Microbiologia

Microbiologia

Microbiologia: termine che deriva dal greco (micros = piccolo e bios = vita). Studia quelle forme di vita invisibili ad occhio nudo come microorganismi e virus. I virus sono strutture subcellulari, molto semplici, che non sono però vive. La microbiologia studia forma, struttura, riproduzione, fisiologia e metabolismo di questi organismi, e studia inoltre la loro distribuzione in natura e le relazioni tra di essi e nei confronti dell’uomo.

Divisioni della microbiologia

• Batteriologia: batteri;
• Micologia: funghi e miceti;
• Protozoologia: protozoi;
• Virologia: virus.

Ciascuna entità vivente ha un proprio ruolo, e anche i microorganismi hanno il proprio, principalmente nel mantenimento dell’equilibrio biologico sul pianeta. Alcuni di questi microorganismi hanno però capacità di infettare un organismo ospite e replicarsi al suo interno. Vengono utilizzati dall’uomo come modelli sperimentali per studiare genetica molecolare e fisiologia cellulare, oltre che per la produzione di sostanze utili all’uomo come vaccini, antibiotici, vitamine, insulina ecc…

Batteriologia

I batteri possono essere suddivisi in due categorie dal punto di vista ecologico:

• Saprofiti: batteri che conducono una vita libera nell’ambiente;
• Parassiti: batteri che conducono una vita a spese di altri organismi. Il rapporto tra questi batteri e l’ospite può essere:
  • Commensalismo: rapporto reciprocamente indifferente, ovvero che nessuno dei due organismi trae vantaggio dall’altro. In certi casi, uno dei due organismi trae un minimo vantaggio dall’altro;
  • Simbiosi: rapporto mutualmente vantaggioso, ovvero entrambi gli organismi traggono vantaggio gli uni dall’altro (leguminose e batteri azoto fissatori; licheni);
  • Patogenicità: se il parassita è patogeno vanno a causare danni tissutali e/o funzionali all’ospite. A seconda del processo infettivo si possono suddividere i batteri in:
    • Occasionali: batteri, anche saprofiti, che entrando nell’organismo umano possono causare patogenicità;
    • Obbligati: non possono replicarsi se non all’interno di un organismo;
    • Opportunisti: sfruttano un’opportunità, data dall’immunodepressione di un organismo. Sfruttano ciò per causare danno, e possono farlo solo a causa dell’abbassamento delle difese immunitarie (se entrassero in un ospite sano non dovrebbero causare problemi).

Ci sono casi in cui il sistema immunitario dell’ospite non funziona bene, come ad esempio neonati, vecchi e donne in gravidanza (per evitare che il sistema immunitario attacchi il feto), ma ci sono anche condizioni in cui l’immunodepressione deve essere indotta, per evitare ad esempio rigetti in pazienti trapiantati.

Infezione

Infezione: colonizzazione dei tessuti dell’organismo da parte dei batteri che causano uno sviluppo della popolazione batterica. Il processo infettivo dipende dall’equilibrio che si instaura tra l’uomo e il batterio, che si basa sull’unione dalle caratteristiche del batterio, dalle condizioni fisiologiche dell’ospite e dalla capacità di sviluppare una risposta immunitaria (soggetto immunocompetente o immunodepresso). A seconda della provenienza dell’agente patogeno l’infezione può essere:

