINOACIDI]

---> OGNI [7 AMMINOACIDI ]VI è una [LEUCINA ] che si affaccia a una altra [LEUCINA ]

formando un [LEGAME IDROFOBICO ]che stabilizza l elica

--> chiamata anche [LEUCIN ZIPPER ]---> legame APOLARE E IDROFOBICO

.All interno sono quindi esposte le catene -R IDROFOBICHE che formano legami idrofobici per

tenere insieme l elica

[COILED COIL]--> [Passo a 3.5 amminoacidi][Ogni 7 si affrontano due LEUCINE] [LEUCIN

ZIPPER ]

.Le catene R POLARI sono esposte all esterno ---> questo consente di creare una struttura con

GUSCIO POLARE ESTERNO che protegge un [CORE INTERNO IDROFOBICO] che minimizza il

contatto con l acqua

.[CHERATINE ]

---> non sono piu sufficienti i DIMERI COILED COIL ---> essi si compattano e formano

MIOFIBRILLE sempre piu compatti grazie a questa struttura ---> tramite [gruppi terminali NH e

COOH ]

----------

[COLLAGENE ]

.STRUTTURA A [TRIPLA ELICA ]

. STRUTTURA : GLICINA X Y GLICINA X Y

---> [GLICINA ] + [IDROSSIPROLINA ] + [IDROSSILISINA ]

STRUTTURA :

-I LIVELLO [GLICINA ] --> amminoacido piu mobile , forma legami a idrogeno TRA LE ELICHE e

non su elica singola AFFACCIANDOSI tra un elica e l altra . (legami idrogeno intermolecolari C=O

e NH)

-II LIVELLO [IDROSSIPROLINA ] --> amminoacido piu rigido e immobile , impacchetta le eliche

consentendo alle GLICINE di trovarsi in posizione fissa per fare i legami a idrogeno intercatena

--> La prolina è IDROSSILATA per fornire [STABILITA TERMICA ]

--> senza idrossiprolina non vi è stabilita termica

.III LIVELLO [IDROSSILISINA ] --> FORMA [BASI DI SHIFF]e [LEGAMI ALDOLICI ] e stabilizza

con [LEGAMI COVALENTI ] ulteriormente le eliche di collagene ---> funzione di [CROSSLINKS

COVALENTI ] che stabilizza la struttura !

--->sua assenza o riduzione anomala : [sindrome di DANSON ]

FORMAZIONE DEL COLLAGENE VERO E PROPRIO :

.struttura a singola elica G X Y glicina idrossiprolina idrossilisina

. i [COOH] terminali hanno una particolare [GLICOSILAZIONE ] che mantiene ancorato un capo

della treccia mediante [LEGAMI COVALENTI DISOLFURO ]

---> Questo fa si che la treccia si possa formare (3 eliche )

.All esterno della cellula daranno poi origine a COLLAGENE VERO E PROPRIO mediante

rimozione dei gruppi cooh terminali glicosilati(telopeptidi)

-------------

MALATTIE LEGATE AL COLLAGENE :

.Artrite reumatoide

.Osteogenesi imperfetta (malattie proteolitiche del collagene )

.SINDROME DI EHLERS DANSOn --> difetto di crosslinking dell IDROSSILISINA (pelle molto

molto elastica perche collagene poco stabilizzato )

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[STRUTTURA COMUNE DELLE GLOBINE DI TRASPORTO DI ELETTRONI ]

[GLOBULINE ]

(tipicamente citocromi )

---> [SOLO ALFA ELICHE ! ]

Struttura a 4 ALFA ELICHE inserite tra loro in modo diverso avvolgendosi

---> creano un [GLOBULO IDROFOBICO (catene R apolari esposte )] in cui si inserisce il cofattore

di trasporto

ESEMPIO : [MIOGLOBINE] e [EMOGLOBINE ]

---------------------

[IMMUNOGLOBULINE ]----> ESCLUSIVAMENTE [FOGLIETTI BETA ]!!!

.Possiedono [2 CATENE LEGGERE] e [2 CATENE PESANTI ]

---> sono tenute insieme fra loro da [LEGAMI DISOLFURO ]

.Possiedono una [REGIONE COSTANTE ] che è costante per ogni immunoglobulina di categoria

.Possiedono una [REGIONE VARIABILE ] che varia per ogni singola immunoglobulina e consente

un legame doppio con antigene

[IGM - IGG] coinvolte in risposta immunitaria

[IGM] PENTAMERICHE ---> in seguito a risposta primaria si trasformano in [IGG] monomeriche -->

risposta secondaria

risposta secondaria ---> Prevalenti quindi le IGG .

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5-2-2014

[ANTICORPI]

sono composti strutturalmente in DOMINI ---> [DOMINI STRUTTURALI] con funzioni diverse che

interagiscono fra loro

I- [PICCO DI IGM ] ---> non hanno particolare specificita e selettivita per l antigene .Sono una

prima forma di difesa poco specifica (PENTAMERICHE)

II-[PICCO DI IGG] --> Hanno [REGIONI VARIABILI] con ALTISSIMA SPECIFICITA PER I

SINGOLI ANTIGENI DIVERSI !!!!

---> Questo e dovuto alla variabilita amminoacidica delle sequenze VARIABILI

.--> Rappresenta uno dei pochi casi in cui vi e riarrangiamento genico in una cellula somatica !

---> Se l antigene cambia deve cambiare adattandosi la sequenza amminoacidica delle

[SEQUENZE VARIABILI] delle IGG

--> le IGG Vengono usate nei TEST DIAGNOSTICI come RIVELATORI DELLA PRESENZA DI

UN ANTIGENE --> Grazie alla loro specificita per un singolo antigene

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[STRUTTURA DELLE IMMUNOGLOBULINE ]---> SOLO FOGLIETTI BETA !!!!!

.Possiedono [PARTI STRUTTURALI ]costanti --> [FOGLIETTI BETA + CORTI LOOP A LEGARE

FOGLIETTI BETA]

[CATENE VARIABILI] variabili ---> [STRUTTURA A LOOP con amminoacidi estremamente

vari]

.[REGIONI VARIABILI ] ---> [LOOP CON AMMINOACIDI ESTREMAMENTE VARIABILI !!!] -->

specificita

[CDR1]-[CDR2][CDR3] + [5 BETA FOGLIETTI su 4 ] ---> 9 BETA FOGLIETTI

.[REGIONI COSTANTI ]--> struttura a [4 BETA FOGLIETTI ] che si affacciano su [3 BETA

FOGLIETTI ]--> 7 beta foglietti antiparalleli

---> La struttura a domini connessi da [LOOP] permette una relativa mobilita tra domini e tra i loop

di riconoscimento dell antigene

COSTANTE : 4 beta su 3 BETA + loop

VARIABILE : 5 beta foglietti su 4 CDR1-CDR2-CDR3 LOOP amminoacidici

---> interazione chiave serratura [sterica come un enzima] grazie ai loop amminoacidici

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[RECETTORI LEGATI A ENZIMI ]

---> un difetto genetico puo causare enzimi sempre attivi e proliferazione cellulare incontrollata

.attivati solo con ligando legato

.[TIROSIN CINASICI ]

---> implicati nella proliferazione cellulare, oncogeni .

[STRUTTURA ]

-[REGIONE INTERNA ] con attivita catalitica --> [COSTANTE E CONSERVATA NEI DIVERSI

RECETTORI ]

-[REGIONE ESTERNA ] di legame con il ligando ---> [VARIABILE CONSENTE LEGAME CON

LIGANDI DIVERSI E DISTINGUE RECETTORI UNO DALL ALTRO]

.Inattivi in forma monomerica , dimerizzano formando dimeri si autofosforillano su tirosina e

permettono di fosforillare substrati che si legano loro .

