Propedeutica biochimica e biologia molecolare - Appunti

-PRENDO COPIE DEL GENOMA

-LE SPEZZETTO CASUALMENTE IN PEZZI PIU PICCOLI

-TENTO DI METTERE IN ORDINE QUESTI PEZZI con ENZIMI DI RESTRIZIONE

-LI RISPEZZETTO IN PEZZI PIU PICCOLI E LI CLONO

-OGNI INSIEME DI PEZZETTI DI PESO UGUALE CONTERRA TUTTO IL GENOMA--> perche il

filamento originario e lo stesso

-RIDIVIDO E SEQUENZIO inserendoli in plasmidi per clonarli

.Sistema inventato da CELERA

-PRENDO COPIE

-DIVIDO CASUALMENTE E SEQUENZIO

[PROBLEMA ]---> è difficile sequenziare le SEQUENZE ALTAMENTE RIPETUTE perche non so

quante ripetizioni ci siano quando cerco di ricostruirle--> questo perche si PERDONO NEI

PLASMIDI perche la selezione tende a eliminarle in quanto piu il plasmide e piccolo piu e stabile .

[PROBLEMA II]--> a volte le sequenze non si appaiano e hanno BUCHI---> tramite un

OLIGONUCLEOTIDE MARCATO cerco nel pool frammenti complementari di giunzione e li attacco

se non li trovo mi sposto su piu genomi in cui probabilmente ci saranno (errore casuale si possono

perdere)

RESTANO QUINDI SEQUENZIATE LE SEQUENZE A BASSA E MEDIA RIPETITIVITA , NON LE

STRUTTURALI !

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.MAPPA CITOLOGICA : in metafase cromosomi divisi e colorati con colorazione costante

.Le deformazioni cromosomiche mi danno alterazioni genetiche grossolane e evidenti

.Tramite le frequenze di ricombinazione si verificavano le presenze dei geni sul cromosoma in

modo grossolano

---> questa pero non e una mappatura fisica perche dipende dalla velocita di ricombinazione

---> associando [MAPPA CITOLOGICA] a [MAPPA FISICA] con [PROTEINA FISH] riesco a

identificare dove siano determinate sequenze e vedere se sono stati commessi errori!

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3-3-2014

[MAPPA FISICA]= Posizione precisa dei frammenti sul DNA

[MAPPA CITOLOGICA]= tramite BANDEGGIO convenzionale trovo posizione fissa di

macrosequenze sui cromosomi in metafase

--> risultato: Se conosco la posizione dei geni marcatori e la frequenza di ricombinazione posso

capire la distanza tra questi e i geni malattia e quindi il comportamento dei geni malattia .

(MA)

.I cromosomi corti ricombinano piu velocemente dei lunghi

.Piu ci si avvicina al CENTROMERO piu RALLENTA frequenza di ricombinazione !

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[TECNICA FISH]--> mette insieme MAPPA FISICA e MAPPA GENOMICA con dei MARCATORI

FISSI ogni 1000 MB

--> cosi facendo posso sapere che ogni tot megabasi vi e un punto fisso , e cosi appaiare mappa

fisica a mappa citologica e frequenza di ricombinazione

--> composta da zone IBRIDATE FISSE.

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[SEQUENZIAMENTO SEQEUNZIALE STANDARD]---> quello effettuato da consorzio pubblico .

I[FILTRAZIONE]--> il DNA VIENE RIPULITO da frammenti di [DNA BATTERICO] che poteva

contenere in quanto clonato.

II[ASSEMBLAGGIO]--> dei software allineano frammenti in modo grossolano basandosi su

SEQUENZE SOVRAPPONIBILI dei vari singoli pezzetti clonati

---> se mi mancano dei buchi il software lo evidenzia --> [CHROMOSOME WALKING]--> vado a

ibridare quei pezzi su dna di altri genomi --> trovo le sequenze che mi tappino i buchi che

eventualmente posso aver perso

III[MERGING]--> posiziono sequenze sui cromosomi e costruisco mappa

ATTENZIONE ; resteranno in ogni caso [SEQUENZE N] non decodificate --> sono le [SEQUENZE

ALTAMENTE RIPETUTE ] come CENTROMERI E TELOMERI --> si perdono nei plasmidi e non

posso sequenziarle.