• Endogena: organismi già presenti nel corpo come organismi commensali. Gli organismi provengono dalla flora microbica normale, ovvero quell’insieme di batteri che entrano in contatto con l’uomo fin dalla nascita (anche quelli presenti nel canale vaginale e nell’aria al momento dell’uscita), dove i microorganismi colonizzano il corpo localizzandosi principalmente nelle mucose interne come quella oculare, orale, vaginale, intestinale ecc…. La popolazione batterica in un determinato punto prende il nome di microbiota (o flora commensale). Questi batteri sono molto importanti perché hanno la capacità di produrre vitamine (K e B12), ostacolare i batteri esogeni (perché impediscono ad essi di colonizzare tessuti in cui sono già presenti i commensali), produrre sostanze che inibiscono o eliminano patogeni esogeni, stimolare il tessuto linfatico associato alle mucose (MALT, molto presente nelle mucose intestinali), e infine produrre anticorpi naturali (che ci proteggono da eventuali infezioni di patogeni esogeni). La maturazione del microbiota umano si determina al raggiungimento di un certo equilibrio, molto delicato, a circa 2 anni dalla nascita. Le infezioni endogene sono generate quindi da quattro possibili cause:
  • Espansione numerica abnorme di una o più specie microbiche commensali causata da squilibri degli ecosistemi microbici (es. infezione da candida dovuta a terapia antibatterica che promuove lo sviluppo del fungo provocando patogenicità);
  • Trasferimento di microorganismi commensali da un distretto ad un altro in cui non sono solitamente presenti;
  • Alterazione (decadimento) dello stato fisiologico dell’organismo a causa di ospedalizzazione;
  • Depressione del sistema immunitario e della risposta antibatterica.
• Esogena: organismi provenienti dall’ambiente esterno. Esistono barriere fisiologiche che impediscono l’entrata di patogeni dall’esterno, come ad esempio i lisozimi e la flora normale del cavo orale. Anche la pelle funge da barriera grazie alla presenza sia del microbiota relativo che di sostanze lipidiche antibatteriche; nel naso e in tutto il tratto respiratorio sono presenti ciglia e muco ad ostacolare l’entrata dei patogeni, mentre nello stomaco sono presenti muco e fagociti. L’arrivo nell’organismo di patogeni avviene a partire da una sorgente esterna, la quale può essere:
  • Materiale inanimato infetto;
  • Animali infetti: zoonosi;
  • Uomo infetto;
  Dalla sorgente, il patogeno può arrivare all’uomo secondo diverse vie di trasmissione:
  • Alimentare: corre lungo il circuito oro-fecale (entra dalla bocca ed esce tramite le feci, che diventano a loro volta un nuovo mezzo di trasmissione di infezioni per altri organismi);
  • Aerea, respiratoria o inalatoria: tramite l’espulsione di goccioline di saliva, e interessa il cavo respiratorio;
  • Sessuale: tramite contatto delle mucose genitali. Il microorganismo ha la tendenza di avere una vitalità molto labile e perciò tende stare all’interno di queste mucose;
  • Parenterale: tramite inoculazione in tessuti profondi o sangue, ad esempio per iniezione con siringhe non sterili.

I microorganismi possono trasmettersi tramite veicoli inanimati, come oggetti, o vettori animati, come zanzare e pulci. La trasmissione interumana può avvenire sia per via orizzontale, ossia da un individuo malato o portatore sano ad uno sano (tramite le varie vie di trasmissione viste), o per via verticale, ovvero dalla madre al figlio, che può seguire diverse vie di trasmissione:

• Infezione congenita: dalla madre al feto per via transplacentare, e quindi concepita in utero;
• Infezione perinatale: dalla madre al neonato durante l’espulsione attraverso il canale vaginale;
• Infezione postnatale: dalla madre al neonato attraverso l’allattamento.

Questo tipo di infezioni possono essere evitate o limitate sapendo a priori se la madre è infetta o meno (es. se madre affetta da AIDS è sconsigliato il parto per via naturale e l’allattamento). Una volta generatasi, l’infezione esogena si trasforma, nella maggior parte dei casi, in malattia. Il tempo che intercorre tra infezione e malattia è detto tempo di incubazione, e solo quando si manifestano i primi sintomi si può davvero parlare di malattia. Il passaggio da infezione a malattia è dato nel momento in cui il patogeno/virus riesce ad avere il sopravvento sulle difese immunitarie dell’ospite, o eventualmente quando quest’ultime sono compromesse (→ infezione opportunistica).

