Analisi biochimiche e cliniche

METODI IMMUNOCHIMICI

Sono test biochimici fondati sul legame non covalente, però altamente specifico e saldo, che

gli anticorpi formano con molecole bersaglio, gli antigeni.

○​ Antigeni (Ag): sostanze che provocano una risposta

immunitaria, in grado di produrre anticorpi specifici. La

parte dell’antigene riconosciuta dal sistema immunitario

è chiamata ‘epitopo’.

○​ Anticorpi (Ab): immunoglobuline che si formano in

risposta ad una sostanza estranea, antigeni.

Gli anticorpi si dividono in

Policlonali: si producono inoculando l’antigene in un animale che produrrà anticorpi

➢​ ad elevata affinità e specificità. Risulta inconveniente per via della sofferenza degli

animali e poiché sono geneticamente diversi, prodotti da plasmacellule diverse.

Monoclonali: si producono iniettando un antigene nel topo e prelevando le cellule

➢​ spleniche anticorpo-proteiche o del sangue che vengono fuse con una cellula

tumorale. Tali cellule tumorali sono in grado di produrre quantità illimitate di Ab puri e

specifici, poi si isolano gli Ab che riconoscono in modo specifico l’antigene di

interessi. Geneticamente uguali, prodotti da cloni di plasmacellule.

Come avviene la risposta immunitaria?

Prima di tutto c’è l’ingresso nell’organismo di un antigene, così poi si sviluppa la risposta

delle cellule B che si differenziano in linfociti B-plasmacellule, ovvero cellule che producono

grandi quantità di Ab. E così inizia la produzione di anticorpi.

Struttura?

Le immunoglobuline sono proteine formate da quattro catene polipeptidiche, di cui due di

esse sono denominate pesanti (catene H), e due leggere (catene L) con un peso molecolare

inferiore. Ogni catena possiede una regione costante ed una variabile e le varie catene sono

legate fra loro con un ponte disolfuro.

I domini variabili (VL e VH) hanno la funzione di unione con l’antigene e, quindi, sono

responsabili della specificità dell’immunoglobulina, mentre i domini costanti permettono la

differenziazione dei cinque isotopi di catene pesanti che formano le immunoglobuline (IgM,

IgG,IgE, IgA, IgD).

Metodi di Analisi Immunochimica

Radioimmunologico RIA, analisi ormonali e monitoraggio farmaci

➔​ Immunoenzimatico ELISA, analisi ormonali e virologiche

➔​

Dosaggio competitivo? l’antigene marcato e quello non marcato competono con un

limitato n° di siti di legame nella miscela di reazione o in fase fissa.

RIA metodo con marcatore e tracciante, che però non deve interferire con il sito di legame

per Ab. Metodo usato principalmente per la diagnosi di diabete I, dove si esegue la ricerca

del peptide nel sangue, una molecola di 31 amminoacidi rilasciata durante la maturazione

dalla pro-insulina in insulina. La proinsulina si trasforma

definitivamente tramite

l’allontanamento del peptide C.

Dopo il taglio proteolitico le due

subunità A e B rimangono unite per

interazioni chimiche di alcuni

amminoacidi.

La concentrazione di Peptide C nel sangue è direttamente proporzionale alla concentrazione

di insulina e viene usato per diagnosticare il diabete mellito di tipo I per via della sua stabilità

maggiore, dovuta ad un emivita maggiore.

Gli anticorpi specifici per l’antigene da dosare (Peptide C) sono legati alla fase solida; si

aggiunge il siero contenente l’antigene endogeno non marcato (Peptide C) e lo stesso

antigene radiomarcato. Le molecole di antigene, marcato e non, competono per gli stessi siti

di legame sugli anticorpi.

Dosaggio non competitivo? gli anticorpi sono a sufficienza (in eccesso) per legare tutto

l’antigene presente nel campione. Ab si lega a fasi fisse come le micropiastre e provette, si

aggiunge il campione contenente Ag e si lascia reagire con gli Ab, si lava e si incuba con un

Ab secondario marcato (che lega differenti epitopi dell’Ag), struttura a ‘sandwich’, si misura.

ELISA metodo di analisi immunologica usato per rilevare la presenza di un dato antigene

(proteina endogena da identificare/dosare o caratteristica di un organismo patogeno).

Trova inoltre ampio uso anche per misurare la concentrazione di anticorpi nel plasma

sanguigno, come ad esempio nei test per HIV, celiachia ecc…

Esistono due metodiche principali: metodo diretto e metodo indiretto.

Le fasi di sintesi prevedono:

1.​ Immissione di una soluzione dell’anticorpo primario (specifico per l’antigene da

ricercare) nei pozzetti di una apposita piastra da saggio in polistirene. Il fondo del

pozzetto viene saturato con l’anticorpo che attecchisce per mezzo della gelatina di

pesce e l’eccesso viene lavato via.

2.​ Aggiunta del campione da saggiare.

3.​ Incubazione per consentire l’interazione molecolare.

4.​ Lavaggio con soluzione tampone, via le altre componenti che non hanno interagito.

5.​ Aggiunta dell’anticorpo secondario specifico coniugato con un enzima.

6.​ Incubazione per consentire l’interazione molecolare.

7.​ Lavaggio con soluzione tampone.

8.​ Aggiunta di p-nitrofenilfosfato che è substrato dell'enzima coniugato all’Ab second.

9.​ Il p-nitrofenilfosfato viene convertito in p-nitrofenolo di colore giallo.

10.​L’aggiunta di idrossido di sodio blocca la reazione catalizzata dall’enzima fosfatasi.

