Propedeutica biochimica e biologia molecolare - Appunti

[POLIPEPTIDI] divisi in

.Globulari ---> Enzimi di solito con funzione tredimensionale definita

.FIBRILLARI ---> hanno funzione strutturale e solitamente si trovano all esterno cellulare .

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[AMMINOACIDO GENERICO ]

H

COOH-C-NH2

|

R ---> La catena laterale ne determina le proprieta chimiche e fisiche

. La catena laterale NON è IMPIEGATA nei legami PEPTIDICI e nelle ELICHE !

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[AMMINOACIDI ]

.Alifatici ---> Posseggono una catena ALIFATICA di carboni ATTACCATA COME R .

GENERALMENTE --> + è lunga la catena + è IDROFOBICO e insolubile l amminoacido

.[GLICINA ] ha un [H] come R ---> è l amminoacido dal MINORE INGOMBRO STERICO .--> ha

caratteristiche particolari.

.[PROLINA ] è L amminoacido con [MAGGIORE IMMOBILITA ] --> è sostanzialmente

[IMMOBILE ] --->

presenta legame FISSO perche è ETEROCICLICO

---> L azoto NON PUO RUOTARE rispetto al legame col carbonio --> immobilita pressoche

assoluta . --> opposto di [GLICINA ] --->Legame fi inibito

.Gli amminoacidi idrofobici tendono a essere esposti ALL INTERNO DELLA CELLULA

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[CARICHI] --> sono esposti ALL ESTERNO della proteina e FAVORISCONO LA SOLUBILITA

DELLA PROTEINA .

[ACIDO ASPARTICO ACIDO GLUTAMMICO ] --> [-]

[LISINA ARGININA ISTIDINA ] ------> [+]

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[POLARI ] --> possiedono uno o piu gruppi POLARI che ne favoriscono solubilita .

[SERINA TREONINA ASPARAGINA GLUTAMMINA CISTEINA TIROSINA ]

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Quelli contenenti GRUPPI AROMATICI (triptofano W ad esempio ) tendono a essere molto meno

solubili .

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[LEGAME CARBOAMMIDICO ]

---> Presenta una doppia forma

I APOLARE R-C=O

\Nh2

II POLARIZZATA r-C-o

\\

Nh3+

---> Questo è dovuto al legame peptidico che è [PLANARE ] con [ANGOLI RIGIDI ] ed è una forma

intermedia tra un legame doppio e un legame semplice .

fenomeno [DELOCALIZZAZIONE ENERGETICA ] --> non permette liberta di movimento

.Quando due amminoacidi sono legati GLI UNICI MOVIMENTI CONCESSI SONO :

-Angolo F(FI) C-NH

-Angolo P (PSI) C-C

La rotazione diversa non è consentita

--> quando si forma il polipetptide crolla la liberta di movimento --> questo determina la

conformazione che possono assumere gli amminoacidi

IMPORTANTE: non si puo determinare solo conoscendo la sequenza la conformazione del

legame tra amminoacidi considerando le rotazioni --> Serve una misura sperimentale .

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[CONFIGURAZIONI DEL LEGAME PEPTIDICO ]

---> Il legame peptidico tende a configurarsi in [TRANS ] perche mantiene le catene laterali piu

distanti e quindi con meno interazioni ---> L energia è piu bassa e la forma per quasi tutti gli

amminoacidi e[ 1000 volte piu stabile]

[PROLINA ]--> a causa della sua struttura molto immobile ha solo [4 ordini ] di grandezza di

stabilita che variano da forma CIS a forma TRANS --> Spesso viene inserita in catena per

terminarla o per cambiarne il giro

---> esistono enzimi [PROLINAISOMERASI ] --> che isomerizzano la prolina da [CIS ] a [TRANS ]

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[il PKA della molecola ] --> Definisce la solubilita

.L amminoacido DIPENDE DAL PH della soluzione

.Quando ha carica 0 si definisce [ZWITTERIONE]

--> PH DEL PUNTO ISOELETTRICO --> PKA1+PKA2/2

---> Nei [polipeptidi ] e [proteine ] e misurato sperimentalmente perche sarebbe impossibile

determinarlo a livello teorico .

Come si fa ?