Organizzazione cellulare

Le cellule si organizzano fondamentalmente in due modalità:

• Procariotica: cellule con assenza di compartimentazione cellulare;
• Eucariotica: cellule con presenza di compartimentazione cellulare.

Le differenze sostanziali sono:

A seconda del tipo di parete cellulare, i batteri possono essere classificati e riconosciuti in prima battuta tramite l’effettuazione di colorazioni specifiche. Queste possono essere di due tipi principali:

• Semplice: colorazione con un solo colorante. Si basa sulla differenza di carica tra parete cellulare del batterio e colorante, che può essere acido (+) o basico (-). Se le due entità hanno stessa carica, il colorante non riesce a penetrare la cellula batterica e colorerà il fondo, rendendo visibile la cellula per contrasto; se le due entità hanno invece carica opposta, il colorante penetrerà nella cellula rendendola colorata e visibile;
• Differenziale: colorazione con due coloranti, uno di fase e uno di contrasto. La colorazione differenziale più importante è la colorazione di Gram. A seconda di come si colorano, suddividiamo i batteri in Gram +, se assorbono il primo colorante, e in Gram -, se assorbono il secondo. Esistono poi dei batteri alcool – acido resistenti, come i micobatteri, che sono microorganismi che si comportano da Gram variabile, ovvero si colorano sia con un colorante che con l’altro a seconda del momento in cui viene effettuata la colorazione. La colorazione di Gram non sarà quindi più efficace, e bisognerà perciò usare la colorazione di Ziehl – Neelsen. È una colorazione, sempre di tipo differenziale, che sfrutta l’alcool – acido resistenza dei micobatteri. Come primo colorante viene utilizzata la fucsina fenicata, ovvero una miscela di fucsina e fenolo. La scelta di questo colorante è data dal fatto che quest’ultimo deve essere fatto penetrare forzatamente a causa della particolare struttura dei micobatteri, ed essendo il fenolo un buon denaturante favorirà l’entrata del colorante. La colorazione viene spinta anche tramite riscaldamento con fiamma Bunsen, che dovrà essere utilizzata una volta aggiunta la fucsina per portarla a riscaldamento fino a sviluppo di vapore. Una volta entrato, il colorante non può più essere rimosso a causa della grande forza con cui esso si lega alle strutture del batterio. Anche usando acido solforico, infatti, il colore non viene rimosso. Si aggiunge infine il colorante di contrasto, che non andrà a colorare i micobatteri ma rimarrà sullo sfondo.

Queste colorazioni vedono come ultimo step l’utilizzo di un microscopio ottico per il riconoscimento dei batteri e la verifica dell’avvenuta colorazione. Questo strumento, però, ha un’applicabilità limitata perché non permette innanzitutto la visualizzazione di batteri più piccoli di 1 nm, e in secondo non consente la visualizzazione tridimensionale della struttura esterna del batterio (fornisce solo informazioni bidimensionali). Per fare ciò, quindi, si utilizzano microscopi elettronici, che sfruttano un fascio di elettroni invece che di luce. Possono essere di due tipi:

• Trasmissione (TEM): otteniamo un’immagine molto dettagliata sia dell’esterno che dell’interno del campione, ma richiede una sezione dell’oggetto che viene effettuata tramite un microtomo. Il fascio elettronico attraversa il campione completamente e non fornisce informazioni riguardo alla tridimensionalità dell’oggetto;
• Scansione (SEM): non necessita di sezionare il campione, e fornisce un’immagine tridimensionale della superficie esterna, non trapassando l’oggetto.