Quindi si effettua la misura della quantità di prodotto della reazione (p-nitrofenolo)

mediante lettura spettrometrica di colore o luce.

Anche in farmacia esistono dei test ELISA, si tratta di mini test molto attendibili che si

effettuano in pochi minuti.

Alcuni esempi di test immunologici sono i test rapidi influenzali, il test di gravidanza dove si

va alla ricerca della gonadotropina corionica e infine il test rapido per la diagnosi di celiachia.

ELISA viene usato per la diagnosi di neoplasie prostatiche, una neoplasia è una ‘nuova

formazione’ ed indica una massa di tessuto che cresce in eccesso e in maniera scoordinata

rispetto ai tessuti normali.

Il metodo diretto è utilizzato per la ricerca dell’antigene prostatico specifico, PSA, una

glicoproteina prodotta dall’epitelio sia normale che patologico della prostata, ma la sua

concentrazione aumenta in caso di neoplasia. Questo test immunologico usa come

campione biologico il sangue.

Elisa con il metodo indiretto invece è usato per la diagnosi di CELIACHIA.

La malattia celiaca è un'intolleranza permanente al glutine, sostanza proteica presente in

vari alimenti come avena, frumento. grano, farro ecc…

L’incidenza della malattia stima che è affetto un soggetto ogni 80-100 persone, ma solo 1

persone su 6 riceve la diagnosi.

Per curare la celiachia, attualmente, occorre escludere dal proprio regime alimentare alcuni

degli alimenti più comuni, quali pane, pasta, biscotti e pizza, ma anche eliminare le più

piccole tracce di glutine dal piatto. Questo implica un forte impegno di educazione

alimentare, infatti l’assunzione anche di piccole quantità può provocare diverse

conseguenze più o meno gravi alla mucosa intestinale, quali atrofia dei villi intestinali.

Tra i vari diritti del celiaco c’è l’erogazione gratuita di alimenti senza glutine, con un limite

massimo di spesa che varia dal genere sessuale e età stabilito dal decreto del ministero

della salute.

La prolamina è una delle frazioni proteiche che costituiscono il glutine ed è la responsabile

dell’effetto tossico per il celiaco. La prolamina del frumento viene denominata gliadina.

Per il dosaggio del glutine negli alimenti l’unico metodo analitico ad oggi approvato a livello

ufficiale è l’ELISA, infatti rileva il glutine nei vari alimenti classici a rischio, nelle birre, sciroppi

ecc.

Come viene diagnosticata?

La diagnosi nei bambini avviene nei primi mesi post dieta con glutine grazie ai vari sintomi

come diarrea, vomito, anoressia e arresto della crescita e/o calo ponderale. Mentre la

diagnosi dopo i primi anni di vita è suggerita dai dolori addominali ricorrenti e anemia

sideropenica. Negli adulti si manifesta con perdita di peso e carenze nutritive multiple,

crampi, emorragie, dolori ossei ecc.

Come viene classificata?

●​ Tipica: insorgenza precoce, diarrea, arresto della crescita, dolori addominali, vomito.

●​ Atipica: insorgenza tardiva, sintomi extraintestinali come anemia, bassa statura,

alopecia, infertilità e artropatie.

●​ Silente: assenza di sintomi eclatanti.

●​ Latente: esami sierologici positivi ma biopsia intestinale normale.

Eziologia?

Fattori ambientali

➢​ Fattori genetici:

➢​ -​ Familiarità

-​ Geni che codificano per le molecole di HLA di classe II

La tipizzazione HLA nella celiachia è un test di suscettibilità che valuta la maggiore o minore

predisposizione di un individuo a sviluppare la malattia in base alla presenza/assenza di

fattori di rischio (DQ2 e DQ8).

La diagnosi avviene grazie a?

●​ Dosaggi sierologici

AGA, anticorpi antigliadina di classe IgA e IgG

➔​ EMA, anticorpi antiendomisio di classe IgA

➔​ anticorpi diretti contro glutine e gliadina che causano col tempo

infiammazione a livello intestinale.

Anticorpi Anti-transglutaminasi (nuovo test)

➔​ specifico e sensibile, proteina bersaglio è il nuovo marker diagnostico è

l’enzima che scinde glutammina in NH3 + acido glutammico.

●​ Biopsie dell’epitelio dell’intestino tenue

Esame istologico

➔​

Marcatori tumorali

Indicano la presenza, la progressione o le recidive di un tumore. Si trovano a livello delle

cellule tumorali ma si possono trovare anche in fluidi biologici, come il sangue.

I marcatori tumorali assoluti non esistono perché le cellule neoplastiche per molti aspetti non

sono differenti da quelle normali: la differenza sostanziale risiede nel maggior metabolismo

presente in quelle tumorali.

Il marcatore ideale deve consentire una diagnosi precoce, un test sensibile e specifico per

un tipo di tumore, e i suoi livelli devono variare in risposta alle dimensioni del tumore.

Inoltre deve indicare la natura e localizzazione della neoplasia, evidenziare la presenza di

micrometastasi e essere di facile esecuzione e di costo contenuto.

Antigene prostatico specifico (PSA)

➢​

F(x) fisiologica: mantenere fluido il liquido spermatico dopo eiaculazione

La PSA è una glicoproteina prodotta dall’epitelio sia normale che patologico della prostata,

ma il suo valore aumenta in caso di neoplasia ma anche nell’ipertrofia benigna in casi rari.

Questo test immunologico si basa sul campione biologico che è il sangue.

Antigene carcinoembrionario (CEA)

➢​

è una glicoproteina utilizzata come marcatore del cancro al colon retto, ma visto che non è

un indice diagnostico valido per la scarsa