[ELETTROFORESI ] --> Molecole immerse in un GEL che ne impedisce la libera diffusione ,

sottoposto a un CAMPO ELETTRICO con posizioni di PH

---> Le proteine migrano e SI FERMANO al loro [PUNTO ISOELETTRICO ] --> Riesco cosi a

separarle

[ELETTROFORESI ] --> Diagnosi di patologie !!!

---> ESEMPIO : Se faccio un elettroforesi con il plasma riesco a determinare la presenza e i valori

delle proteine ---> riesco a comprendere se paziente ha un infiammazione primaria (A2 elevate) ,

se continua (cresce il picco di GAMMA GLOBULINE )

-Mi rendo conto se SCOMPAIONO gamma globuline --> Patologie epatiche

.Sindrome nefrosica /cirrosi epatica .

ESEMPIO : Analizzando il liquido delle cavita nasali mi accorgo se è presente LIQUOR (e ci sono

state fratture che non si sono potute evidenziare mediante TAC ) dalla presenza di una proteina

presente solo nel liquor

---> ASIALOTRANSFERRINA --> Mediante elettroforesi la evidenzio --> FRATTURA

[RINOLIQUORREA ] e [OTORINOLIQUORREA ]

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SOLUBILITA PROTEINE

. TRIPTOFANO W --> All [APICE dell insolubilita] perche doppio anello aromatico

.Glicina è particolare e resta nel mezzo --> Ha catena R corta e PARZIALMENTE POLARE ( e un

idrogeno )

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[STRUTTURA PRIMARIA ]

---> Puo accadere che il cambiamento di un solo amminoacido abbia un effetto drammatico

(anemia falciforme )

---> Non sempre il cambiamento di un amminoacido ha un effetto drammatico ! --> la struttura

funzionale puo non esserne alterata

--> ESEMPIO [INSULINA VACCINA ] e insulina [SUINA-porcina ] --> hanno sequenza diversa da

quella dell uomo ma sono funzionalmente molto simili

ESEMPIO :

-L insulina di origine sintetica tende in fialetta a AGGREGARSI in ESAMERI --> INIETTATA l

esamero si apre con lentezza e torna in forma monomerica : questo pero rallenta l assimilazione di

insulina e la curva non è la medesima di quella umana

---> SOLUZIONE --> Si sostituiscono [LYS -PRO] nella catena modificando la struttura primaria -->

si determina una variazione e non si complessano piu in esameri .

---> CURVA PARI A QUELLA FISIOLOGICA

la [STRUTTURA PRIMARIA ] è quindi essenziale perche influisce sull interazione

--> ANEMIA FALCIFORME : L emoglobina (dominante negativo ) con un amminoacido sostituito

tende a aggregarsi in DESOSSI e a alterare la forma dei globuli rossi .

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[STRUTTURA SECONDARIA ] --> una struttura piu grande con la quale si costruiscono strutture

ancora piu grandi

[ALFA ELICA ]

[FOGLIETTO BETA ]

[ RANDOM COILS ] --> come un gomitolo sparpagliato a caso --> Spesso sono proteine

DEGRADATE che hanno esaurito la propria funzione .

.Si è osservata tale predisposizione a formare certe forme con :

.[RAMACHARDAN ] --Z Nota andamenti fissi di legame FI C-N e PSI C-C tra amminoacidi

--> Questo vale per tutti gli amminoacidi tranne per la [GLICINA ] --> Essa tende ad assumere tutte

le forme casuali perche ha un enorme potere di mobilita e di rotazione , è la piu instabile

---> a causa di CATENA R piccola

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.Nella struttura secondaria [NON ENTRANO A FAR PARTE LE CATENE -R ] degli amminoacidi

--> è dovuta a AFFRONTO NELLE ELICHE TRA gruppi [COO-] carichi negativamente e [NH3+]

carichi positivamente !

---> Si forma un [LEGAME A IDROGENO ] relativamente debole che mantiene la ALFA ELICA o

FOGLIETTI BETA

.[LA ALFA ELICA E DESTRORSA ] e parzialmente DIPOLARE

CATENE : [N+4] --> forma piu stabile

[N+3] --> CONDENSATA---> PROLINE !!!

