Microbiologia applicata e sperimentale (batteriologia e virologia)

Microbiologia applicata e sperimentale

Batteriologia e virologia - A.A. 2021/2022

Proff. Pollini e Zakrzewska

Batteriologia - Proff.ssa Pollini

A.A. 2021/2022

Email: Simona.pollini@unifi.it

Lezione 1 (27.09) - Introduzione e richiami teorici

Vediamo alcuni concetti di base importanti per affrontare poi gli argomenti successivi. Innanzitutto, i microorganismi sono uno strumento per la manipolazione genetica, quindi sono un ospite in cui modificare il DNA, che può essere usato in vari ambiti di espressione eterologa. I microorganismi sono anche target per applicazioni diagnostiche (test diagnostici classici), terapeutiche (farmaci, per esempio quando si ha una disbiosi, ovvero alterazione della flora batterica, che può essere ricambiato e modificato mediante trapianti di microbiota fecale) e profilattiche (vaccini).

Una cellula batterica è grande intorno, in media, al 1µm, ma ci sono anche altri vicini quasi al mm e sono microorganismi però ambientali e non rientrano tra gli studi in ambito clinico. La forma di un batterio è generalmente regolare per la presenza di una parete rigida per eccezione di micoplasmi. Le singole cellule possono formare a loro volta degli aggregati. Quindi per esempio da singoli cocchi si formano diplococchi, streptococchi (aggregazione a catenella di coppie di cellule) e stafilococchi (aggregazione a grappoli). Da bacilli e bastoncini si hanno streptobacilli ecc… Proprio la forma di aggregazione delle singole cellule è un fattore importantissimo nelle analisi a microscopio ottico che viene fatto in ambito clinico.

Le componenti fondamentali della cellula batterica sono la membrana plasmatica, il citoplasma, il patrimonio genetico e la parete. Non tutti i batteri però presentano una parete uguale tra loro, ci sono anche alcuni microorganismi come i micoplasmi che addirittura invece sono completamente privi di parete, per questo detti fragili perché sono labili nell’ambiente e non hanno forma definita, infatti sono detti pleioformi completamente diversi da cocchi e bacilli invece con forma distinta. Tutti i batteri NON hanno chiaramente membrana nucleare, cosa che differenzia eucarioti da procarioti, tuttavia il nucleo è particolarmente denso in una zona del citoplasma che prende il nome di nucleoide. Il genoma è singolo, di solito è un solo cromosoma, generalmente di forma circolare (non sempre, perché a volte sono anche di forma lineare come gli Streptomyces, batterio ambientale ma utile biotecnologicamente perché produce antibiotici).

Inoltre, non sempre si ha solo un cromosoma, ma a oltre possono essercene due, dello stesso tipo, o addirittura anche uno lineare e uno circolare come nel caso dell’Agrobacterium. È importante però notare che i batteri sono aploidi, ovvero accumulano mutazioni ed esprimono e mantengono le variazioni cromosomiche in modo molto diverso dalle cellule eucarioti diploidi. Questo perché la mutazione sul cromosoma aploide si traduce in un effetto fenotipico, che può essere nullo o importante, ma che sicuramente si manifesta, perché non ci sono due copie che si completano, e si proteggono in un certo senso (dove, per esempio, la copia sana protegge l’allele mutato, in un aploide questo non avviene chiaramente).

Il cromosoma batterico è molto variabile in grandezza, ci sono alcuni microorganismi con genoma molto vasto e altri molto piccolo, dipende infatti dall’ambiente e dalle funzioni che può svolgere. Per esempio, E. Coli, il batterio per eccellenza in biotecnologie ha un genoma di 4,6Mb (milioni di paia di basi) con circa 4000 geni e si trova sia nell’intestino di mammiferi che nell’ambiente. Per sopravvivere in questi due ambienti (in termini di temperature, pH, nutrienti ecc…) ha bisogno di molte funzioni diverse, per questo ha un genoma relativamente grande. Altri microorganismi, come patogeni che vivono solo nell’uomo, come l’Haemophilus influenzae che può causare dalla meningite in bambini sotto i 2 anni, fino a forme molto blande come infezione all’orecchio, e ha un genoma di solo 1,8Mb con solo 1700 geni, questo perché ha bisogno di molte meno funzioni. Il Mycoplasma pneumoniae è un altro parassita obbligato dell’uomo con genoma ancora più piccolo, di 0,8Mb e con solo circa 700 geni.

