Appunti Biochimica avanzata, seconda parte - anno 2024/25

REGOLAZIONE DEL CALCIO

Passando ora alla regolazione della concentrazione di calcio intracellulare, è importante

sottolineare che la concentrazione di calcio tra l'interno e l'esterno della cellula differisce di

circa 10.000 volte, ovvero quattro ordini di grandezza di differenza fra la concentrazione di

calcio libero intracellulare, che è circa 0,1 micromolare (100 nanomolare), e quella

extracellulare, che si aggira intorno ai 2 millimolari. Questo implica una differenza di circa 4

ordini di grandezza, ovvero 10.000 volte, tra la concentrazione di calcio libero intracellulare e

quella extracellulare.

È importante notare che il calcio intracellulare è presente non solo in forma libera, ma anche

legato ad altre molecole. Quindi, quando si parla di calcio libero intracellulare, si fa

riferimento alla frazione di calcio non legata a proteine o altre molecole, mentre la forma

legata sarà descritta in seguito.

In condizioni di cellule a riposo o non stimolate, la concentrazione di calcio intracellulare è

nell'ordine di grandezza di 100 nanomolari, mentre all'esterno della cellula la concentrazione

è molto più alta, come accennato in precedenza.

Il calcio libero viene mantenuto a livelli molto bassi per diversi motivi. In primo luogo, se la

concentrazione di calcio fosse troppo alta, potrebbe formarsi sali insolubili, come i fosfati di

calcio, che potrebbero compromettere la funzione cellulare. I fosfati inorganici sono

fondamentali per la produzione di energia nelle cellule, e la loro concentrazione deve essere

mantenuta a livelli costanti.

Se il calcio fosse presente in concentrazioni superiori a quelle fisiologiche, si formerebbero

inevitabilmente fosfati di calcio insolubili, che ridurrebbero la disponibilità di fosfato

inorganico libero, essenziale per il mantenimento del sistema di produzione energetica.

Inoltre, livelli elevati di calcio attiverebbero proteasi sensibili al calcio che potrebbero indurre

la morte cellulare.

Il mantenimento di bassi livelli di calcio libero è stato favorevole nell'evoluzione, poiché ha

permesso al calcio di essere utilizzato come secondo messaggero in numerosi processi

cellulari, tra cui la segnalazione intracellulare.

Anche se la concentrazione di calcio totale a livello intracellulare è dell'ordine dei millimolari,

questo valore include anche il calcio legato. È importante sottolineare che il calcio libero, pur

essendo presente in quantità molto ridotte, gioca un ruolo centrale nella cellula, mentre le

forme di deposito di calcio all'interno della cellula sono notevolmente elevate.

Il calcio viene sequestrato in vari organelli cellulari, inclusi organelli come il reticolo

endoplasmatico ei mitocondri, e viene anche legato a proteine che fungono da sistema

tampone per il calcio. Inoltre, può essere legato a fosfolipidi, che contribuiscono al suo

stoccaggio.

La determinazione della concentrazione di calcio intracellulare viene effettuata oggi

utilizzando sonde fluorescenti, che modificano il loro spettro di assorbimento o di emissione

in risposta a diverse concentrazioni di calcio. Queste sonde possono quindi essere utilizzate

come sensori fluorescenti per il calcio, permettendo di tracciare la concentrazione di calcio

in modo sia quantitativo che qualitativo, morfologico e, attraverso l'uso della microscopia a

confocalità laser, anche in tempo reale. Questa tecnica consente di monitorare le variazioni

della concentrazione di calcio in tempo reale, localizzandole nei diversi compartimenti

cellulari.

Seguire le variazioni spaziali e temporali della concentrazione di calcio è di fondamentale

importanza dal punto di vista sperimentale. La molecola utilizzata per monitorare queste

variazioni, che vedremo più dettagliatamente in seguito, è il Fura-2 o il Fura-3 , che sono

coloranti fluorescenti. Questi coloranti, quando legano il calcio, modificano il loro spettro di

eccitazione e di emissione. In questo modo, passando attraverso una specifica lunghezza

d'onda di eccitazione e misurando l'emissione risultante, è possibile valutare la

concentrazione di calcio intracellulare.

È importante notare che il Fura-2 e il Fura-3 sono molecole, in forma non esterificata, non

sono permeabili alla membrana cellulare. Tuttavia, quando esterificate, queste molecole

diventano lipofile e possono essere facilmente introdotte all'interno della cellula. Una volta

dentro, l'azione di esterasi interni alla cellula permette di rimuovere il gruppo estere,

liberando il colorante attivo che può interagire con il calcio intracellulare e permettendo la

misurazione della sua concentrazione.

Esistono diversi sistemi di trasporto che contribuiscono a mantenere bassa la concentrazione

di calcio libero intracellulare. Il primo e più noto di questi è il calcio ATPasi (Ca²⁺-ATPasi), in

particolare quella localizzata nel reticolo endoplasmatico e sarcoplasmico, che gioca un

ruolo cruciale nel mantenimento delle basse concentrazioni di calcio all'interno della cellula.

Quando si parla di reticolo endoplasmatico , si fa riferimento a una struttura presente in tutte

le cellule dell'organismo. Tuttavia, quando si parla di reticolo sarcoplasmatico (o

sarcoplasmatico ), ci si riferisce specificamente a questa struttura nelle cellule muscolari. Il

reticolo sarcoplasmatico (SR) è il compartimento che immagazzina il calcio all'interno delle

cellule muscolari.

