Approcci scaffold-free

Scaffold free approach.

Il mat serve solo da supporto momentaneo per la produzione di foglietti

cell che verranno poi impiantati da soli nel sito.

- Nel self-organization ho un mat su cui le cell aderiscono, che

supporta la formazione del tessuto, poi grazie a uno stimolo

termico il mat si scioglie e si separa dall aggregato di cell e posso

staccare il foglietto di cell dal mat.

- Nel self-assembly, il mat che fa da substrato non è adesivo

per le cell quindi non fa da supporto ma è solo un contenitore, ma

le cell cercano di aggregarsi tra di loro per minimizzare l

energia libera.

Self assembly:

Self-organisation:

× Servono cell autologhe, altrimenti il sist immun non le riconosce

come self e le rigetta, quindi le devo prelevare dal paziente es con

biopsia, sperando che lo possa fare

× Ci vuole tanto tempo per produrre il foglietto, perché le cell

isolate sono poche quindi le devo prima espandere fino al numero

desiderato e poi posso formare il foglietto. Qunidi non va bene per

un problema urgente

Non ho problemi di risposta immunitaria legata ai materiali

 e perché uso cell autologhe

Usando cell autologhe questa struttura si inserisce con facilità

 all interno del tessuto, perché le cell le riconoscono come

qualcosa di self, quindi si ha una ottima interazione tra cell e

colonizzazione del nuovo tessuto. No suture

Self assembly:

Es. Voglio costruire la tunica media (cell muscolari lisce) e la tunica

avventizia (fibroblasti) di un vaso. Quindi devo ottenere una

struttura tubulare in cui il foglietto con le cell musc sia all interno e

quello con i fibroblasti all esterno:

B) Il metodo standard è quello in cui produco prima i due foglietti

diversi singolarmente, poi li unisco disponendoli uno sopra l'altro, e li

arrotolo attorno a una struttura cilindrica

C) Posso produrre un foglietto unico, costituito per metà da cell musc

e per l altra metà da fibroblasti, e poi lo arrotolo attorno al tubo.

Es. ricostruzione della trachea:

Si parte da una mold in policarbonato (PC) che funge da stampo

(positivo), in cui sono state disegnate delle cavità conteneti un cilindro

centrale. Si realizza un controstampo in PDMS (negativo), perché così

è altamente deformabile in modo elastico, per poi realizzare il positivo in

agarosio, che è un mat non adesivo.

Le cell vengono seminate nelle cavità. Per il principio di minimizzazione

dell energia, entrano in contatto e formano giunzioni,

autoaggregandosi. La loro aggregazione produce dei ring cellulari.

Che mostrano determinate proprietà meccaniche.

Per formare la struttura tubulare, vengono messi assieme +anelli

attorno a un cilindro in silicone. Si attende circa una settimana per la

fusione.

Le cell nella zona più esterna dell anello si dispongono in direzione

tangenziale, mentre quelle + interne restano +circolari.

Le cell producono fibrina e collagene come ecm.

Self-organisation:

Se io ho il polistirene, le cell aderiscono al substrato, e poi se voglio

togliere le cell devo usare un enzima (la tripsina) che riesce a staccare

le cell dal substrato ma anche tra loro e ottengo cell singole e non

un tess.

Noi vogliamo staccare il foglietto integro, qunidi scindere solo i leg

tra le cell e il substrato e non quelli tra le cell.

Allora si è pensato a un mat a cui aderissero le cell

momentaneamente e da cui dopo si possa scindere l adesione per

staccare il foglietto attraverso precisi stimoli al mat.

Si usano mat stimuli-responsive o smart materials:

Sono mat per cui delle modifiche nell amb circostante inducono

modifiche delle loro proprietà chimiche o fisiche in modo

reversibile.

Tra questi c è la famiglia degli idrogeli.

Tra gli stimoli utili posso usare quello termico, ph o chimico-fisico.

Preferisco quello termico (mat termo-responsive) perché sopportabile

maggiormente dalle cell.

Due comportamenti tipici dei mat termo-responsive:

- Quelli che hanno una upper critical solution temperature (UCST),

ovvero che a basse T sono in stato gel ovvero solid-like e che a

alte T (quella corporea di 37°) sono in stato sol ovvero liquid-

like. Quindi transizione sol-gel all abbassare della T. es gelatina

- Quelli con lower critical solution temperature (LCST), sotto

questa T sono liquidlike ma sopra sono gellike. Qunidi

transizione sol-gel per aumento della T. Es pnipaam e metilcellulosa

e pluronic

Noi vogliamo gli LCST, perché alle alte T coltiviamo le cell (37°) su

un supporto solido e poi la diminuiamo per trasformarlo in liquido

e staccarlo dal foglietto.

Sopra la LCST, il mat ha un comportamento di tipo idrofobico, le

catene molecolari tendono ad aggregarsi tra di loro perché espongono

dei gruppi che promuovono i leg intermolecolari e respingono le molecole

d acqua, qundi si trova allo stato gell-ike, ha una certa consistenza.

Sotto la LCST ha un comportamento idrofilico, le catene espongono

dei gruppi che hanno affinità con l acqua, quindi l acqua entra e quindi

perdo aggregazione e il mat diventa sol-like, così posso prelevare il

foglietto di cell.

Il primo mat, studiato da okano, è il pNIPAAm. Ha una LCST di 32°,

vicina ai 37° quindi posso abbassare di poco la T per renderlo sol

senza mandare troppo in sofferenza le cell.

Esempi:

- plastiche di coltura trattate con un coating di pnipaam

- ricostruzione della cornea da cell epiteliali da mucosa orale