Dentro alla cellula batterica il cromosoma non si ripiega come nel DNA umano, infatti non ci sono istoni, ci sono altre proteine che collaborano al ripiegamento del DNA, ma soprattutto è super-spiralizzato, ovvero un ripiegamento forzato del DNA effettuato da enzimi specifici che è fisiologico per il batterio. Questo viene continuamente per altro spiralizzato e de-spiralizzato. Questo, infatti, perché il genoma deve essere espresso, duplicato, per esempio la duplicazione del genoma batterico può avvenire in più punti, quindi continuamente viene super avvolto e rilassato. Di conseguenza è un processo dinamico svolto dalle DNA-topoisomerasi, che sono in realtà famiglie di enzimi denominate con numeri romani, di tipo I, II ecc… Le più coinvolte nel processo dinamico di avvolgimento e svolgimento del DNA batterico sono le tipo IV a cui fanno parte le DNA girasi.

La struttura della membrana è una classica membrana a bilayer fosfolipidico eucariotico con tuttavia qualche variante. Negli eucarioti ha alcune funzioni che non sono nei procarioti e viceversa. È importante ricordare che i procarioti hanno una sola membrana, ovvero non hanno organi membranosi intracellulari e molte delle funzioni di organi membranosi interni avviene a livello della membrana plasmatica. Quindi la produzione di energia, di ATP, avviene nella membrana plasmatica e non in mitocondri o cloroplasti perché non ci sono. Per questo in membrana plasmatica ci sono alcuni enzimi, per la produzione energetica, per esempio, ma ci sono anche proteine di trasporto (permeasi, che permettono il passaggio di molecole non altrimenti passabili per la membrana).

In termini di energia i batteri sfruttano la forza proton-motrice, un gradiente protonico di membrana, ovvero una forma di accumulo di un potenziale con ioni caricati positivamente pompati fuori e ioni negativi che rimangono dentro alla cellula. Questa differenza di potenziale serve per funzioni importanti, come il movimento flagellare. Oltre al movimento è coinvolta in processi come trasporto, come il simporto e antiporto adoperato mediante proteine canali, per esempio facendo il co-trasporto tra molecole e proteine e proprio anche protoni presenti all’esterno, in cui entrambi entrano all’interno, sfruttando il gradiente di concentrazione dei protoni, maggiormente accumulati infatti all’esterno e permettendo il co-trasporto di molecole e proteine all’interno.

La membrana è sede nei microorganismi di sistemi per la secrezione proteica. È molto importante per scopi farmacologici e biotecnologici, perché per esempio facciamo produrre proteine e molecole varie a E. Coli ma necessitiamo di recuperarli e è importante che vengano espulsi fuori dalle cellule. A tal fine esistono tanti complessi, denominati con vari nomi, tra cui il sistema SEC che ha più fattori. Si ha un complesso centrale che adopera il vero trasporto e viene co-adiuvato da altre proteine, come sec-B che capta la proteina da trasportare e la veicola al canale per il trasporto. Mentre sec-A, per esempio, serve per trarre energia mediante l’idrolisi dell’ATP a ADP+Pi. Importante è anche la peptidasi del segnale, un’altra proteina del complesso di trasporto SEC.

Infatti, le proteine da trasportare hanno una sequenza Leader, presente in testa alla proteina target (all’N-terminale) e serve a indirizzare la proteina stessa verso il sistema di trasporto. La sequenza leader, dopo aver svolto tale funzione, viene rimossa mediante una peptidasi ed essa è proprio la peptidasi del segnale. La sequenza segnale bisogna sottolineare che ha caratteristiche specifiche, con aa variabili da 17 a 27 circa e la lunghezza si dice essere critica, ovvero che non funziona bene né se è troppo lunga né se è troppo corta. Infatti, in entrambi i casi potrebbe non essere riconosciuta dalla peptidasi del segnale senza che avvenga il trasporto o facendo trasferire male la proteina. Inoltre, è critica non solo la lunghezza ma anche la struttura. Infatti, nei primi 3-4 aa della sequenza leader sono presenti più di un residuo aa carico positivo, molto frequenti sono Arg e Lys.