--> con una mutazione possono essere sempre attivi

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[DOMINI DI INTERAZIONE PROTEINA -PROTEINA ] --> permettono l interazione tra una proteina

e l altra mediante strutture fisse

.[PH] --> FOSFATIDILINOSITOLO FOSFATO di membrana

--> consente alle proteine di legarsi in membrana quando devono andare a cercare i propri ligandi

segnale

--> riconosce fosfatidilinositolo mediante --> [LOOPS] variabili che legano fosfatidilinositolo

--> SE NON VI E NECESSITA DI TROVARE IL PROPRIO LIGANDO IL DOMINIO PH RESTA

INATTIVATO e la proteina non migra in membrana legandosi a fosfatidilinositolo

.[SH2] --> tirosina fosforillata

RICONOSCE : TIROSINA FOSFORILLATA + 3 AMMINOACIDI --> parte variabile ,strutture e

proteine diverse !

--> i 3 amminoacidi stabilizzano l interazione

--> solo fino a quando la tirosina e fosforillata l interazione continua

STRUTTURA : [YP+3A]

--> vi sono molti SH2 grazie ai 3 amminoacidi diversi

DOMINIO : presenta una [TASCA PRINCIPALE ] per TIROSINA FOSFORILLATA , un piano per 2

amminoacidi e una [TASCA ] per il terzo amminoacido

- ------- -

.[SH3] --> PROLINE

---> presenta una [DEBOLE ADESIVITA SU SUPERFICIE ]

---> RICONOSCE UN [ELICA TRIGONALE ] [PASSO N+3] Possibile solo con ---> [PROLINA ]che

compatta

.L interazione resta molto molto debole pertanto serve solo a posizionare una davanti all altra

correttamente le proteine , per fissare l interazione servono altri legami piu specifici .

--> Questo e dovuto alla debole adesivita del piano --> non ci sono tasche ma solo[ un SITO

IDROFOBICO] per l elica [N+3 ] prolinica

esempio funzionale [PROTEINA SRC ] --> coinvolta nella proliferazione tumorale

.Ha

-DOMINIO CATALITICO

-DOMINIO SH2 [YP+3A]

-DOMINIO SH3 [elica n+3 PROLINA ]

.Si trova in forma inattiva

.Defosforillando la TIROSINA FOSFORILLATA i 3 domini si scollegano e passano in forma attiva

ORA---> .[SH2] puo legare [YP+3A] e continuare la sua attivita di legame

.[SH3]assume conformazione funzionale e puo legare [ELICA TRIANGOLARE N+3

PROLINA ]

---> Tutto questo grazie al cambiamento conformazionale indotto dalla defosforillazione della

tirosina che fa ALFA ELICIZZARE un [LOOP] di collegamento .

--> scomparsa interazione cellula con cellule esterne ---> [TUMORI ]

---------------------

[MIOGLOBINA ED EMOGLOBINA ]

.NECESSARIE perche nel sangue O2 è poco solubile

---> L emoglobina ne aumenta la presenza e la solubilita di circa 100 volte .

.EMOGLOBINA è molto presente [150g/LITRO ]

.MIOGLOBINA --> MONOMERICA 1 solo gruppo EME

.EMOGLOBINA 2ALFA 2 BETA con 4 GRUPPI EME (1 per globina )

-----

[EMOGLOBINA ]

.2ALFA2BETA con 4 gruppi [EME]

[EME ] --> [PROTOPORFIRINA 9 ] con [4 PIRROLI] in cerchio

.FERRO LEGATO A AZOTO PIRROLICO --> in forma FERROSA FE 2+

--> esistono enzimi che ripristinano in condizione fisiologica lo stato di ossidazione FE2+

ESISTE IN : -[STATO OSSI ] --> con ossigeno legato a gruppo eme

-[STATO DESOSSI ] --> senza ossigeno legato a gruppo eme

FERRO : [7 LEGAMI DI CORDINAZIONE ]--> 4 con gli azoti pirrolici 1 con [ISTIDINA

PROSSIMALE] che lo tiene fuori dall anello porfirinico 1 con ossigeno e 1 con [ISTIDINA

DISTALE] che chiude sopra la struttura idrofobica

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Le emoglobine nell organismo non sono sempre costanti ma variano durante lo sviluppo

.LE ALFA sono costanti dalla nascita

.LE BETA sono quasi nulle alla nascita e crescono successivamente

.LE GAMMA sono presenti alla vita intrauterina e decrescono dopo

[GAMMA ]--> hanno una maggiore affinita per l ossigeno delle beta pertanto strappano da

emoglobina materna l ossigeno .

la [MIOGLOBINA ] è in tutto e per tutto simile alla [SUBUNITA ALFA ] della [EMOGLOBINA ]

---> Anche la curva e simile

--> L unica differenza si evidenzia nell [ESTREMITA NH TERMINALE ] che è modificata in modo

diverso nell emoglobina e causa un cambiamento conformazionale che e funzionale al trasporto di

CO2 , funzione che la mioglobina non possiede

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il [GRUPPO EME ]

--> è mantenuto all interno di una [STRUTTURA IDROFOBICA ] composta da

ISTIDINA DISTALE

|

|

VALINA -------FE--------FENILALANINA

|

(ISTIDINA PROSSIMALE)

--> struttura IDROFOBICA che impedisce l entrata di ACQUA [H2o] e quindi la formazione di

[METAEMOGLOBINA NON FUNZIONALE]

---> L [ISTIDINA PROSSIMALE ]ha un legame di cordinazione col ferro e in forma [DESOSSI] LO

MANTIENE SOTTO IL PIANO DELL ANELLO PORFIRINICO !!!!!

---> QUANDO L OSSIGENO SUBENTRA ---> LEGA IL FERRO E LO TIRA VERSO SU

PORTANDOLO AL PIANO DELL ANELLO PORFIRINICO

--> questo cambiamento strutturale ha una FUNZIONE di CAMBIAMENTO STRUTTURALE

DELLA STRUTTURA DELL EMOGLOBINA ---> si riflette in un cambiamento funzionale .

LEGAMI FERRO : 4 con AZOTO dei PIRROLI gruppo eme , 1 con ISTIDINA PROSSIMALE che lo

tiene in giu , 1 con O2 che lo tira in su

7 legame --> ISTIDINA DISTALE in forma ossi

[DIAGNOSI E VALUTAZIONE DELLO STATO DELL EMOGLOBINA ]

--> Se notiamo un aumento anomalo dei globuli rossi --> emoglobina ha qualche problema.

.[COLORE ] --> LA FORMA DESOSSI GRAZIE ALL ISTIDINA PROSSIMALE CHE TIRA GIU IL

FERRO DALL ANELLO PORFIRINICO ha una struttura elettronica diversa della forma OSSI

NELLA QUALE L OSSIGENO TIRA SU IL FERRO SULL ANELLO PORFIRINICO

DESOSSI--> colore piu opaco --> non immerso negli elettroni

OSSI --> ferro immerso in anello con molti elettroni--> rosso vivo

---> RISULTATO ? --> VI E UN ASSORBANZA DIVERSA DEI RAGGI LUMINOSI

---> COn un monocromatore valuto l assorbanza e noto che la forma OSSI ha due picchi a 520 e

580 nm mentre la forma desossi si assesta su 560nm

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l [CO ] ha un affinita molto piu alta per l emoglobina rispetto a O2---> Saturazione ---> MORTE !

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[EMOGLOBINA ]possiede una CURVA VARIABILE DI DISSOCIAZIONE , non come mioglobina

che raggiunto un certo livello si satura fino al massimo in modo costante .