[N+5] --> LASSA (punto dove si affrontano COO- e NH3+ )

--> Legami a idrogeno tra NH3+ e COO-

.---> si forma un estremita di elica che ha parziale carica + e un estremita che ha parziale carica -

--> [DIPOLO ]

2 AMMINOACIDI A CAUSA DELLA LORO STRUTTURA TENDONO A NON FARE STRUTTURA

A ALFA ELICA

.[PROLINA ] --> a causa della sua rigidita e della possibilita di isomerare tra [CIS ] e [TRANS ]

--> Viene solitamente inserita per cambiare forma all elica o per interrompere

.[GLICINA ] --> è troppo libera pertanto non riesce a proseguire la struttura alfa elica .

.LE CATENE R RESTANO FUORI

.Se gli amminoacidi hanno catene R molto polari --> tendono a non preferire ALFA ELICA

.Se gli amminoacidi hanno grosso ingombro sterico ---> tendono a non formare ALFA ELICA

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.In base alla carica (polarita o meno ) dell amminoacido nell alfa elica gli amminoacidi hanno

posizioni diverse

---> VERSO FUORI se sono IDROFILICI

---> VERSO DENTRO se sono IDROFOBICI

---> struttura [ANFIPATICA] se hanno una parte polare espressa verso fuori e una parte apolare

espressa verso dentro

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4-2-2014

[FOGLIETTO BETA ]

----> si forma sempre riguardando i LEGAMI A IDROGENO tra C=O e NH

---> non implica le catene laterali R

2 forme :

[ANTIPARALLELO] --> si affrontano estremita NH e COOH in modo sfalsato NH COOH

COOH NH

[PARALLELO] ---> si affrontano estremita in modo uguale NH NH

COOH COOH

.--> I paralleli possiedono SPAZI COSTANTI tra gli amminoacidi

.In base a dove si affacciano e di che tipo sono le catene R (sopra o sotto ) si distinguono foglietti :

-Idrofobico

-idrofilico

-anfipatici (con regione idrofobica dentro e idrofilica fuori )

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Le PROTEINE possono contenere sia ALFA ELICA che FOGLIETTI BETA , è molto raro che

contengano contemporaneamente foglietti BETA PARALLELI E ANTIPARALLELI

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[LOOPS] --> Parti di congiunzione VARIABILI tra ALFA ELICHE o FOGLIETTI BETA

---> Danno MOBILITA ,FLESSIBILITA e permettono di collegare alfa eliche e foglietti beta

.Solitamente sono lunghi pochi amminoacidi ma possono anche essere lunghi in [REGIONE

VARIABILE ANTICORPI]

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La struttura TREDIMENSIONALE deriva dalla necessita di ---> GESTIRE INTERAZIONE CON

AMBIENTE ACQUOSO

[INTERNO DELLA PROTEINA ] ---> PARTE IDROFOBICA [CORE]

[ESTERNO DELLA PROTEINA ] --> PARTE IDROFILICA

Esempio:

[PROTEINA G ] è una proteina [ALFABETA ]

--->si dispongono in modo che la parte INTERNA veda l affacciarsi della parte IDROFOBICA dei

foglietti BETA e delle alfa eliche mentre la parte ESTERNA veda l AFFACCIARSI DELLE CATENE

R POLARI .

--->questo fa si che si crei un [CORE] interno idrofobico protetto da un guscio esterno idrofilico --->

cosi si crea una fossa di legame per il LIGANDO .

[FOLDING]---> ripiegamento tredimensionale della struttura SECONDARIA

----> Se riscaldo le proteine oltre a una certa soglia esse tendono a perdere la loro struttura

secondaria

---->Alcune sono in grado di tornare funzionali da sole,alre no

[INTERAZIONI IDROFOBICHE]--> sono quelle piu importanti che stabilizzano il [CORE INTERNO]

proteico e donano alla proteina struttura funzionale .

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[PONTI DISOLFURO ]

.Si realizzano tra due residui di cisteina

CISTEINA ---> CISTEINA

SH SH -------> CISTINA RSSR ---> PONTE DISOLFURO

.è un legame COVALENTE --> stabilizza molto la struttura

---> perche si formi e assolutamente necessario che le CISTEINE si trovino in una posizione

corretta , senno il legame covalente non si forma

.---> Non sempre sono in grado di riformarsi se rotti , un esempio è INSULINA sintetizzata come

PROTOINSULINA in forma inattiva che forma successivamente ponti disolfuro .