Dopo si trova adiacente una parte idrofobica fatta da Leu e Val e Ile e infine abbiamo una parte di Ala e Ser, mentre in posizione -6, ovvero a 6 aa dal taglio si ha quasi sempre una Pro. Tale prolina è necessaria perché permette il ripiegamento della proteina e si pensa permetta una corretta disposizione tridimensionale della proteina stessa ai fini di un corretto taglio enzimatico. Inoltre, in posizione -3 si ha il segnale di peptidasi è A-X-A, ovvero che si ha sempre due Alanine a distanza di un aa (X, ovvero una qualunque). In ambito biotecnologico quando vogliamo usare una sequenza leader non me la invento, ma la prendo da proteine già esistenti e che so per esempio essere frequente per E. Coli o il batterio che stiamo usando. Per costruire questo sistema, ovvero aggiungere la sequenza leader a una mia proteina, si fa una proteina ricombinante e bisogna ricordare di mettere, quando costruiamo il DNA di partenza, sempre in frame le sequenze nucleotidiche, ovvero rispettando la sequenza in codoni.

Per esempio, per E. Coli si usano le sequenze leader della PelB (Pectato liasi, enzima che scinde la peptina e che viene rilasciato dal batterio nell’ambiente), ST-II (enterotossina termostabile), OmpT (proteasi di membrana esterna) e PhoA (fosfatasi alcalina) e si usano solitamente queste perché hanno una sequenza leader ottimale.

Un altro sistema di secrezione è proprio della Yersinia Enterocolitica, patogeno intestinale. Si ha in questo trasporto vari membri. Nello specifico questo microorganismo è un gram negativo che ha una membrana e una parete esterna. Questo sistema di trasporto contatta queste due membrane, attraversandole, ma contatta anche una cellula eucariotica. Dunque permette il trasporto di una proteina dal citoplasma batterico al citoplasma della cellula ospite eucariotica. Questo sistema ne parliamo perché, per esempio, non ha solo ruolo di trasporto, ma anche effetto patogeno per trasferire molecole e proteine a una cellula ospite target.

Un’altra funzione della membrana plasmatica è la presenza in essa di sensori per parametri ambientali, quindi enzimi che servono al microorganismo per sentire stimoli esterni. Per esempio, abbiamo prima parlato del flagello, infatti il batterio non si muove perché “vuole farlo”, ma proprio perché con i vari sensori di membrana sente modifiche ambientali, tipo un nutriente o un pericolo, per esempio, inducendone quindi l’avvicinamento o l’allontanamento, in un processo chiamato chemiotassi.

Inoltre, possiamo anche dire che la membrana plasmatica funziona anche come ancoraggio al materiale genetico, ovvero durante la divisione cellulare batterica, processo che prende il nome di fissazione binaria, si forma un setto divisionale nella cellula madre che permette la divisione di questa in due cellule figlie di taglia minore rispetto alla madre e uguali tra loro. Tuttavia, questo setto si forma solo in seguito alla segregazione cromosomica dopo corretta duplicazione cromosomica. Questa segregazione avviene proprio perché la membrana permette di fungere da sito di ancoraggio, ai poli opposti della cellula stessa, per i due cromosomi, il cromosoma originale e il duplicato.

In ultimo, la membrana è una sede di biosintesi per la parete, anche se come detto non tutti i microorganismi (vedi micoplasmi) la hanno. La parete batterica (è la stessa per gram positivi e negativi, vedi immagini di sinistra, con la differenza che in questi ultimi si ha l’aggiunta di una membrana più esterna oltre alla parete) si compone di peptidoglicani, con una parte glucidica e una peptidica. La parte glucidica è la stessa per gram positivi e negativi, mentre la peptidica può essere diversa tra gram positivi e negativi ma anche tra batteri di specie diversa. La parte glicanica è fatta dall’acido-N-acetil-muramico e l’N-acetil-glucosammina. Questi polimeri generati dall’alternanza di questi due zuccheri sono legati da componente proteica. I gram positivi e negativi si differenziano per un ponte peptidico presenti in solo alcuni microorganismi e in base alla specie batterica possono avere conformazioni diverse.

I micobatteri, vedi immagine di destra, agenti eziologici di patologie polmonari, come la tubercolosi, non hanno una parete come detta finora, ma al di sopra della membrana plasmatica e alla parete di peptidoglicani, hanno uno strato lipidico di lipidi a catena lunga (detti acidi micolici) che danno una forma di permeabilità alla cellula batterica dando insensibilità a molti agenti esterni, come antibiotici e disinfettanti. Inoltre, sono batteri dalla crescita lentissima, si parla di crescita in ordine di settimane (mesi).

