Appunti Biochimica applicata 2024

TECNICHE IMMUNOCHIMICHE

Gli an corpi vengono u lizza come «reagente» per iden care «l’an gene» solitamente in una miscela

complessa, grazie alle grandi speci cità ed a nità di legame.

Alcune tra le più comuni tecniche immunochimiche sono:

- Saggi di precipitazione e agglu nazione

- Dosaggi immunologici

- Immunoistochimica e Immuno uorescenza (IHC/IF)

- Cito uorimetria

- Western blot (WB)

Saggi di precipitazione e agglu nazione

Si basano sulla possibilità che, in ada e condizioni sperimentali, si può o enere la formazione di re cola

tra Ag e Ab che formano una sorta di precipitato.

Saggi di precipitazione: I complessi Ag-Ab si formano generalmente in una matrice solida (es. agar) o

acquosa, in corrispondenza della zona di equivalenza, dando luogo a precipita macroscopicamente visibili

o separabili.

Saggi di agglu nazione: I complessi Ag-Ab si formano generalmente in soluzione acquosa ma u lizzano

carrier sinte ci (par celle di polis rene, la ce) o biologici (eritroci , ba eri) a cui sono lega gli Ag per

evidenziare il legame con gli Ab a raverso la produzione di un complesso agglu nato.

Saggi di precipitazione

- Saggi di immunodi usione:

• Immunodi usione radiale semplice (metodo di Mancini)

• Immunodi usione doppia (metodo di Ouchterlony)

- Saggi di immunoele roforesi:

• Immunoele roforesi quan ta va (rocket ele roforesi)

• Immunoele roforesi bidimensionale

- Saggi di immunoprecipitazione in soluzione:

• Co-immunoprecipitazione (Co-IP)

• Immunoprecipitazione della croma na (Chroma n Immunoprecipita on, ChIP)

• Immunoele roforesi bidimensionale

Immunodi usione radiale semplice (metodo di Mancini)

Viene u lizzato un agar solidi cato che ha al suo interno l’Ab per l’an gene da testare.

Si fanno dei pozze nei quali si aggiunge il campione da testare per l’Ag.

Aiutandosi con una curva di taratura si stabilisce la concentrazione dell’Ag nel campione in base all’anello di

immunoprecipitato che si viene a formare.

Immunodi usione doppia (metodo di Ouchterlony)

Viene u lizzato un agar solidi cato ma senza Ab al suo interno.

Si fanno dei pozze nei quali si aggiunge o l’Ab per l’Ag da testare, o il campione con l’Ag (o più di un

campione o più di una diluizione).

Se presente, l’Ag produrrà un complesso di immunoprecipitato al punto di equivalenza con l’Ab (si può

evidenziare meglio con blu di Coomassie).

Immunoele roforesi quan ta va (rocket ele roforesi)

Viene u lizzato un agar solidi cato che ha al suo interno l’Ab per l’an gene da testare.

Si fanno dei pozze nei quali si aggiunge il campione da testare per l’Ag.

Se il gel di agar ha un pH pari a 8,3 allora mol Ag avranno carica nega va, mentre gli Ab saranno neutri

perché al loro punto isoele rico.

Si applica un campo ele rico che fa migrare gli Ag verso il polo posi vo mentre gli Ab rimarranno fermi.

Aiutandosi con una curva di taratura si stabilisce la concentrazione dell’Ag nel campione in base alla

lunghezza dell’arco di immunoprecipitato che si viene a formare.

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Saggi di agglu nazione

U lizzano carrier sinte ci (par celle di polis rene, la ce) o biologici (eritroci , ba eri) a cui sono lega gli

Ag.

- Saggi immunoturbidimetrici

- Saggi di emoagglu nazione

• test di Coombs dire o

• test di Coombs indire o

- Saggi di inibizione dell’emoagglu nazione

- Immunoprecipitazione con:

• resine di a nità

• biglie immunomagne che

Saggi immunoturbidimetrici

Gli an corpi secondari sono lega a carrier che me ono in risalto la formazione dell’immunoprecipitato che

cambia l’assorbanza del campione da analizzare per via del cambio di torbidità.

Esempio: misura della Calprotec na (marker in ammazione) nelle feci.

Saggi di emoagglu nazione:

Test di Coombs

E’ un’indagine biochimica clinica che mira a valutare la presenza di speci ci Ag sulla membrana degli

eritroci (test di Coombs dire o) o speci ci Ab presen nel siero dei pazien (test di Coombs indire o).

Il carrier è l’eritrocita.

U lizzato, per esempio, per:

- mala a emoli ca autoimmune (dire o)

- mala a emoli ca del neonato (dire o). Terapia preven va: Per evitare la formazione di Ab An -D

(fa ore Rh) nella donna dopo la prima gravidanza, vengono somministra degli Ab An -D esogeni che

vadano a legarsi subito verso gli an geni D del feto in modo tale da non sensibilizzare il sistema

immunitario della madre.

- compa bilità gruppi sanguigni nelle trasfusioni (indire o)

La precipitazione con granelli di resina da centrifugare

Il carrier è cos tuito dalle resine di a nità e viene usata la forza centrifuga per separare l’agglu nato dalla

soluzione (sovranatante).

La precipitazione con biglie magne che

Si sfru ano come carrier delle microsfere magne che (de e beads) rives te di polis rene (2,8 micron di

diametro) e poi funzionalizzate. Si aumenta la super cie di interazione. U lizzate spesso nelle separazioni

per a nità per applicazioni di immunoprecipitazione o immunopuri cazione di proteine, acidi nucleici o

anche, e spesso, di cellule (interazione con proteine di membrana).