PONTI DISOLFURO :

-[INTRAMOLECOLARi] --> All interno della stessa catena proteica

-[INTERMOLECOLARI ] --> Tra due catene proteiche diverse

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RIASSUMENDO :

[STRUTTURA TREDIMENSIONALE ] ---> .Interazioni idrofobiche del core

. Legami disolfuro

.Capacita di autorigenerare i legami

---> Per assumerla correttamente spesso sono presenti PROTEINE AUSILIARIE che aiutano a

creare la struttura funzionale .

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[SPESSO LA STRUTTURA PRIMARIA NON BASTA A DEFINIRE LA STRUTTURA FUNZIONALE

EFFETTIVA ]

----> SERVONO [FATTORI ADDIZIONALI ]

Possono essere :

-ioni

-metalli

-gruppi organici (EME )

---> La struttura tredimensionale della catena polipeptidica GENERA UN CORRETTO AMBIENTE

CHIMICO FISICO per accogliere il fattore addizionale --> ESEMPIO GRUPPO EME

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Negli eucarioti i polipeptidi sono strutturati in --> [DOMINI FUNZIONALI ]

---> che si conservano e hanno struttura e posizione costante

un esempio :

.[ELIX LOOP ELIX ] ---> è un dominio peptidico molto semplice comune a TUTTE LE PROTEINE

CHE LEGANO CALCIO .

(esempio troponina calmodulina ecc )

.Il legame con il calcio viene mediato da [LEGAMI A IDROGENO ] --> Mediati da ACQUA [h2o]

---> Gli amminoacidi di legame [ELIX LOOP ELIX ] del calcio sono conservati e costanti .

---> in caso di assenza di calcio non si assiste alla formazione di ALFA ELICA---> non si forma

struttura 3D funzionale !!! --> LOOPS continuo o RANDOM COILS

.Esistono altri domini particolari --->

.LE [ALFA ELICHE ] e i [FOGLIETTI BETA ] sono quindi associati in domini particolari e costanti

anche in proteine diverse ,come unita funzionali .

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[STRUTTURA GENERALE ] in ordine di complessita

I[STRUTTURA PRIMARIA ] sequenza amminoacidica necessaria alla formazione di secondaria

II[STRUTTURA SECONDARIA ] legami a idrogeno ALFA ELICA FOGLIETTI BETA [NON

COINVOLTE CATENE -R]

III[STRUTTURA TERZIARIA ] legami a idrogeno [COINVOLTE CATENE -R]

IV[STRUTTURA QUATERNARIA ] interazione fra piu subunita proteiche

.--> La ripetizione di strutture semplici va a formare con domini ripetuti strutture complesse

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ESEMPIO:

[CHIMOTRIPSINA ]

.è un enzima piuttosto generico che non ha funzioni specifiche , degrada proteine .

--> se alla chimotripsina aggiungiamo DOMINI SPECIFICI --> esso puo diventare sempre piu

[SPECIFICO]

[MEDIANTE DOMINI DIVERSI CREO STRUTTURE FUNZIONALI DIVERSE SEMPRE PIU

SPECIFICHE ]

[CAMBIARE DOMINIO=CAMBIARE FUNZIONALITA ]

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.le [MUTAZIONI PIU GRAVI per la struttura terziaria sono quelle che avvengono a livello di

amminoacidi che formano il [CORE IDROFOBICO ] della proteina --> esso fornisce l impalcatura

per la struttura funzionale

.Le mutazioni di amminoacidi in superficie hanno basso impatto sulla conformazione funzionale

della proteina .

--> Gli amminoacidi localizzati sulla superficie hanno basso impatto sulla struttura funzionale e

possono differire anche nella stessa proteina umana

---> il [CORE] è la struttura piu importante

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[PROTEINE BASATE SU ALFA ELICHE ]

.Proteine di trasporto

.Proteine di membrana

.Proteine strutturali (collagene )

-struttura [COILED COIL ]

--> Basata su [2 ALFA ELICHE ] che si avvolgono una sull altra

.Il passo dell elica invece che essere ogni [3.6 amminoacidi ] si trova a essere ogni [3.5

AMMINOACIDI]