Associati alla parete batterica ci sono anche acidi lipotecoici che sono polimeri zuccherini dotati di carica negativa che la conferiscono anche alla parete stessa. Nei peptidoglicani ci sono anche altri componenti come polisaccaridi e proteine con funzioni varie, come segnalatori e proteine canale. Oltre a queste proteine di funzione, ci sono anche proteine specifiche di singoli patogeni con ruolo nella patogenesi. Per esempio, lo Streptococcus Pyogenes ha una proteina che attraversa tutta la parete di peptidoglicani sporgendo all’esterno e ha la proteina M, ovvero una lunghissima proteina fibrillare che ha due componenti, due fibrille lunghe e è molto variabile, è conservata nella parte trans membranosa e è invece ipervariabile nella parte terminale. Questo significa che questo batterio può esprimere in superficie proteine M completamente diverse tra loro. È il primo punto di contatto, per esempio, con le cellule ospite da infettare, soprattutto per esempio le cellule della mucosa faringea. È uno streptococco molto importante, causa della tonsillite batterica. È la prima causa nei bambini in ambito scolastico e meno frequente negli adulti invece. Questo batterio può essere preso più volte proprio a causa di questa proteina M ipervariabile, perché non è che non si forma una memoria immunitaria, ma se si entra in contatto con diverse proteine M è chiaro che avremo stimoli immunitari diversi.

Nei gram negativi la situazione è leggermente diversa, esiste il peptidoglicano con lo stesso ruolo dei gram positivi, ruolo protettivo, ma è sormontato da una seconda membrana, la membrana esterna, dove lo spazio tra membrane prende il nome di spazio periplasmatico o periplasma. Qua si immerge i peptidoglicani con altri complessi enzimatici e proteine. La membrana esterna si differisce in struttura, in realtà non è giusto dire che non sia un doppio strato fosfolipidico, tuttavia l'emifoglietto esterno, quindi il secondo strato, quello più esterno appunto, è solo in parte fatto da fosfolipidi, perché una altissima concentrazione è fatto da una molecola importante che è il lipopolisaccaride detto anche endotossina batterica che agisce come tossina per gli ospiti che vengono infettati. Questa endotossina ha una parte lipidica (a contatto con le code dei fosfolipidi dell’emifoglietto interno) e una polisaccaridica sporgente, da qui il nome lipo-polisaccaride. Tuttavia, non è l’unico componente, ci sono le lipoproteine che attaccano la parte fosfolipidica interna della membrana esterna al peptidoglicano nel periplasma, inoltre nella membrana esterna ci sono le porine, ovvero grandi proteine che formano pori transmemebranosi che lasciano passare acqua e molecole in generale. Inoltre ci sono anche le OMP (Out Membrane Proteins) che sono di varie funzioni, segnalatorie, ecc..

Tornando al lipopolisaccaride è SOLO nei gram negativi perché c’è solo nella membrana esterna e abbiamo detto essere fatta dalla parte lipidica e parte polisaccaridica, dove la prima è la parte che svolge due funzioni: permette l’ancoraggio in membrana e è inoltre responsabile della tossicità per le cellule ospite. La parte polisaccaridica si compone di due parti, una che si chiama core e una invece antigene-O. La prima si compone da ripetizioni di pochi zuccheri e generalmente si conserva a livello interspecie, per esempio tutti gli E. Coli condividono la composizione del core, mentre la parte terminale, dell’antigene O è molto più variegata, si compone di unità ripetute di monosaccaridi molto diversi da specie a specie e anche nella singola unità batterica. Quindi due ceppi diversi di E. Coli, per esempio, possono avere un LPS che ha una parte terminale diversa da un’altra specie di E. Coli. Questi gruppi vengono chiamati con la lettera O con un numero per esempio O-157, indicando una parte specifica della porzione esterna dell’antigene O.

Questo è molto importante perché permette di classificare i microorganismi. E l’O-157 è un Coli molto famoso perché infatti ci sono sottogruppi di Coli patogeni, detti coli patogeni che sviluppano vari fattori di virulenza, producendo proteine specifiche (per esempio che sono adesive, oppure che danno tossicità) che li rendono patogeni, contrariamente ai più comuni non patogeni. In particolare, questa specie è molto famosa perché è l’agente eziologico di una enterite emorragica molto importante. Quindi è proprio solo questa parte antigenica che crea la risposta immunitaria. Inoltre, in ambito di laboratorio dispongo di diversi sieri con anticorpi contro i diversi tipi di polisaccaride O e posso così individuare il tipo di batterio che ho, perché si verifica una reazione di agglutinazione in cui si ha una coagulazione nella sospensione batterica tra gli anticorpi e gli antigeni batterici. Se invece la reazione negativa non succede nulla e nulla cambia in sospensione. Questo mi consente di fare una tipizzazione del batterio. Questa endotossina LPS è molto pa...