Analisi dei medicinali I

Cromatografia su carta

La fase stazionaria è costituita da acqua trattenuta dalle fibre di cellulosa della carta (ovvero da una striscia di carta imbevuta di acqua). La fase mobile può muoversi per: - Capillarità: cromatografia ascendente: l'eluente sale per capillarità trasportando con sé gli analiti. - Gravità: cromatografia discendente: l'eluente sale per poi scendere trasportando con sé gli analiti. Metodo: alcune gocce della miscela da separare vengono applicate a circa 2 cm dall'estremità di una striscia di carta da filtro. Dopo aver asciugato, quell'estremità della carta viene immersa in una miscela di solventi costituita da componenti acquosi e organici. Il solvente si muove per capillarità lungo la carta per la natura fibrosa della carta stessa. La direzione della migrazione del solvente può essere verso l'alto (cromatografia ascendente) o verso il basso (cromatografia discendente).

La componente acquosa del solvente si lega alla cellulosa della carta e quindi forma con essa una fase stazionaria simile ad un gel. La componente organica del solvente continua la sua migrazione formando la fase mobile. La velocità di migrazione delle varie sostanze che devono essere separate dipende dalla loro solubilità relativa nella fase stazionaria polare e nella fase mobile non polare. Le molecole vengono quindi separate sulla base della loro polarità; le molecole non polari si muoveranno più velocemente di quelle polari. Dopo che il fronte del solvente ha percorso una certa distanza, il cromatogramma viene tolto dal solvente ed asciugato. A questo punto si analizzano i materiali separati, che se non sono colorati possono essere individuati attraverso alcuni metodi come il marcamento con radioisotopi o materiali fluorescenti.

CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONALE SU CARTA: si utilizza quando con un solo solvente non si ottiene la separazione dei componenti. La miscela da

Separare viene posta in un angolo del foglio e si effettua la prima eluizione con il 1° solvente. Poi si immerge il margine perpendicolare in un 2° solvente in modo che il liquido si muova in direzione perpendicolare alla precedente.

CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC)

Utile per l'analisi qualitativa (purezza/ riconoscimento analita) che per individuare le condizioni ottimali per la separazione su colonna.

La fase stazionaria è costituita da materiale adsorbente (Allumina o Silice) depositato su un lastra di vetro (20x20), fogli di Al o di plastica rigida. (= lastra cromatografica)

Metodo: Si pone, mediante l'utilizzo di un capillare, una goccia del campione da separare sull'estremità inferiore della lastra cromatografica: questo lo si fa tracciando una sottile riga ad 1,5 cm dall'estremo della lastra; sulla riga si depongono le soluzioni delle sostanze (incognite e di riferimento) a distanza di 0,7 cm una dall'altra. Le lastre vengono poste

In una camera di sviluppo chiuse contenente sul fondo 1cm di eluente ed un foglietto di carta da filtro in modo da assicurare un'elevata evaporazione dell'eluente ed una buona saturazione della camera. Il solvente sale lungo la lastra per capillarità. Quando il solvente sale trascina in maniera differente i componenti della miscela separandoli. Il riconoscimento delle sostanze può avvenire mediante il calcolo del fattore di ritardo R che si ottiene misurando la distanza percorsa dal centro della macchia e confrontandola con la distanza percorsa dal fronte dell'eluente: Rf è sempre compreso tra 0 ed 1. I valori ottimali sono tra 0,4 e 0,8. Se la sostanza cammina poco significa che è stata trattenuta troppo. Se Rf è = ad 1 significa che l'eluizione è sbagliata. Se le sostanze non sono colorate si può: - Se le sostanze assorbono nell'uv: si può osservare la lastrina sotto una lampada uv (245 o 365 nm). Intalcaso può essere necessario aggiungere alla fase stazionaria o alla fase mobile un indicatore di fluorescenza che permette di localizzare le macchie.
Spruzzare la lastrina con una soluzione contenente sostanze in grado di reagire con i costituenti della miscela separata generando composti colorati; può essere necessario scaldare leggermente la lastrina per favorire la reazione. Reagenti utilizzati per evidenziare le sostanze separate:
Sostanze con proprietà acido-base possono essere rivelate immergendo la lastrina in soluzioni di indicatori di pH. Si prepara una soluzione di un indicatore con pKIn intorno alla neutralità, si immerge la lastrina; la presenza di sostanze con proprietà acido-base induce variazioni di pH e di colore sulla lastrina. Quindi si avrà la macchia dove si ha il viraggio dell'indicatore. I composti organici sono acidi/basi deboli e perciò lavoro in condizioni di diluizione.
CROMATOGRAFIA SU COLONNA
Si utilizza percolonna) per calcolare il volume di eluente necessario per saturare la colonna. Separazione dei componenti: Una volta che la colonna è stata preparata, il campione viene sciolto in un solvente adeguato e versato sopra la fase stazionaria. Successivamente, viene aggiunta la fase mobile dall'alto della colonna. I componenti della miscela vengono trascinati dalla fase mobile con diverse velocità, iniziando così a separarsi. I componenti meno adsorbiti dalla fase fissa si separano per primi. Raccolta dei componenti: Ogni componente del miscuglio viene raccolto separatamente, iniziando dai componenti meno adsorbiti. Questo permette di ottenere i singoli componenti puri. Preparazione della colonna: La colonna viene preparata posizionando un setto poroso sul fondo. Questo setto può essere realizzato utilizzando del cotone idrofilo. La fase stazionaria viene dispersa nell'eluente e la sospensione ottenuta viene versata nella colonna. La fase stazionaria si deposita verso il basso, creando un impaccamento. È importante che la quantità di fase stazionaria nella colonna non superi i tre quarti dell'altezza della colonna, in modo da garantire una riserva sufficiente di fase eluente sopra il livello di fase stazionaria. Per calcolare il volume di eluente necessario per saturare la colonna, viene misurato il volume morto della colonna (volume di eluente preparato - volume recuperato dopo l'impaccamento della colonna).

colonna). Caricamento del campione: La miscela da separare si carica in colonna avendola disciolta nel minimo V possibile dello stesso eluente che si userà per la separazione. Se è insolubile viene disciolta in un adattosolvente, addizionata di una piccola quantità di fase stazionaria e portato a secco.