---> OGNI [7 AMMINOACIDI ]VI è una [LEUCINA ] che si affaccia a una altra [LEUCINA ]

formando un [LEGAME IDROFOBICO ]che stabilizza l elica

--> chiamata anche [LEUCIN ZIPPER ]---> legame APOLARE E IDROFOBICO

.All interno sono quindi esposte le catene -R IDROFOBICHE che formano legami idrofobici per

tenere insieme l elica

[COILED COIL]--> [Passo a 3.5 amminoacidi][Ogni 7 si affrontano due LEUCINE] [LEUCIN

ZIPPER ]

.Le catene R POLARI sono esposte all esterno ---> questo consente di creare una struttura con

GUSCIO POLARE ESTERNO che protegge un [CORE INTERNO IDROFOBICO] che minimizza il

contatto con l acqua

.[CHERATINE ]

---> non sono piu sufficienti i DIMERI COILED COIL ---> essi si compattano e formano

MIOFIBRILLE sempre piu compatti grazie a questa struttura ---> tramite [gruppi terminali NH e

COOH ]

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[COLLAGENE ]

.STRUTTURA A [TRIPLA ELICA ]

. STRUTTURA : GLICINA X Y GLICINA X Y

---> [GLICINA ] + [IDROSSIPROLINA ] + [IDROSSILISINA ]

STRUTTURA :

-I LIVELLO [GLICINA ] --> amminoacido piu mobile , forma legami a idrogeno TRA LE ELICHE e

non su elica singola AFFACCIANDOSI tra un elica e l altra . (legami idrogeno intermolecolari C=O

e NH)

-II LIVELLO [IDROSSIPROLINA ] --> amminoacido piu rigido e immobile , impacchetta le eliche

consentendo alle GLICINE di trovarsi in posizione fissa per fare i legami a idrogeno intercatena

--> La prolina è IDROSSILATA per fornire [STABILITA TERMICA ]

--> senza idrossiprolina non vi è stabilita termica

.III LIVELLO [IDROSSILISINA ] --> FORMA [BASI DI SHIFF]e [LEGAMI ALDOLICI ] e stabilizza

con [LEGAMI COVALENTI ] ulteriormente le eliche di collagene ---> funzione di [CROSSLINKS

COVALENTI ] che stabilizza la struttura !

--->sua assenza o riduzione anomala : [sindrome di DANSON ]

FORMAZIONE DEL COLLAGENE VERO E PROPRIO :

.struttura a singola elica G X Y glicina idrossiprolina idrossilisina

. i [COOH] terminali hanno una particolare [GLICOSILAZIONE ] che mantiene ancorato un capo

della treccia mediante [LEGAMI COVALENTI DISOLFURO ]

---> Questo fa si che la treccia si possa formare (3 eliche )

.All esterno della cellula daranno poi origine a COLLAGENE VERO E PROPRIO mediante

rimozione dei gruppi cooh terminali glicosilati(telopeptidi)

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MALATTIE LEGATE AL COLLAGENE :

.Artrite reumatoide

.Osteogenesi imperfetta (malattie proteolitiche del collagene )

.SINDROME DI EHLERS DANSOn --> difetto di crosslinking dell IDROSSILISINA (pelle molto

molto elastica perche collagene poco stabilizzato )

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[STRUTTURA COMUNE DELLE GLOBINE DI TRASPORTO DI ELETTRONI ]

[GLOBULINE ]

(tipicamente citocromi )

---> [SOLO ALFA ELICHE ! ]

Struttura a 4 ALFA ELICHE inserite tra loro in modo diverso avvolgendosi

---> creano un [GLOBULO IDROFOBICO (catene R apolari esposte )] in cui si inserisce il cofattore

di trasporto

ESEMPIO : [MIOGLOBINE] e [EMOGLOBINE ]

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[IMMUNOGLOBULINE ]----> ESCLUSIVAMENTE [FOGLIETTI BETA ]!!!

.Possiedono [2 CATENE LEGGERE] e [2 CATENE PESANTI ]

---> sono tenute insieme fra loro da [LEGAMI DISOLFURO ]

.Possiedono una [REGIONE COSTANTE ] che è costante per ogni immunoglobulina di categoria

.Possiedono una [REGIONE VARIABILE ] che varia per ogni singola immunoglobulina e consente

un legame doppio con antigene

[IGM - IGG] coinvolte in risposta immunitaria

[IGM] PENTAMERICHE ---> in seguito a risposta primaria si trasfor