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(METODI SEQUENZIAMENTO)

[SEQUENZIAMENTO DI SANGER]

.Faccio POLIMERIZZARE su un plasmide un pezzetto di DNA con un OLIGONUCLEOTIDE come

primer a sequenza nota

---> lo faccio però inserendo DIDESOSSINUCLEOTIDI per ogni BASE (in contenitori diversi )--> a

questo punto ogni volta che c e quella base la replicazione si BLOCCA --> se marco questi

DIDESOSSIRIBONUCLEOTIDI posso capire quale era la base per differenza con gli altri

MAX SEQUENZIABILE --> [800 basi] perche se eccedo questo valore la risoluzione diventa troppo

bassa e non riesco piu a capire quale base veniva prima e quale dopo ."impossibile separare per

peso "

EVOLUZIONE :

[ELETTROFORESI CAPILLARE]

--> stesso principio ma invece che farlo su piastre diverse che ogni volta vengono buttate lo faccio

con [DIDESOSSIRIBONUCLEOTIDI FLUORESCENTI] in tubi messi insieme in un singolo

capillare

--> il metodo è molto piu veloce e efficiente

(SOFTWARE)

.[PHRED]--> analizza qualita dei [singoli picchi] per ogni base assegnando un valore numerico in

base al numero di 0 e quindi alla reale probabilita che la base si trovi li .

---> è importante perche assegna una qualita ai picchi

.[PRAPH]--> è l ASSEMBLATORE , analizzando sequenze sovrapponibili mette insieme tutto

quello che puo, lascia all operatore solo i buchi che non riesce a ricostruire

.[CONSED]--> da una VISUALIZZAZIONE GRAFICA dell assemblato con buchi che l operatore

deve analizzare

CATENA: PHRED-PRAPH-CONSED

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.[QUANTI FRAMMENTI SERVONO PER ESSERE SICURI DI SEQUENZIARE TUTTO IL

GENOMA]

--> vi è un calcolo che lo dice in base alla COPERTURA che vogliamo dare al genoma ,ovvero

quanto deve essere preciso (99.9999% o altro) e quante volte dobbiamo vedere statisticamente

una singola base

COPERTURA A : Nframmenti*lunghezza frammenti /dimensione genoma

e quindi PROBABILITA ---> P= 1-E^-A

con A = numero di volte che devo vedere una singola base

.In caso non patologico una singola base per gli standard attuali si dovrebbe vedere 30x

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[SEQUENZIAMENTO MODERNO DELLA CELERA ]

[SHOTGUN]

TECNICA:

-Divido in pezzetti e sequenzio tutto senza assemblarli prima tramite oligonucleotidi che me ne

possano dare la posizione

-Restano dei buchi

-genero plasmidi [sempre piu GRANDI] e su questi vado a ibridare le sequenze ---> trovero dove

sono contenute e a mano a mano riesco con pezzi sempre piu grandi a individuare le posizioni e

ridurre sempre di piu i buchi

---> non ho bisogno di posizionare le sequenze --> risparmio tempo.

PROBLEMA : sequenze ripetute

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.Il sequenziamento non puo dare posizione precisa di tutte le basi

--> esistono fisiologici SNP

---> molto utile a livello diagnostico

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[MECCANISMO ATTUALE CON UN SOLO SEQUENZIATORE]

.Tutti i primers sono disposti su una piastra

.ci metto del DNA

.si creano PONTI tra i primers

.Inserisco Primers e faccio polimerizzare dal 3Oh

.avviene un AMPLIFICAZIONE con una [PCR] LOCALIZZATA !

--> Faccio polimerizzazione con nucleotidi di colore fluorescente --> in base ai picchi di colore

identifico la BASE.

VANTAGGIO: lavoro con milioni di sequenze insieme

---> notare che ormai si fa un PARAGONE rispetto alla sequenza di riferimento non si deve

sequenziare tutto dall inizio

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.Organismi EUCARIOTI --> hanno enorme RIDONDANZA DEI GENI

.Oltre a un certo livello evolutivo non vi e piu correlazione tra numero di geni e complessita dell

organismo

.La funzione di molti geni e sconosciuta

AUMENTO DI COMPLESSITA = [AUMENTO DI FAMIGLIE GENICHE RAGGRUPPATE ]

--> geni specializzati a livello di tessuto ma della stessa famiglia ESEMPIO : proteina P53 con

isoforme specifiche [P63 EPITELIO] e [p73 EPATICA ]

---> La funzione e sempre la stessa ma sono TESSUTO SPECIFICHE !!!