Eluizione del campione: si aggiunge l'eluente e si fa in modo di avere una riserva di eluente sempre sufficiente. Il 1° eluato raccolto e corrispondente al V morto può essere riutilizzato. L'eluizione può essere:

• Isocratica: singolo solvente o miscela a composizione fissa
• In gradiente: miscele a composizione diversa durante l'eluizione.

All'uscita della colonna si raccolgono le frazioni dell'eluato (V da 3 a 5 ml) in provette numerate. Il frazionamento può essere effettuato mediante un raccoglitore automatico di frazioni (raccoglie volumi costanti di eluato in ogni singola provetta). Le frazioni vengono analizzate.

mediante TLC per verificare in quali frazioni sono contenuti i singoli componenti della miscela. Tutte le frazioni contenenti esclusivamente lo stesso componente sono riunite in un pallone, il solvente viene evaporato per recuperare il componente puro. Le frazioni impure contenenti i componenti di interesse possono essere riunite e cromatografate nuovamente per recuperare altro materiale.

RIFRATTOMETRIA

La rifrattometria è una tecnica strumentale che si basa sulla determinazione dell'indice di rifrazione, associato al fenomeno della rifrazione, cioè alla variazione subita dalla radiazione luminosa quando attraversa un mezzo, in particolare: quando una radiazione luminosa passa da un mezzo ad un altro, entrambi isotropi (mezzi aventi le stesse caratteristiche ottiche in tutte le direzioni di propagazione della luce), subisce una variazione di velocità e di traiettoria.

La rifrattometria è una tecnica strumentale che si basa sulla determinazione dell'indice

di rifrazione di undato materiale. In genere, una volta purificati i composti si fa l'esame molecolare e se il composto è liquidosi misura l'indice di rifrazione che è utile per caratterizzare una sostanza liquida e per valutare il suo gradodi purezza (se ci sono impurezze varia l'indice di rifrazione)

L'indice di rifrazione di un materiale è una grandezza adimensionale che quantifica la diminuzionedella velocità di propagazione della radiazione elettromagnetica quando attraversa un materiale. Ladiminuzione della velocità di propagazione viene accompagnata dalla variazione della sua direzione,secondo il fenomeno della rifrazione. L'indice di rifrazione dipende da: Temperatura, λ della radiazione,pressione

Per convenzione i valori degli indici di rifrazione vengono tabulati a: t = 20 °C λ = 5893 angstrom (589.3 nm)20 °D(riga gialla D del sodio) n 10 -1 .La velocità della luce nel vuoto (c)

è 3x10 cms Passando in un mezzo più denso essa diminuisce e l’indicedi rifrazione assoluto di quel mezzo è definito come il rapporto tra la velocità della luce nel vuoto e nelmezzoPoiché la velocità della luce nel vuoto è massima, tutti gli indici di rifrazione assoluti sono maggiori di 1. Perla maggior parte dei liquidi sono compresi tra 1.3 e 1.8, per la maggior parte dei solidi sono compresi tra 1.3e 2.5.Quando la luce passa da un mezzo A ad un mezzo B (entrambi diversi dal vuoto) il rapporto delle velocitàdella luce nei due mezzi è definito indice di rifrazione relativoQuesto indice si fa sempre rispetto l’aria ( e non rispetto al vuoto). L’indice di rifrazione assoluto dell’aria è0589.3n =1,00027.La variazione di velocità della radiazione è accompagnata da una variazione della direzione di propagazionedella radiazione, a meno che il raggio non entri perpendicolarmente alla

superfice di separazione dei due mezzi. Si vede l'angolo che si forma tra i due raggi e la normale alla superficie.

Prima legge della rifrazione: Il raggio incidente (i), il raggio rifratto (r) e la normale alla superficie di separazione dei due mezzi, nel punto di incidenza, giacciono sullo stesso piano.

Seconda legge della rifrazione (legge di Snell): Il rapporto tra il seno dell'angolo di incidenza e il seno dell'angolo di rifrazione è costante ed è uguale al rapporto tra l'indice di rifrazione del secondo mezzo e quello del primo, dove i = angolo di incidenza, r = angolo di rifrazione, n2 e n1 indici di rifrazione assoluti dei due mezzi, n indice di rifrazione relativo del mezzo 2 rispetto al mezzo 1, c1 e c2 velocità della luce nei due mezzi. Quindi conoscendo i seni ed n2 si può calcolare l'indice di rifrazione di n1.

Se il 2° mezzo ha un indice di rifrazione > del 1° (è più rifrangente), allora:

2° mezzo è meno rifrangente del 1° allora n2<n1 e di conseguenza:

Quindi il raggio rifratto si allontana dalla normale