--> L emoglobina necessita di una maggiore quantita di pressione parziale di ossigeno per

saturarsi

PER QUALE MOTIVO ? --> Deve essere rilasciabile nei capillari . ---> deve dipendere dalla

pressione parziale di O2

[EFFETTO COPERATIVO ]

--> L emoglobina ha 4 gruppi eme .

--> LEGARE IL PRIMO OSSIGENO E DIFFICILE MA UNA VOLTA LEGATO legare gli altri è piu

veloce e semplice !

---> QUESTO E DOVUTO A UN CAMBIAMENTO CONFORMAZIONALE QUANDO SI LEGA IL

PRIMO 02

.

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10-2-2014

DIFFERENZE TRA EMOGLOBINA E MIOGLOBINA .

. emoglobina nei tessuti a pressione 20 torr di ossigeno e saturata al 50% mentre mioglobina è

saturata al 100%

.emoglobina ha attivita coperativa

[SOLO EMOGLOBINA CONSENTE QUINDI DI AVERE FUNZIONE DI SCAMBIATORE TRA

AMBIENTE ESTERNO E CELLULE]

---> questo grazie alla propria curva di dissociazione !!

[MIOGLOBINA]

CARICAMENTO : [MB]+[O2]=[Mbo2]

COSTANTE DI DISSOCIAZIONE : [MB][O2]

--------------

[MBO2]

SATURAZIONE FRAZIONALE : [PO2]

----------

K+[Po2]

la saturazione frazionale ci dice qual è la percentuale di molecole saturate sulle totali

K= pressione parziale di ossigeno alla quale il 50% delle molecole è saturata.

è una costante gia fornita

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MA EMOGLOBINA E COMPLETAMENTE DIVERSA !

--> perche è un tetramero e lega contemporaneamente 4 molecole diverse

HA PIU SUBSTRATI

---> LA [SATURAZIONE FRAZIONALE ]--> tiene conto degli N substrati

FORMULA FINALE

[po2]n

-------

k+[po2]n

-----> possiamo ricavare a questo punto N---> ovvero il numero di substrati legati

N=molecole di OSSIGENO legate a una data pressione parziale .

.in [MIOGLOBINA] N=1

.N si ricava traslando su base logaritmica l equazione

[N] di fatto è la --> [PENDENZA DELLA RETTA] !!! --> difatti mioglobina ha un andamento lineare

di saturazione e ha N=1

.[EMOGLOBINA]= ANDAMENTO COPERATIVO

- a 20 torr di Po2 ha il 50% di molecole saturate

-ma a [ALTA PRESSIONE DI O2] mi bastano 0.1 torr per avere il 50% di molecole saturate

---> EFFETTO COPERATIVO

.La situazione intermedia presenta [3 MOLECOLE DI O2] legate, la vera differenza con la

mioglobina si gioca nella

-I MOLECOLA DI o2

-IV MOLECOLA DI O2

---> La prima molecola di o2 è estremamente difficile da legare

.seconda e terza normali

. ULTIMA MOLECOLA SEMPLICISSIMA da legare

---> L affinita cambia in base alla Po2 e alla quantita di molecole gia legate ---> EFFETTO

COPERATIVO DELL EMOGLOBINA !!!

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[SISTEMA EMOGLOBINA ]

.sistema molto complesso .

.[HB ogni volta che lega 1 O2 EMETTE 0.6 H+] ---> questo significa che se l ambiente è BASICO e

CATTURA H+ si [FACILITA IL CARICAMENTO DI OSSIGENO SU EMOGLOBINA ]

--> [ALVEOLI POLMONARI PH 7.4]!!!

[EFFETTO DI BOHR ]

in questo caso un [PH ALTO] è un [ATTIVATORE ALLOSTERICO ] del trasportatore --> FACILITA

IL CARICAMENTO di OSSIGENO e [RIDUCE IL PIEDE DELLA CURVA ] spostandola a sinistra

.[HB per ogni O2 legato RILASCIA 0.8 CO2]

---> che ovviamente NON PUO ESSERE IN FORMA GASSOSA

(ELIMINAZIONE I) : [ANIDRASI CARBONICA ]trasforma CO2 in HCO3- e [H+] -->

ACIDIFICAZIONE

---> un [ACIDIFICAZIONE ][PH BASSO ] è un --> [INIBITORE ALLOSTERICO ] --> FACILITA il

rilascio di O2 da parte di emoglobina --> sposta piede curva a destra

--> MECCANISMO DI [BOHR] opposto a quello degli alveoli polmonari

.UN ABBASSAMENTO DI PH--> FACILITA RILASCIO DI O2--> inibitore allosterico sposta curva a

destra

RESTA ANCORA CO2 da eliminare:

(ELIMINAZIONE II )[CARBOAMMATI]--> [CO2] si lega sui gruppi AMMINICI TERMINALI DELLA

PROTEINA(generiche proteine ematiche ) --> spodestando di fatto un H+ dalla sua sede NH2

---> questa reazione [RILASCIA H+]

---> EFFETTO DI BOHR --> [ACIDIFICAZIONE] stimola rilascio di O2(inibitore allosterico )

[TORNATO A LIVELLO POLMONARE ]

.[EMOGLOBINA] rilascia [H+] caricandosi di ossigeno

--> [H+] stimolano [CARBOAMMATI] a rilasciare CO2 GASSOSA verso l esterno e ricaricare H+

per riformare il gruppo amminico

---------------

.Vi sono altre dipendenze secondarie come il CLORO .

.L emoglobina pura è molto piu affine per ossigeno che quella nei globuli rossi . PERCHE ?

-->dovuta all effetto del [BIFOSFOGLICERATO ]

.Il bifosfoglicerato è un [INIBITORE ALLOSTERICO ] --> ALLARGA IL PIEDE INIZIALE DELLA

CURVA !

--> RIDUCE AFFINITA PER 02 !

. Grazie a [BIFOSFOGLICERATO ] emoglobina a 20 TORR di pressione nei capillari è al 50%

saturata --> rilascio di o2

.Vi sono molti inibitori allosterici connessi all emoglobina

PRINCIPALI :[CO2 ACIDIFICAZIONE EFFETTO DI BOHR] + [ BIFOSFOGLICERATO ]

FENOMENO DELLA QUOTA : in alta montagna aumenta la concentrazione di

[BIFOSFOGLICERATO ] legato all emoglobina .

--> Questo perche è necessario RIDURRE L AFFINITA DI EMOGLOBINA in modo che a livello

capillare si rilasci molto piu O2 a parita di pressione parziale .

--> è una COMPENSAZIONE che funziona fino a circa 4000 metri .

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[FUNZIONAMENTO MOLECOLARE ]

EMOGLOBINA : TETRAMERO [2 a 2 b ]

[ALFA1 LEGATO A BETA 2]

[ALFA2 LEGATO A BETA 1 ]

---> al centro vi è un [SOLCO ] nel quale nella forma [DESOSSI è legato il bifosfoglicerato ]

[DESOSSi] : solco con bifosfoglicerato --> stabilizzato da CARBOAMATI

[OSSI]: solco ridotto , [ESPULSO BIFOSFOGLICERATO]

- Elica [CH3] si sposta rispetto a [ALFA2] --> riduzione del solco

-[ISTIDINA PROSSIMALE legata al ferro legato a O2] --> sale sul piano dell anello .

---> la [CURVA SIGMOIDE ] tipica del emoglobina e data da una miscela di percentuale tra

ossiemoglobina e desossiemoglobina .