.Ci sono GENI IN COMUNE a tutti gli eucarioti che fungono da "GENI MODELLO"

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.Buona parte del genoma è non codificante ma non vuol dire che non sia trascritto

---> è trascritto[ ma NON TRADOTTO ]--> serve a creare RNA DI REGOLAZIONE :

-[Trna]

-[Snrna]

-[microRna]

---> regolatori non proteici

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5-3-2014

[INTRONI]--> larga parte del genoma eucariotico 22%

GENE TIPO EUCARIOTICO:

-[REGIONE 5' non TRADOTTA]--> funzione di smistamento e controllo regolazione dell

espressione

-[REGIONE 3' non TRADOTTA]--> funzione STRUTTURALE conferisce STABILITA

STRUTTURA: [ESONI] piccoli e molto intervallati

[INTRONI ] di grandi dimensioni.

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.[GRANDI DUPLICAZIONI]--> parti duplicate e trasposte --> cambiamento di copie del gene

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ATTENZIONE:

.Piu aumentano complessita del genoma eucariotico piu aumentano [GENI NON LETALI] (non

essenziali per la vita cellulare)

alterandoli o bloccandoli sembra che non cambi assolutamente nulla .

.A COSA SERVONO QUINDI?

.Si è osservato che se si [SPENGONO GENI NON LETALI IN MODO COMBINATO ] specialmente

appartenenti alla stessa via o famiglia ---> MUTAZIONE DIVENTA LETALE

.[LE MUTAZIONI SU GENI NON LETALI SI SOMMANO]--> a dare alterazioni che diventano letali

.Meccanismo molto piu complesso che nei procarioti --> esistono VIE ALTERNATIVE per

bypassare quella non funzionante

.[NON E IMPORTANTE IL SINGOLO GENE MA LA SUA ESPRESSIONE INSIEME AGLI

ALTRI ]--> se induco piu "blocchi" non ho piu vie alternative che bypassino quella non funzionante

--> mutazione diventa letale.

[COMPLESSITA=MAGGIOR NUMERO DI VIE ALTERNATIVE]

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.Notiamo che esistono [RNA PIU O MENO RIPETUTI]--->ibridandoli al dna [comeCdna]

.[MOLTO RIPETUTI ] --> [RNA RIBOSOMIALI ] ad elevatissima trascrizione

.[MEDIAMENTE RIPETUTI ] --> [GENI HOUSEKEEPING] per funzioni essenziali cellulari

.[POCO RIPETUTI] --> [GENI DI ENZIMI REGOLATORI ]--> fattori trascrizionali e attivita

regolative

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.Il DNA che non è introne ed ESONE che cosa è ?

.SEQUENZE RIPETUTE

---> GENERATE DA [CROSSING OVER INEGUALE ]

Puo accadere che si effettui un crossing over ineguale tra due cromatidi qualora essi abbiano

sequenze ripetute e molto simili e quindi l appaiamento puo essere impreciso e shiftare

---> RISULTATO [CROSSING OVER INEGUALE]--> aumentano copie di un gene su un

cromosoma e diminuiscono sull altro

---> è una [VARIAZIONE DEL NUMERO DI COPIE ]

.Questo fenomeno puo o PROTEGGERE DA PATOLOGIE o INDURLE , ma non lo sappiamo con

certezza ---> MUTAZIONI MULTIFATTORIALI che determinano fattori di rischio ancora sconosciuti

!

.[PSEUDOGENI]--> sono geni TRASCRITTI in RNA e REINTEGRATI nel genoma --> [NON

SONO FUNZIONALI] non hanno promotore e non possono essere trascritti --> [INATTIVI]

FUNZIONE : [STRUTTURALE] o forse regolativa ma non producono alcun prodotto perche non

possono essere tradotti

(ESEMPIO)

.I geni delle GLOBINE sono organizzati in [CLUSTER] ovvero [insiemi di geni MOLTO SIMILI TRA

LORO ](FAMIGLIA !)

PROBLEMA : questa zona è soggetta a [CROSSING OVER INEGUALE ] perche i geni sono molto

vicini localizzati e simili tra loro (differiscono per pochi amminoacidi )

---> rischio di mutazione (recessiva)

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