Un esempio importante di proteina associata al reticolo sarcoplasmatico è la SERCA

(Sarcoplasmic/Endoplasmic

Reticulum Calcium ATPase), una

ATPasi che si trova nella

membrana del reticolo

sarcoplasmatico e che è

responsabile del trasporto del

calcio all'interno del reticolo,

contro il suo gradiente di

concentrazione, utilizzando

l'energia derivata dall'idrolisi di

ATP. La SERCA è una proteina

ATPasi di tipo P, che funziona

attraverso un meccanismo di

fosforilazione e de-fosforilazione,

essenziale per il suo

funzionamento.

La PMCA (Plasma Membrane Calcium ATPase) è un'altra ATPasi di tipo P, che ha una funzione

simile alla SERCA, ma si trova nella membrana plasmatica delle cellule. La PMCA è anch'essa

responsabile del trasporto del calcio, ma in questo caso il calcio viene pompato fuori dalla

cellula, contribuendo a mantenere bassi i livelli di calcio intracellulare. Sia la SERCA che la

PMCA utilizzano ATP per eseguire il loro lavoro e sono fondamentali per il mantenimento di

basse concentrazioni di calcio nel citosol.

Entrambe queste ATPasi appartengono alla famiglia delle ATPasi tipo P , che si caratterizzano

per un meccanismo di fosforilazione/de-fosforilazione di un residuo di aspartato durante il

loro ciclo di funzionamento. Questo meccanismo è evolutivamente conservato e

fondamentale per il loro ruolo nel trasporto ionico.

L' aspartato , che ti ricordo ha una catena laterale contenente un gruppo acido, è coinvolto

nel meccanismo di fosforilazione. Il gruppo carbossilico è in grado di formare un legame a acil

fosfato con un gruppo fosforico, creando un legame ad alta energia, che consente il

trasferimento del gruppo fosfato. Questo meccanismo è fondamentale per l'attivazione di una

proteina energizzata, che a seguito di fosforilazione cambia conformazione, e questa

modifica provoca l'estrusione degli ioni, come il sodio contro ioni potassio attraverso la

membrana. Questo processo rende la proteina elettrogenica.

Proteine come la Na⁺/K⁺-ATPasi (pompa sodio-potassio) presentano un meccanismo simile e

svolgono un'azione analoga. Queste pompe sono dotate di una parte catalitica che è

costituita da una singola catena polipeptidica di circa 110 kDa. La catena ha dieci motivi ad

alfa elica trasmembrana e presenta una regione che può essere fosforilata, cioè un residuo di

aspartato che può essere fosforilato come parte del meccanismo di funzionamento.

La stechiometria di queste proteine è diversa: nel caso della SERCA

(Sarcoplasmic/Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase), due ioni calcio vengono pompati

all'interno del reticolo endoplasmatico o sarcoplasmatico per ogni molecola di ATP

idrolizzata. Nel caso della PMCA (Plasma Membrane Calcium ATPase), invece, un singolo ione

calcio viene pompato fuori dalla cellula per ogni molecola di ATP consumata.

Perché esiste questa differenza di stechiometria? La differenza potrebbe dipendere dalla

termodinamica e dall'energia coinvolta nel processo. La SERCA, che trasporta due ioni calcio

per ogni ATP, è coinvolta in un processo in cui il calcio viene pompato contro un gradiente di

concentrazione molto elevato (dal citosol verso il reticolo endoplasmatico), e quindi richiede

più energia per ogni unità di calcio trasportato . La PMCA , d'altro canto, trasporta solo un

singolo ione calcio per ogni ATP, ma il trasporto avviene contro un gradiente diverso (dalla

cellula verso l'esterno), che potrebbe essere meno dispendioso energeticamente rispetto al

trasporto all'interno del reticolo.

Ciò significa che il trasferimento di calcio all'esterno della cellula richiede uno sforzo

maggiore rispetto al trasferimento all'interno del reticolo, e questo è dovuto alla differenza

nelle concentrazioni di calcio. All'interno del reticolo, la concentrazione di calcio libero è di

circa 100 micromolari, mentre nel citosol è di 100 nanomolari. Quindi, la differenza tra le due

concentrazioni è di soli tre ordini di grandezza, rispetto ai quattro ordini di grandezza che si

osservano tra la concentrazione di calcio extracellulare (nell'ordine dei millimolari) e quella

intracellulare.

Ciò implica che, a parità di energia, la proteina ha energia sufficiente per trasferire due ioni

calcio all'interno del reticolo, ma solo uno all'esterno della cellula. Quindi, la differenza non è

dovuta solo alla stechiometria della proteina, ma è principalmente una questione energetica

e termodinamica. In altre parole, la proteina deve fare uno sforzo maggiore per estrudere il

calcio all'esterno della cellula piuttosto che pomparlo dentro il reticolo, poiché la

concentrazione di calcio libero all'esterno è maggiore (nell'ordine dei millimolari) rispetto a

quella interna (nell’ordine dei nanomolari).

Anche se quantitativamente nel reticolo c'è una quantità notevole di calcio, questo è

principalmente legato a proteine che sono espresse nel reticolo endoplasmico e che

contribuiscono a mantenere bassa la concentrazione di calcio libero dal lume del reticolo. Si

tratta sempre di ATPasi di tipo P, in particolare calcio ATPasi, che sono proteine trasportatrici

di calcio con diverse caratteristiche e stechiometrie.

Un altro trasportatore di calcio che permette di estrudere ioni calcio all'esterno della cellula è

l' a