-------

.quando al posto di O2 si lega CO --> L emoglobina in forma [OSSI] viene rimossa dalla soluzione

---> SI PERDE FUNZIONALITA RESPIRATORIA --> grazie all alta affinita per o2

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[FENOMENO DI OSSIGENAZIONE ]

--> consiste nello [SPOSTAMENTO DI CH3] su [ALFA 2]

-Le due catene si restringono e si riagganciano in una posizione diversa come la catena di una

bicicletta

.L elica con [ISTIDINA PROSSIMALE ] per potersi elevare quando si lega O2 all atomo di ferro e lo

trascina su effettua un [CAMBIAMENTO CONFORMAZIONALE ] per evitare di cozzare a causa

dell ingombro sterico con altri atomi --> si trasmette causando [CH3-ALFA2]--> PASSA IN

FORMA OSSI-

--> FENOMENO : [INTERAZIONE DI PERUTZ]

.Bassa affinita : legame di bifosfoglicerato e CARBOAMMATI che la stbilizzano

.Alta affinita : modello di [PERUTZ] ISTIDINA PROSSIMALE cambia conformazione --> H3-ALFA

2

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[DIFFERENZE CATENE BETA MATURE E GAMMA FETALI ]

.[CATENE GAMMA FETALI] --> possiedono una tasca idrofobica modificata che [NON POSSIEDE

ISTIDINA ](sostituita con serina ) alla quale si legava con legami idrogeno il bifosfoglicerato

--> il [BIFOSFOGLICERATO] si lega male o non si lega tramite i gruppi fosfato --> AFFINITA

MOLTO AUMENTATA.

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[MUTAZIONI]

I[MUTAZIONI DI SUPERFICIE] --> non cambiano struttura e non causano un influenza funzionale.

sono --> VARIABILITA INDIVIDUALI.

II[MUTAZIONI CORE IDROFOBICO]---> emoglobina perde i gruppi eme che diventano gruppi che

si intercalano in membrana

---> alterano globuli rossi --> portano attiva [EMOLISI] e invecchiamento precoce dei globuli

--> prendono il nome di [CORPI DI HEINZ]

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12-2-2014

[EMOGLOBINE ANORMALI ]

ESEMPI;

.MUTAZIONI DEL SITO ATTIVO :

-[HB BRISTOL ]--> VALINA-ACIDO ASPARTICO

.La tasca idrofobica che era completata dala valina si perde ---> entra acqua e il gruppo eme si

sgancia --> corpi di heinz eccetra

--> si forma APOPROTEINA senza gruppo eme .

.CAMBIAMENTI DI STRUTTURA SECONDARIA

-[HB BUBBA] --> istidina-prolina

--> la prolina complessa e interrompe cambiando orientamento dell elica ---> struttura diversa

persa la funzione ù

-[HB SAVANNAH] --> glicina-valina

--> nel posto stretto in cui era poteva esserci solo glicina a causa di ingombro sterico

la presenza di un altro amminoacido fa perdere la struttura

-METAEMOGLOBINE

.[HB BOSTON]--> [ISTIDINA DISTALE] sostituita con [TIROSINA ]

--> si viene a creare il fatto che [GRUPPO OH ] viene scambiato per l ossigeno ma ovviamente

non puo essere utilizzato

--> l emoglobina non è piu funzionale

.[HB MILWAKEE]--> Valina laterale sostituita con [ACIDO ASPARTICO ]

--> gruppo COOH scambiato per ossigeno --> non puo svolgere la sua funzione normale

-EMOGLOBINE INSTABILI : [sono emoglobine che hanno una delle due forme , ossi o desossi

molto instabili]

--> LA MUTAZIONE è MENO GRAVE in quanto sono parzialmente funzionali , il problema è che

saranno o troppo affini o troppo poco affini .

.--> l effetto sarà che visto che ho MENO EMOGLOBINE STABILI aumenteranno il numero di

eritrociti.

esempi:

- [HB YAKIMA ] --> ACIDO ASPARTICO sostituito con ISTIDINA --> risultato MANCANZA DI

LEGAME A IDROGENO CHE STABILIZZA LA FORMA [DESOSSI]

risultato : la proteina ha MOLTISSIMA AFFINITA , quasi come la MIOGLOBINA ma a livello

capillare non rilascia o2 .

-[HB KANSAS]

--> OPPOSTO A [HB YAKIMA]

. La proteina ha la [FORMA OSSI] molto instabile pertanto NON RIESCE A CARICARE

OSSIGENO

--> è limitante ma e vitale

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.[EMOGLOBINA S ]--> [ANEMIA FALCIFORME ]

MUTAZIONE DI SUPERFICIE : [ACIDO GLUTAMMICO ] sostituito con [VALINA ]

--> LA VALINA CREA UN PEDICE IDROFOBICO CHE TENDE A INSERIRSI IN ALTRE

EMOGLOBINE E FORMARE DEI DIMERI E DEI COMPLESSI MULTIMERICI FIBROSI

---> QUESTO AVVIENE [SOLO IN FORMA DESOSSI !!]

pertanto il fenomento si evidenzia esclusivamente a livello dei capillari

.Gli agglomerati di [HBS] lidono i globuli rossi premendo sulle pareti e fanno in modo di degradarli

piu velocemente dandogli una caratteristica forma a falce a livello capillare

ATTENZIONE : in forma OSSI LA PROTEINA è [PERFETTAMENTE FUNZIONALE ]

.Perche dona resistenza in ambiente malarico ?

.Il parassita della malaria sfrutta i globuli rossi per compiere il proprio ciclo in circolo vitale

--> causa un cambiamento di PH al loro interno che li porta a legarsi alle pareti dei vasi e a non

essere riconosciuti e rimossi dalla milza

--> dopo 14 giorni li porta a lisi e si continua a riprodurre

.Necessita di molto [POTASSIO K ] per funzionare

[HBS ] causa due fenomeni:

I-Modificando la permeabilita di membrana degli eritrociti causa una [RIDOTTA PERMEABILITA

AL POTASSIO ]

--> rallenta proliferazione

II-Grazie ai MULTIMERI(ESAMERI ) AGGREGATI di [HBS] l eritrocita si LISA e VIENE

SOSTITUITO prima che il parassita possa completare il proprio ciclo vitale (circa 14 giorni )

--> per questi motivi HBS eterozigote viene mantenuta .

-------------------------------

[ENZIMI]

Classificazioni:

-OSSIDORIDUTTASI

-TRANSFERRASI

-IDROLASI

-LIASI(addizione al doppio legame )

-ISOMERASI

-LIGASI

---> consentono reazioni a TEMPERATURA CORPOREA (i cofattori hanno stessa funzione ma a

temperature piu alte )

FUNZIONE : abbassare energia di attivazione

COME?: [CREANO AMBIENTE CONTROLLATO PER FAVORIRE UNA REAZIONE ]

--> creano una [SITUAZIONE INTERMEDIA INSTABILE ] in tempi ragionevoli per la vita

.Aumentano la probabilita delle collisioni

.Dipendono dalle CONDIZIONI AMBIENTALI (curva di ph,temperatura eccetra )

[CARATTERISTICHE]

.APOENZIMA= enzima ormai privo di COFATTORE.

.il substrato entra in contatto con il SITO ATTIVO dell enzima

+ substrato possiedo + veloce sarà la reazione (piu probabile la collisione)

.i gruppi reattivi [SITI ATTIVI ] sono solitamente o [COFATTORI] o particolari [CATENE LATERALI

R ]

.Range di temperatura 20-35 gradi

--> superato un certo livello di temperatura la proteina si muove con movimenti browniani troppo

rapidi ---> si perde la struttura funzionale e l enzima non funziona piu come dovrebbe

.[APOENZIMA (senza cofattore )]+ [COFATTORE ]--> [OLOENZIMA]

esempi:

.[GLUCOSIO 6fosfato DEIDROGENASI ] è un enzima che STABILIZZA TERMICAMENTE i globuli

rossi

--> una sua mutazione riduce la stabilita termica delle emazie e ne causa un invecchiamento

precoce !