Dosaggi immunologici

Dosaggi immunologici (o immunodosaggi): Sfru ano la speci cità degli an corpi, e spesso anche la

sensibilità di vari marcatori (enzimi, isotopi, sostanze uorescen ,…), e consentono di quan care una

sostanza an genica, o gli an corpi, presen in un sistema complesso (ad. es. uidi biologici) senza doverli

separare/isolare. Alcuni consentono di fare un’indagine di po qualita vo (LFIA).

Alcune tra le più comuni tecniche di dosaggi immunologico sono:

- Tecniche Immunoradiometriche (o Radio Immuno Assay, RIA)

- Tecniche Immunoenzima che (o Enzyme Immuno Assay, EIA)

• Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)

- Tecniche Immuno uorimetriche (o Fluorescence Immuno Assay, FIA)

- Lateral-Flow Immuno Assay (LFIA)

In base alla metodologia si possono classi care in:

- Compe vi: Ag + Ab / Ag* + Ab. Si aggiunge l’Ag marcato che compete con l’Ag non marcato presente nel

campione. L’Ab speci co è presente in quan tà limitate e l’Ag marcato è usato in una quan tà nota (Es:

RIA).

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- Non compe vi: Ag + Ab*. Si usa un Ab marcato per testare la presenza dell’Ag.

In base alla marcatura d’azione si possono classi care in:

- Marcatura dire a: Ag + Ab*. L’Ab speci co è marcato coniugandolo dire amente con un tracciante

radioisotopico, uorescente o enzima co.

- Marcatura indire a: Ag + 1Ab + 2Ab*. L’Ab primario speci co per l’Ag non è marcato ma viene a sua volta

riconosciuto da un Ab secondario marcato che si lega alla regione costante Fc dell’Ab primario.

- Marcatura assente: Ag + Ab. La rivelazione è macroscopica o rivelata tramite spe rofotometria (mol

saggi di precipitazione e di agglu nazione)

Tecniche immunoradiometriche (o Radio Immuno Assay, RIA)

De anche dosaggi immunoradiometrici. Ag marcato (Ag*) con isotopi radioa vi (Es: I) usato con una

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quan tà nota (si fa una curva di taratura). Compe zione tra Ag e Ag*. Si separano le due frazioni e si

analizza quella con Ag* + Ab misurando la radioa vità. L’Ab può anche essere legato sulla prove a e quindi

la separazione avviene per centrifugazione.

Vantaggi: Sensibile (ordine dei pg/mL), speci co, preciso.

Svantaggi: Pericoloso per la radioa vità (uso e ri u ), reagen labili nella durata, costoso.

Tecniche immunoenzima che (o Enzyme Immuno Assay, EIA)

U lizzano come marcatore un enzima. Dopo o enimento e puri cazione di un an corpo, lo si unisce

covalentemente ad una proteina enzima ca. L’a vità catali ca dell’enzima perme e di ampli care il

segnale anali co (un solo enzima genera mol ssime molecole di prodo o).

Gli enzimi possono catalizzare una reazione per un prodo o:

- Colorimetrico (AP, fosfatasi alcalina +PNPP; HRP, perossidasi di rafano +TMB / +ABTS / +OPD)

- Chemiluminescente (HRP + luminolo)

Dipende dal po di enzima o dal po di substrato fornito.

Per esibire la luminescenza il luminolo deve essere dapprima a vato con un ossidante come H2O2 che si

decompone in ossigeno molecolare e acqua: 2 H2O2 → O2 + H2O

Serve la presenza di un catalizzatore come il ferro. In laboratorio viene usato il ferrocianuro di potassio.

Il ferro può essere quello contenuto nell’emoglobina del sangue per questo mo vo è u lizzato in campo

forense per evidenziare tracce di uidi biologici.

Interferenze: rame e candeggina.

Tecniche immuno uorimetriche (o Fluorescence Immuno Assay, FIA)

U lizzano come marcatore un uoroforo (molecola uorescente). Dopo o enimento e puri cazione di un

an corpo, lo si unisce covalentemente ad una proteina uorescente o un uoroforo.

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)

ELISA: Saggio immuno-adsorbente legato ad un enzima. Nelle tecniche ELISA l’Ag, o l’Ab, vengono fa

adsorbire sul fondo di pozze di piastre mul well (96-well o più) per micro tolazioni, de e anche

«micro ter», o delle strip da 8-well.

I pozze hanno il fondo pia o e non concavo.

Il legame tra Ag e Ab è rivelato a raverso un metodo colorimetrico a raverso la misurazione

dell’assorbanza da un sistema o co (spe rofotometro o colorimetro).

E’ una tecnica quan ta va se si u lizza una curva di calibrazione standard (es.: quan care una proteina in

un terreno di coltura) ma può essere anche qualita va (screening di un allergene in un siero).

E’ molto u lizzata in uso clinico.

Applicazioni comuni dei metodi immunometrici (sopra u o ELISA) in biochimica anali ca clinica.

Determinazione di:

• ormoni nei uidi biologici (sangue, urina, saliva,…)

• proteine «marker» di patologia

• farmaci nel siero e nelle urine (an epile ci, an depressivi, cardioa vi, immunosoppressivi, an bio ci,…)

• droghe d’abuso nei uidi biologici (oppiacei, allucinogeni, cannabinoidi, cocaina,…)

• immunoglobuline nel sangue, IgE e allergeni vari nel siero

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