Analisi farmaceutica 2

SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO UV-VIS

La spettrofotometria (o spettrometria) molecolare UV-Vis si basa sull’assorbimento selettivo, da parte di molecole, delle radiazioni

con lunghezza d’onda compresa fra 10 nm e 780 nm

Questa ampia gamma spettrale viene divisa in tre regioni principali:

• UV lontano (10 - 200 nm)

• UV vicino (200 – 380 nm)

• Visibile (380 - 780 nm)

Dal punto di vista analitico, le regioni più interessanti sono l’UV vicino e il visibile, a cui è dedicata gran parte della strumentazione

oggi disponibile cromofori

I gruppi funzionali che assorbono nelle regioni dell’ultravioletto e del visibile sono noti come

Per effettuare analisi qualitative si fa uso di raggi policromatici a spettro continuo, poi separati tramite monocromatori nelle

varie componenti (radiazioni monocromatiche). In pratica le singole radiazioni monocromatiche di tale raggio si fanno passare,

una alla volta, attraverso la sostanza in esame, la quale assorbirà in modo diverso, cioè con diversa intensità, le diverse

radiazioni Lo spettro UV-Vis è uno spettro continuo

Riportando perciò i valori registrati in un grafico lunghezza d'onda-assorbimento, lunghezza d’onda

• Sull’asse X = si ha la (landa λ)

• Sull’asse Y = si ha l’assorbanza A

spettro di assorbimento

si ottiene lo della sostanza esaminata Quindi lo spettro di assorbimento UV-Vis dice come assorbe una molecola al variare

della lunghezza d’onda della radiazione incidente

Per il fatto che ogni sostanza ha il suo spettro di assorbimento, l'esame di tali spettri permette di identificare una sostanza, per confronto diretto con

campioni noti o tramite banche dati di spettri o di controllarne il grado di purezza

In realtà le tecniche che meglio si prestano alle analisi qualitative (soprattutto organiche) sono la spettroscopia infrarossa, in cui ogni sostanza presenta

numerose bande caratteristiche ben separate, e soprattutto la risonanza magnetica nucleare, che fornisce serie di picchi direttamente collegabili alla

struttura della molecola

La spettroscopia UV-Vis viene utilizzata molto nella analisi quantitativa

Nella analisi qualitativa un po’ meno perché gli spettri di assorbimento non sono molto identificabili per una sostanza

lunghezza d’onda fissa

Viene eseguire con raggi monocromatici, quindi a direttamente proporzionale alla concentrazione

L’analisi quantitativa si basa sul fatto che l’assorbanza di una soluzione è

dell’analita in soluzione Legge di Lambert-Beer

Questo è espresso con la

Come si calcola la trasmittanza e assorbanza:

Si ha il campione dove si ha solubilizzato l’analita (non si può lavorare con delle sospensioni)

Si ha una sorgente che emette un raggio monocromatico, selezionato opportunamente, e parte

di questa radiazione verrà assorbita dal analita in soluzione e parte verrà trasmessa

Quindi si avrà una intensità della radiazione incidente e una intensità della radiazione uscente

trasmittanza

Il loro rapporto è la

È un valore frazionario, cioè compresso tra 0 e 1:

• se è uguale a 1 = la radiazione non è stata assorbita

• se è uguale a 0 = la radiazione è stata completamente assorbita

Dalla trasmettanza deriva l’assorbanza che è il suo logaritmico negativo

Questa assorbanza è uguale a epsilon x cammino ottico x concentrazione

dell’analita

Si ha una proporzionalità diretta tra assorbanza e concentrazione

Il fattore di proporzionalità è epsilon x b

L’epsilon, coefficiente di estensioni molare, può essere espressa in vari modi:

coefficiente di estensione molare

• epsilon e, = viene utilizzato quando la concentrazione è espressa come 1M, e quindi ha come

unita di misura L/molxcm

assorbività specifica

• A1%1cm, = è utilizzata quando si ha la concetrazione al 1%, e quindi ha come unita di misura 1g su 100ml

assorbività

• K, = viene utilizzata quando si ha la concetrazione come 1g su 1L, e quindi ha come unita di misura 1 g/L

• Epsilon è una costante e dipende dalla lunghezza d'onda, dalla natura del composto, dal solvente e dalla temperatura

• Epsilon è indipendente dalla concentrazione, dallo spessore del cammino ottico e dall'intensità della luce incidente

N.B. La legge di Lambert-Beer è valida per radiazioni monocromatiche e soluzioni diluite

Grafico:

L'equazione A = ε x b x C rappresenta una retta passante per l'origine degli assi

Il ε x b è il coefficiente angolare

Applicabilità della legge di Lambert-Beer e deviazioni aumenta la concentrazione non linearità

Fino a che la soluzione è diluita, si ha una retta, ma se si oltre un certo valore, si ha più la

nella legge di Lambert-Beer, e questi avviene per ragioni:

Una ragione è legata all’indice di rifrazione perché cambia con la concentrazione della

diverso indice di rifrazione

soluzione —> perché il fa variare la lunghezza d’onda e

quindi è come se si misuraresse l’assorbanza a una lunghezza d’onda differente

formare degli aggregati

Un’altra ragione è che la soluzione è molto concentrata, si possono (dimeri, polimeri) per l’ instaurarsi di

interazione intermolecolari —> quindi dal punto di vista strutturale, è come se si avesse una molecola differente che può mostrare

dei massimi di assorbimenti diversi dalla singola molecola originale diluite

Per evitare tutto ciò, si dice che la legge di Lambert-Beer è applicabile solo per soluzione che sono tra 10^-2 alla 10^-7 M

Scelta della lunghezza d’onda

Visto che un indagine quantitativa viene condotta con una radiazione monocromatica, cioè a un unica lunghezza d’onda,

la prima da porci è quale lunghezza d’onda è da scegliere per eseguire l’analisi quantitativa

Per capire quale è la lunghezza d’onda migliore, per prima cosa bisogna sapere lo spettro di assorbimento di quella molecola

Quindi si va a vedere come varia l’assorbimento di quella molecola al variare della lunghezza d’onda della radiazione incidente

punto di massimo,

Dallo spettro di assorbimento si può individuare un e quindi si sceglie la lunghezza

d’onda che ha un assorbanza maggiore (dove il campione assorbe maggiormente)

Si sceglie questo punto di massimo per due ragioni:

sensibilità

• per la —> perché l'assorbimento più è alto e più è possibile rilevare facilmente anche

quantità piccolissime di sostanza

minore errore sperimentale

• per avere un della misura dell’assorbanza —> perché:

L’errore che si può misurare nel rilevamento dell’assorbenza è il ΔA

Questo ΔA è maggiore se lo prendiamo su un tratto ascendente, invece se lo si prende in un punto di

massimo, il ΔA è minore e quindi anche il suo errore sperimentale = più accurato

A parità di accuratezza del monocromatore (rappresentata dal segmenti Δλ tutti di uguale lunghezza), l’errore commesso nella lettura dei

valori di assorbanza (ΔA) è relativamente piccolo sia in corrispondenza del massimo (ΔA1) sia in corrispondenza del minimo (ΔA2)

La parte strumentale di uno spettrofotometro che si occupa dell’accuratezza è il monocromatore = parte strumentale qualificante

Sta a valle dello strumento e più il monocromatore riesce a far passare una banda ristretta e maggiore è performante

Altro criterio è che nel caso di miscele di sostanze, la scelta, per la determinazione di una sostanza, cadrà su una lunghezza

d'onda dove le altre sostanze assorbono il meno possibile

Scelta del solvente in cui solubilizzare l’analita

Innaziaituto, il solvente scelto deve riuscire a solubilizzare complemante l’analita perché

deve essere una soluzione (non sospensione)

forza eluente cut-off,

Ogni solvente ha una propria e ha un cioè ha una lunghezza d’onda

al di sotto della quale assorbe completamente

miscibilità

Altra cosa da sapere è la tra vari solventi —> si hanno tabelle in cui sono segnate

tutte le varie miscibili tra dei diversi solventi tra loro, perché devono essere miscibile tra loro

Analisi quantitative

Dopo aver capito la lunghezza d’onda e solvente, si può effettuare una analisi quantitativa

L’analisi quantitativa può essere fatta in due metodi differenti:

Metodo diretto

• —> si può utilizzare se si conosce la epsilon (sono segnate nelle monografie di Farmacopea), e si calcola

direttamente la concentrazione con la legge di Lambert-Beer

Metodo indiretto

• —> mendicante calibrazione Tutto ciò deve rimanere nel range lineare (non dinamico)

Lavorare in derivata: aumentare il potere risolutivo

Se si converte uno spettro nella sua derivata prima, si va ad dello spettro —> quindi lo spettro

più caratterizzante

diventa

Questo potenziamento della risoluzione porta anche ad una migliore impronta digitale per l’identificazione del

composto in esame ed anche alla possibilità di determinare selettivamente un composto in presenza di un altro

Esempio: spettro del acido acetilsalicilico e acido salicilico —> sono molto sovrapponibili

Quindi, convertendoli nella derivata prima —> si ha un massimo solo del acido salicilico

che prima non c’era

Analisi multicomponente

Si ha in soluzione più di un analita

Consideriamo una soluzione campione contenente più componenti. Se non ci sono interferenze fra i componenti, considerando il

cammino ottico b = 1 cm costante, l’assorbanza totale della soluzione ad ogni lunghezza d’onda, sarà Atot

proprietà additiva

L’assorbanza, per una determina lunghezza d’onda, è una = perché se si ha due composti in soluzione ed

entrambi assorbono a 254nm, allora l’assorbanza totale sarà data dalla somma dei contributi di ciascuna sostanza

Si supponga di avere una miscela di due componenti (m, n) e i loro spettri si sovrappongono

a tutte le lunghezze d’onda

Lo spettro della miscela è la somma dei contributi An e Am a tutte le lunghezze d’onda

Grafico:

• linea scura —> spettro di assorbimento di m

• linea chiara —> spettro di assorbimento di n

• linea tratteggiata —> spettro della miscela totale (m+n), e infatti di ha valori di assorbanza maggiori

L’analisi quantitativa di m e n avviene contemporaneamente nella stessa soluzione, come:

È possibile se si conoscono i parametri spettroscopici (epsilon) dei d