.è una patologia legata al sesso (GENE MAPPATO SU X) --> molto grave anche perche gli

eritrociti non sono assolutamente in grado di ricrearla .

---------------------------------------------

[ORIENTAMENTO ]

.Perche l interazione enzima substrato sia efficace il substrato deve [ORIENTARSI IN UN CERTO

MODO ] sul sito attivo dell enzima

--> L 'enzima è in grado di farlo orientare correttamente --> [INDUCED FIT ]

------------------------------------------------

[PROTEASI]

.Vi sono vari tipi di proteasi ,agiscono mediante un sito attivo che puo essere :

-SERINA

-CISTEINA

-TIROSINA

-METALLO ---> metallo proteasi ad esempio della coagulazione

LA FUNZIONE : tagliare proteine in amminoacidi semplici --> Ad esempio coinvolte nella

proliferazione del capside virale di virus HIV

[SERINA PROTEASI ]

.Proteasi esempio:

[CHIMOTRIPSINA ] --> la piu generica, viene combinata con altri domini per acquistare specificita .

. il meccanismo è sempre uguale

FASI:

-ENZIMA [CHIMOTRIPSINA][SERINA PROTEASI] con serina legata a [ISTIDINA protonabile]

-Gruppo -OH di serina PROTONA [ISTIDINA ] che diventa [ISTIDINA PROTONATA] R-

C=O | \NH-R

-Si forma intermedio TETRAEDRICO A CARICA NEGATIVA del carbonio R-C-O-

\NH

-Il composto ricade nello stato a 2 amminoacidi separati

A QUESTO PUNTO SI DEVE RIPRISTINARE ENZIMA :

-substrato: acqua

-intermedio con carbonio tetraedrico

-H si lega a O di serina e riforma SERINA +[ISTIDINA PROTONABILE ]

-------------------------------

.per ottenere il sito attivo di [SERINA PROTEASI ] che contenga un [ISTIDINA PROTONABILE

COME BASE] è necessaria una condizione particolare:

-[istidina è stabilizzata da legami a idrogeno che fanno si che sia ridotta instabilita e carica positiva

dell istidina protonata ]--> assorbono carica risucchiando elettroni (in situazioni standard sarebbe

estremamente instabile )

-viene favorita la forma ANIONICA R-C-O-

\

del carbonio tramite legami a idrogeno che prima del sito attivo risucchiano carica negativa

permettendo di formare poi l [intermedio tetraedrico] ---> [BUCO OSSIANIONICO-OSSIANIONIC

HOLE - ] prima di sito attivo

--> in condizioni normali questo non si formerebbe

[SPECIFICITA ]

.Le serina proteasi NON SONO SPECIFICHE --> nel senso che [NON RICONOSCONO SOLO

DETERMINATE PROTEINE] (es collagene o altro)

---> sono però [AMMINOACIDO SPECIFICHE] --> hanno una TASCA in cui cade la CATENA R di

determinati amminoacidi

.la [TASCA] cambia ovviamente da enzima a enzima .

--> in questo consiste la loro specificita ---> hanno un taglio [AMMINOACIDO SPECIFICO] non

[PROTEINA SPECIFICO ]

.Possono essere rese piu specifiche le [CHEMOTRIPSINE ] mediante moduli aggiuntivi(domini) .

ESEMPIO : farmaci HIV ---> si creano farmaci che simulano catene R di alcuni amminoacidi --> si

vanno a inserire in siti specifici di SERINA PROTEASI e la bloccano --> impedita replicazione di

HIV .

--> sono INIBITORI DI SPECIFICHE PROTEASI

------------------------------------------------------------------------------------------

17-2-2014

.principio di [FEEDBACK NEGATIVO] --> il prodotto di un enzima va a inibire l enzima che ha

creato lo stesso prodotto

--------------

[TEST ELISA ]

obiettivo : valutare la presenza di una proteina nel siero

-ho un virus

- lo faccio passare attraverso una piastra plastica dove restano intrappolate proteine

-costruisco [ANTICORPI CHE RICONOSCONO SPECIFICATAMENTE VIRUS]

---> essi legano le proteine

-per marcarli lego loro ANTICORPI DI UN ALTRA SPECIE che riconoscono ANTICORPI

---> a questi è legata [PEROSSIDASI] che legando un colorante viene MARCATO

--> attraverso l utilizzo del SECONDO MARCATORE posso avere una procedura standardizzata

per tutti i tipi di proteine senza dover valutare rese specifiche degli enzimi in base al substrato

[TEST PER INFARTI]

Quando si verifica un infarto vengono liberate 3 tipi di enzimi che aumentano livello nel siero

--> per screenarli posiziono un SUBSTRATO CHE LI LEGA e valuto la variazione di colorazione

degli enzimi !

.[CREATINA KINASI ]--> aumenta subito e dura poche ore

.[LATTATO DEIDROGENASI LDH]--> aumenta meno ma permane per piu giorni dopo l infarto

.[IDROSSIBUTIRRICO DEIDROGENASI]--> permane piu giorni.

.[LDH]--> esiste in piu ISOFORME

[LDH1]-[LDH2]-[LDH3] ecc

.[LDH5] si innalza in seguito a ---> DANNO EPATICO

come faccio a identificare i rapporti tra le varie isoforme ?

-Le divido con ELETTROFORESI e poi somministro loro il substrato colorante ---> riesco a fare

uno screening delle varie isoforme

.anche [CREATINA KINASI ] possiede piu isoforme .

-------------------------------------------------

------------------------------------------------

[CINETICA CHIMICA ]

VELOCITA---> misura l attivita dell enzima ovvero la velocita con cui l enzima favorisce al

transizione del substrato nel prodotto

VELOCITA : VMAX*concentrazione substrato

------------------------------

KM + concentrazione substrato

VMAX: velocita massima a concentrazione TEORICA di substrato INFINITA !

KM: costante pari a [CONCENTRAZIONE DEL SUBSTRATO ALLA QUALE SIAMO AL 50% di

VMAX]

----> piu è ALTA KM MENO c'è AFFINITA !

---> piu è BASSA KM piu l enzima è AFFINE per il substrato (serve meno substrato ) !

SEMPLIFICANDO :

.si puo creare una RETTA Y=KM+C con la quale trovo reciproco 1/V e KM

-------------------------

INIBITORI

---> INATTIVARE ATTIVITA ENZIMATICA A COMANDO per adattarla alle esigenze

.[IRREVERSIBILI]--> una volta che si sono legati a enzima non si staccano piu e lo inattivano per

sempre . non si staccano piu : un esempio è [CO] per l'emoglobina : in condizioni fisiologiche

non si stacca piu e inattiva di fatto l enzima

.[REVERSIBILI] --> l inibitore si lega a enzima MOMENTANEAMENTE ma la reazione puo tornare

indeitro

E+I ---> <---- EI

-servono a modulare attivita enzimatica

------------------------

CATEGORIE INIBITORI reversibili

.[COMPETITIVI]

normali:

--> si legano nel [SITO ATTIVO DEL SUBSTRATO ]

[O SI LEGA L INIBITORE O SI LEGA IL SUBSTRATO ]

-NON è CONSENTITA LA FORMA A TRE ELEMENTI [EIS] !

.[V MAX NON CAMBIA] ---> ad alte concentrazioni il substrato vince e si lega di piu

. [AGISCE AUMENTANDO LA KM]

con cambiamento conformazionale:

-L inibitore si lega in un altro sito ma MODIFICA LA CONFORMAZIONE DELL ENZIMA per cui il

substrato se c'è l inibitore attaccato NON SI PUO LEGARE !

risultato :

-[AUMENTA KM] perche riduce l affinita !

RIDUCE AFFINITA

-VMAX non cambia (ki' non rilevante)

.[NON COMPETITIVI ]

normali:

-L inibitore si lega in un altro sito attivo dell enzima . Questo causa un cambiamento

conformazionale nel sito attivo dell enzima dedicato al substrato . il SUBSTRATO SI LEGA MA L

ATTIVITA ENZIMATICA E COMPROMESSA .

misti : [IL CAMBIAMENTO CONFORMAZIONALE RIDUCE UN PO L AFFINITA e quindi causa un

cambiamento di KM]

.IL COMPLESSO [PUO ESISTERE IN FORMA TERZIARIA ! ] -->

[ENZIMA+INIBITORE+SUBSTRATO ]

.AGISCE [RIDUCENDO LA VMAX]

--> dipendenza sia da nuova KI(KM) sia da nuova KI'(Vmax)

.[ACOMPETITIVI]

---> L'INIBITORE SI LEGA solo quando [ è GIA LEGATO IL SUBSTRATO ] !

.ESISTE FORMA TERNARIA [ESI] MA NON ESISTE [EI] ovvero ENZIMA +INIBITORE senza

SUBSTRATO !

--> [RIDUCE VMAX]

APPARENTEMENTE :[RIDUCE KM] ovvero [AUMENTA AFFINITA ] ma in realta è solo apparenza

: non dipende da KI

-----------------------------------------------

[RIASSUNTO ]

(COMPETITIVI) : [AUMENTANO KM] /non esiste forma TERNARIA

(NON COMPETITIVI)

-normali: [RIDUCONO V MAX]

-misti : [RIDUCONO V MAX] e [AUMENTANO KM] entrambi : ESISTONO IN FORMA TERNARIA

+ in forma [EI]

(ACOMPETITIVI): [RIDUCONO V MAX] +apparentemente riducono KM/ ESISTONO IN FORMA

TERNARIA / NON ESISTONO IN FORMA ENZIMA +INIBITORE senza substrato

--------------------------------------------------

.[INIBIZIONE PER ECCESSO DI SUBSTRATO ]

.puo capitare che TROPPO SUBSTRATO abbia un effetto inibitorio

--> l eccessiva presenza di substrato puo determinare errori di legame nel sito attivo e pertanto

inibizione

---> modifica molto la curva dell enzima che si DISCOSTA DA UNARETTA --> diminuisce all

aumentare di concentrazione del substrato

---------------------------------------

.Quando vi è un INIBITORE LEGATO la curva dell attivita cinetica dell ENZIMA cambia

forzatamente

La presenza dell inibitore modifica i valori di KM tenendo conto anche dei valori di affinita per l

inibitore dell enzima .

KM --> dipende DA KI

V MAX --> dipende da KI'

quindi per

COMPETITIVI : il primo diagramma secondario non ha senso perche [V MAX] è invariata

---> [KI'] non e rilevante

NON COMPETITIVI classici : il secondo diagramma secondario non ha senso perche [KM non

cambia ]

--> [KI] non è rilevante

misti: cambia sia [VMAX ] [sia KM] quindi sono rilevanti sia KI' sia KI

ACOMPETITIVI : il secondo diagramma non ha senso perche [KM ] non cambia

--> [KI] non è rilevante , [KI si] !!!

---------------------------------------------------------------------

-----------------------------------------------------------------------

REAZIONI MULTISUBSTRATO :

.ESEMPIO: substrati A e B ---> danno prodotti P e Q

.Possono coesistere enzimi con prodotti agganciati e o reagenti .

[DIVISIONE ]

.[ENZIMI SEQUENZIALI] --> seguono sequenze di reazione , possono essere : (ORDINATI)-

seguono un ordine preciso di reazione secondo

schema fisso (CASUALI)- non seguono uno schema fisso

importante: SEQUENZIALI : tutti i substrati si legano prima di venire rilasciati (anche solo 1!!)

.[ENZIMI A PING PONG ] --> non coesistono mai due substrati attaccati insieme o due prodotti

attaccati insieme ---> uno si attacca poi si stacca e viene rilasciato , si attacca l altro viene

rilasciato e si riforma enzima di partenza .

--> L enzima CAMBIA DURANTE IL MECCANISMO REATTIVO

ESEMPIO: [PROTEASI A SERINA ] !

---> arriva substrato A , si attacca , modifica enzima [EA] , viene rilasciato , arriva substrato B , si

attacca , modifica enzima [EB] , viene rilasciato , si riforma enzima E

importante: I SUBSTRATI NON COESISTONO INSIEME ma prima se ne lega uno che viene

rilasciato e poi inizia l altro

-----------------------------------

[INIBITORI E ATTIVATORI ALLOSTERICI ] --> modificano la curva di affinita e cambiano la KM

ATTIVATORI ALLOSTERICI : spostano a sinistra la curva RIDUCENDO KM

INIBITORI ALLOSTERICI : spostano a destra la curva AUMENTANDO KM ---> esempio

[BIFOSFOGLICERATO]

---------------------------------------------------------------------------

24-2-2014

[DNA ]

dogma: [DNA]-->[RNA]-->[PROTEINE]

[PURINE]: ADENINA GUANINA ----> doppio anello

[PIRIMIDINE]: CITOSINA TIMINA ---> singolo anello

[BASI]---> sono ESTREMAMENTE IDROFOBICHE

.Esistono in 2 isoforme : [CHETO] e [ENOLICA ]

la forma [CHETO] è decisamente piu stabile ma vi è comunque interconversione tra una e l'altra

[ACCOPPIAMENTI] ---> FISSI : ADENINA-TIMINA (2 legami a idrogeno)

CITOSINA-GUANINA (3 LEGAMI A IDROGENO) --> + DENSO e +

COMPATTO

--------------------------------------------------------

STRUTTURA:

[FOSFATO]-(legato a OH5')-[DESOSSIRIBOSIO]----(legata a 1OH')[BASE AZOTATA]

|

|

C3 OH

.Il Desossiribosio è in POSIZIONE PERPENDICOLARE rispetto alle basi

.I 2 zuccheri sono CON O in posizione OPPOSTA UNO ALL ALTRO ---> uno proiettato in avanti

uno proiettato indietro.

.Il ribosio possiede ancorato al C2 un gruppo OH al posto di un H

---> cio cambia tutte le proprieta della molecola (forma A favorita in rna ad esempio )

-----------------------

ATTENZIONE : zuccheri e fosfato sono [IDROFILICI ]--> formano una protezione (scheletro) per le

basi idrofobiche

-------------------------

[PERCHE IL DNA è A DOPPIA ELICA ?]

.Per impedire a acqua di entrare fra le basi

.Ha scheletro inclinato e basi DISASSATE una rispetto all altra per ridurre al massimo il contatto

con acqua .

RIASSUMENDO: è a doppia elica perchè è la forma solubile con [MENO ENERGIA POSSIBILE ]

e maggiore stabilita'

---------------------

DNA HA 2 SOLCHI:

-[SOLCO MAGGIORE ]---> è la parte dove si recano a "leggere" gli enzimi che leggono il dna

-[SOLCO MINORE] ----> è molto piu inaccessibile

.Qualora vi sia un appaiamento errato lo scheletro si deforma pertanto alcuni enzimi riparatori

riconoscono subito il mismatch e lo riparano .

-[SOLCO MINORE]--> minore complessita strutturale, [NON E INFORMATIVO ], al massimo funge

da regolazione per interazione sterica

-[SOLCO MAGGIORE]--> Ha maggiore complessita ed è [CARICO DI INFORMAZIONI !!]

-----------------------

CONFIGURAZIONI DEL DNA.

.[DNA B]--> forma standard -[10,4 BASI PER GIRO]

.[DNA A ] --> forma "LASSA" -[11 BASI PER GIRO ] --> struttura preferita dall RNA a causa del

OH sul ribosio in piu in posizione 2 che ha un ingombro sterico diverso ---> non puo essere

impacchettato piu di tanto

.[DNA Z]--> forma ultracompatta TRANSITORIA [12 BASI PER GIRO ] -DEFORMATA e molto

instabile

---> [SINISTRORSA !!!!]

---> perche si formi questa forma instabile vi deve essere composizione [GC GUANINA+CITOSINA

] senno non si forma

---> per averlo in soluzione serve la presenza di [3'METILCITOSINA ] ---> la citosina METILATA è

piu stabile e accetta anche questa forma disordinata meno stabile in soluzione

.dovuta sostanzialmente al passaggio della [guanina] da [TRANS ] a [CIS] e quindi la formazione di

un elica SINISTRORSA (per questo servono almeno 2 coppie di basi)---> e una forma

estremamente sfavorita !

---> [le basi allo stato brado tendono a stare in TRANS ]

-----------------------

.Quando 2 singole eliche sono poste in soluzione si possono incontrare e si ha [DIFFICOLTA ] nel

primo appaiamento per poi procedere in modo sempre piu semplice alla [RINATURAZIONE ]

grazie a meccanismo [COPERATIVO ]

.Se hanno tutte regioni uguali tranne una diversa il risultato è che si appaieranno fino a li per poi

lasciare una parte a singola elica

---> se voglio evitare la formazione di questi ibridi

1[INNALZO LA TEMPERATURA ] per poi farla scendere fino a che non si appaiano SOLO LE

DUE EMIELICHE COMPLEMENTARI

2[ABBASSO DI BOTTO ]la temperatura in modo da evitare che si rinaturino anche quelle non

complementari .

.[TM]---> temperatura alla quale ho il 50% di molecole DENATURATE e il 50% di RINATURATE

----> Da DNA DENATURATO a DNA a DOPPIA ELICA --> cambia L ASSORBANZA DEI RAGGI

UV

--> il dna [DENATURATO ] mostra ----> [EFFETTO IPERCROMICO ]--> ci sono piu movimenti

possibili per i raggi per colpire le basi e l assorbanza e maggiore

.Tramite [TM ] e [EFFETTO IPERCROMICO ] riesco a identificare la composizione del DNA e se

ho molecole diverse . (legami a idrogeno e composizione CG)

---------------------------

LE TOPOISOMERASI

.[TOPOISOMERASI II]

---> ha funzione di [SEPARARE 2 GENOMI DOPO LA REPLICAZIONE ]

.si pensi ad esempio a due plasmidi che senza questo enzima resterebbero AGGANCIATI

.[CONSUMA ATP]

---> è essenziale per la replicazione

.[TOPOISOMERASI I]

---> rompe una singola elica e aspetta che il dna effettui un altro giro---> [RIDUCE I GIRI ] e

[RIDUCE TENSIONE TORSIONALE ]

---> [NON CONSUMA ATP ] perche utilizza direttamente energia di tensione torsionale

--> il meccanismo di azione della topoisomerasi I è quello di un [ENZIMA A PING PONG ] in

particolare un [ENZIMA A TIROSINA] in cui il substrato è per due volte di seguito il gruppo OH 3I

SENZA TOPOISOMERASI NON POTREMMO VIVERE perche il DNA resterebbe agganciato (tpII)

o si romperebbe per eccessiva tensione (tp I)

-------------------

.OSSERVARE IL DNA :

-Devo inserire un colorante fra le basi per evidenziarlo

tipico : [BROMURO DI ETIDIO]

---------------------

.Piu DNA ho piu ho probabilita che si verifichino mutazioni

CONSIDERANDO :

.BASI: 1 mutazione su 1010 generazioni

.GENI: 1 mutazione su 105 generazioni

.GENOMI: 1 mutazione su 300 generazioni ---> è molto molto alto .

.vantaggio dell uomo e che le mutazioni possono riguardare INTRONI e non sempre sono

determinanti

.spesso sono variabilita individuali non patogeniche (SNP-CNV ecc)

-----------------------------

PROBLEMA DELLA [3METILCITOSINA]

.ricordarsi che [STABILIZZA LA FORMA Z ] in soluzione , sennò impossibile .(insieme a GC

elevato e [CISGUANINA])

---> il [GRUPPO METILE CH3] è cio che regola moltissimo l espressione del gene durante le fasi

di differenziamento cellulare

IL GRADO DI METILAZIONE E FONDAMENTALE

PROBLEMA:

-CITOSINA quando viene DEAMMINATA ---> si trasforma in [URACILE]--> il meccanismo di

riparazione del DNA la riconosce subito come alterata e la rimuove --> nessun problema

-[CITOSINA 3 METILATA ] quando viene DEAMMINATA ---> si trasforma in [TIMINA ]

--> ENORME PROBLEMA ! Il dna [non la riconosce come errata] e la sostituira a caso nell altro

filamento (guanina o citosina)

RISULTATO : [CITOSINA METILATA ] tende a essere persa ma si conserva perche è situata in

precise zone a fianco dei promotori che sono indispensabili per il differenziamento

[CITOSINA 3 METILATA ] si trova spesso a fianco di [GUANINA ] formando siti [C-G CITOSINA

GUANINA ] a capo dei promotori

---> serve a RIDURRE L ESPRESSIONE e REGOLARE geni coinvolti nello sviluppo

[per questo non viene eliminata dalla selezione] .

SITI CG-->[ prima di promotori] --> [la citosina metilata ha funzione essenziale di inibire la

trascrizione]

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------

26-2-2014

[RNA]

CARATTERISTICHE RISPETTO A RNA :

.[RIBOSIO] con un [OH IN PIU AL C2]

---> questa caratteristica fa si che abbia propieta diverse,ad esempio e completamente

idrolizzabile in ambiente basico

.è piu idrofilico

.la TIMINA e sostituita da URACILE

.l[RNA] tende a dare [CONFORMAZIONE A [ELICA A ]

---> mostra un interazione con proteine [STRUTTURA DIPENDENTE ] e non sequenza dipendente

--> ha una [VARIABILITA ENORME DI CONFIGURAZIONI STERICHE] !!

.Le interazioni avvengono soprattutto per contatto sterico e non tanto per "lettura " di basi

.Esistono [SNRNA] non codificanti che hanno il compito di REGOLARE L ESPRESSIONE DEGLI

MRNA legandosi a loro e IMPEDENDONE LA TRADUZIONE

---> avere MRNA disponibili gia prodotti ma "STOPPATI" rende molto piu veloce una risposta di

traduzione qualora serva , senza dover risintetizzare tutto .

------------------

[RNA] possiede REGIONI CHE RESTANO A SINGOLA ELICA ---> [PSEUDONODI]

--> in questi punti avviene l interazione e il [RICONOSCIMENTO STERICO ] con le proteine

.Esistono [INTERAZIONI NON CONVENZIONALI] a DISTANZA nella stessa molecola tra parti

diverse !

.ha un enorme variabilita sterica ---> è molto piu DINAMICO e ATTIVO rispetto al dna che e solo

un serbatoio

--------------

[tRNA]

--> è il vero tramite tra DNA e AMMINOACIDI

.Avvengono [MODIFICAZIONI POSTTRASCRIZIONALI DELLE BASI ] ---> basi non convenzionali

---> interazioni di forma complessa steriche

esempio:

[AMMINOACILTRNA LIGASI ] riconosce tutti i diversi RNA STERICAMENTE in modo complesso e

non sequenza -specifico.

--------------------

--------------------

[GENI]

.Sono dispersi nel genoma

.hanno sequenze di inizio e fine

ATTENZIONE : [NEGLI EUCARIOTI I GENI NON PRESENTANO VERA E PROPRIA SEQUENZA

DI FINE MA HANNO UNA ZONA DI POLIADENILAZIONE che indica lo STOP del trascritto ]-->

variabile da gene a gene

.[ESONI] e [INTRONI] sono alternati---> informazioni spezzettate

PERCHE ?

---> creazione di isoforme diverse di proteine dal medesimo gene

--> forme alternative dallo stesso trascritto primario

-------------------

Nell mrna gli introni sono rimossi

.Quello che cambia in SPECIE DIVERSE è la DIMENSIONE DEGLI INTRONI!

---> Gli introni hanno un enorme variabilita attraverso le specie

---> permettono di creare piu proteine dallo stesso trascritto primario

.Più aumenta la complessita dell organismo piu aumenta lo "SPEZZETTAMENTO" dei geni con gli

introni --> MAGGIORE VARIABILITA E MAGGIORE ISOFORME POSSIBILI

.+ INTRONI = - RISCHIO DI MUTAZIONI SU TRATTI CODIFICANTI !!!

.Solitamente a ogni [ESONE ] corrisponde un [DOMINIO PROTEICO ] --> essendo intervallati da

INTRONI si possono accoppiare piu [DOMINI] separati per dare proteine con funzioni complesse

GLI ESONI SONO DOMINI : "BLOCCHETTI AUTONOMI"

---------------------------------

.In EUCARIOTI :

-[REGIONI ALTAMENTE RIPETUTE ] --> sono le parti STRUTTURALI dei cromosomi, TELOMERI

e CENTROMERI

--> si osservano soprattutto passando da MONOCROMOSOMA a GENOMI CON PIU

CROMOSOMI.

--> servono piu elementi strutturali

-[REGIONI MEDIAMENTE RIPETUTE ] --> sono le regioni che codificano per PRODOTTI A

CREAZIONE MASSIVA come ad esempio RNA E PROTEINE RIBOSOMIALI che servono in

enorme numero

----> [GENI IN TANDEM ]

-ALTAMENTE RIPETUTE = [STRUTTURALI]

-MEDIAMENTE RIPETUTE = [GENI IN TANDEM] esempio proteine ribosomiali (rna piu

presenti ).

-----------------------------------

[SEQUENZIAMENTO DEL GENOMA UMANO ]

.Sistema usato da universita pubblica :

-PRENDO COPIE DEL GENOMA

-LE SPEZZETTO CASUALMENTE IN PEZZI PIU PICCOLI

-TENTO DI METTERE IN ORDINE QUESTI PEZZI con ENZIMI DI RESTRIZIONE

-LI RISPEZZETTO IN PEZZI PIU PICCOLI E LI CLONO

-OGNI INSIEME DI PEZZETTI DI PESO UGUALE CONTERRA TUTTO IL GENOMA--> perche il

filamento originario e lo stesso

-RIDIVIDO E SEQUENZIO inserendoli in plasmidi per clonarli

.Sistema inventato da CELERA

-PRENDO COPIE

-DIVIDO CASUALMENTE E SEQUENZIO

[PROBLEMA ]---> è difficile sequenziare le SEQUENZE ALTAMENTE RIPETUTE perche non so

quante ripetizioni ci siano quando cerco di ricostruirle--> questo perche si PERDONO NEI

PLASMIDI perche la selezione tende a eliminarle in quanto piu il plasmide e piccolo piu e stabile .

[PROBLEMA II]--> a volte le sequenze non si appaiano e hanno BUCHI---> tramite un

OLIGONUCLEOTIDE MARCATO cerco nel pool frammenti complementari di giunzione e li attacco

se non li trovo mi sposto su piu genomi in cui probabilmente ci saranno (errore casuale si possono

perdere)

RESTANO QUINDI SEQUENZIATE LE SEQUENZE A BASSA E MEDIA RIPETITIVITA , NON LE

STRUTTURALI !

------------------------------

.MAPPA CITOLOGICA : in metafase cromosomi divisi e colorati con colorazione costante

.Le deformazioni cromosomiche mi danno alterazioni genetiche grossolane e evidenti

.Tramite le frequenze di ricombinazione si verificavano le presenze dei geni sul cromosoma in

modo grossolano

---> questa pero non e una mappatura fisica perche dipende dalla velocita di ricombinazione

---> associando [MAPPA CITOLOGICA] a [MAPPA FISICA] con [PROTEINA FISH] riesco a

identificare dove siano determinate sequenze e vedere se sono stati commessi errori!

-------------------------------------------------------------------

3-3-2014

[MAPPA FISICA]= Posizione precisa dei frammenti sul DNA

[MAPPA CITOLOGICA]= tramite BANDEGGIO convenzionale trovo posizione fissa di

macrosequenze sui cromosomi in metafase

--> risultato: Se conosco la posizione dei geni marcatori e la frequenza di ricombinazione posso

capire la distanza tra questi e i geni malattia e quindi il comportamento dei geni malattia .

(MA)

.I cromosomi corti ricombinano piu velocemente dei lunghi

.Piu ci si avvicina al CENTROMERO piu RALLENTA frequenza di ricombinazione !

-------------

[TECNICA FISH]--> mette insieme MAPPA FISICA e MAPPA GENOMICA con dei MARCATORI

FISSI ogni 1000 MB

--> cosi facendo posso sapere che ogni tot megabasi vi e un punto fisso , e cosi appaiare mappa

fisica a mappa citologica e frequenza di ricombinazione

--> composta da zone IBRIDATE FISSE.

-----------------

[SEQUENZIAMENTO SEQEUNZIALE STANDARD]---> quello effettuato da consorzio pubblico .

I[FILTRAZIONE]--> il DNA VIENE RIPULITO da frammenti di [DNA BATTERICO] che poteva

contenere in quanto clonato.

II[ASSEMBLAGGIO]--> dei software allineano frammenti in modo grossolano basandosi su

SEQUENZE SOVRAPPONIBILI dei vari singoli pezzetti clonati

---> se mi mancano dei buchi il software lo evidenzia --> [CHROMOSOME WALKING]--> vado a

ibridare quei pezzi su dna di altri genomi --> trovo le sequenze che mi tappino i buchi che

eventualmente posso aver perso

III[MERGING]--> posiziono sequenze sui cromosomi e costruisco mappa

ATTENZIONE ; resteranno in ogni caso [SEQUENZE N] non decodificate --> sono le [SEQUENZE

ALTAMENTE RIPETUTE ] come CENTROMERI E TELOMERI --> si perdono nei plasmidi e non

posso sequenziarle.

---------------------------

(METODI SEQUENZIAMENTO)

[SEQUENZIAMENTO DI SANGER]

.Faccio POLIMERIZZARE su un plasmide un pezzetto di DNA con un OLIGONUCLEOTIDE come

primer a sequenza nota

---> lo faccio però inserendo DIDESOSSINUCLEOTIDI per ogni BASE (in contenitori diversi )--> a

questo punto ogni volta che c e quella base la replicazione si BLOCCA --> se marco questi

DIDESOSSIRIBONUCLEOTIDI posso capire quale era la base per differenza con gli altri

MAX SEQUENZIABILE --> [800 basi] perche se eccedo questo valore la risoluzione diventa troppo

bassa e non riesco piu a capire quale base veniva prima e quale dopo ."impossibile separare per

peso "


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (ordinamento U.E. - 6 anni) (ORBASSANO - TORINO)
SSD:
Università: Torino - Unito
A.A.: 2014-2015

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher eugenio.micheli.9 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Propedeutica biochimica e biologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Torino - Unito o del prof Calogero Raffaele Adolfo.

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