Classificazione dei batteri

I batteri possono poi essere classificati anche secondo forma e aggregazione:

• Cocchi: forma sferica. Possono aggregarsi in:
  • Diplococco: coppia di cocchi;
  • Tetrade: 4 cocchi;
  • Sarcina: 8 cocchi;
  • Streptococco: catenella di cocchi;
  • Stafilococco: grappolo di cocchi.
• Bacilli: forma allungata, cilindrica. Possono aggregarsi in:
  • Diplobacillo: coppia di bacilli;
  • Streptobacilli: catenella di bacilli;
  • Coccobacilli: di forma intermedia tra cocco e bacillo.
• Spirali: particolare tipo di bacillo con forma spiralica. Diversi tipi:
  • Vibrione: singola curva sull’asse principale. Detto anche bacillo virgola;
  • Spirillo: bacilli molto lunghi con più curvature sull’asse principale;
  • Spirocheta: più sottili degli spirilli e spiralizzate attorno al loro asse principale.

Struttura della cellula procariotica

• Nucleo: libero nel citoplasma (o eventualmente ancorato alla membrana cellulare) e formato da un unico cromosoma. È di forma circolare ed è superspiralizzato. A seconda della cellula batterica, possono essere presenti ulteriori componenti genetiche staccate dal nucleo e chiamati plasmidi. Sono in grado di replicarsi autonomamente, a differenza del DNA batterico, e a seconda del numero di plasmidi i batteri possono essere divisi in mono-copia (1 solo) e multi-copia (≥1);
• Citoplasma: sede della replicazione e della trascrizione del materiale genetico, oltre che essere la sede del metabolismo batterico. Sono presenti granuli, ovvero organuli di accumulo di determinate sostanza che il batterio immagazzina a scopo di riserva;
• Ribosomi: liberi nel citoplasma o associati in catenelle detti polisomi. Sede della sintesi proteica. Sono ribosomi 70S, costituiti da 2 subunità:
  • 30S: formato da rRNA 16S e 21 diverse proteine;
  • 50S: formato da rRNA 5S e 23S, più 34 diverse proteine.
• Membrana cellulare: formata da un doppio strato fosfolipidico. Possiede proteine transmembrana e glicoproteine, oltre che presentare catene lipidiche quali gli opani (sostituiscono il colesterolo delle eucariote). Ha diverse funzioni:
  • Permeabilità e trasporto di metaboliti;
  • Trasporto di elettroni e fosforilazione ossidativa: funzioni solitamente svolte dal mitocondrio;
  • Funzioni biosintetiche;
  • Secrezione di enzimi;
  • Ruolo nella divisione cellulare;
  • Formazione di spore.
• Parete cellulare: formata da una serie di involucri e organizzata in modi diversi:
  • Gram+: struttura esterna formata da uno strato spesso di peptidoglicano. All’interno delle maglie formate dal peptidoglicano si calano delle catene di acido teicoico (molecola di glicerolo esterificata con due gruppi fosfato, legata infine ad un gruppo laterale R) e acido lipoteicoico (componente R lipidica), le quali rendono la struttura globalmente più compatta oltre che ancorare il peptidoglicano alla membrana;
  • Gram-: struttura esterna formata da uno strato molto sottile di peptidoglicano, circondato da un ulteriore involucro a doppio strato fosfolipidico detto membrana esterna. Lo strato in cui è immerso il peptidoglicano è detto spazio periplasmico, ed è riempito con periplasma. La membrana esterna è costituita da un componente particolare ed esclusivo dei Gram- chiamato lipopolisaccaride, formato da:
    • Lipide A: componente lipidica ed endotossina batterica, ovvero la parte tossica del batterio. È la parte della molecola immersa nella membrana, ed è formata da glucosammina legata ad acidi grassi a lunga catena. Si lega alla parte polisaccaridica tramite acido chetodesossiottanoico (KDO);
    • Antigene O – specifico (o somatico): componente polisaccaridica, rivolta verso l’esterno della membrana. È ramificato ed è ancorato al resto della struttura grazie ad un core polisaccaridico costituito da KDO e zuccheri quali eptosio, glucosio, galattosio e N-acetilglucosammina.
    Sono poi presenti le lipoproteine di Brown, ovvero proteine transmembrana che si legano con la parte lipidica alle due membrane e quella proteica a fare da ponte, con lo scopo di ancoraggio della membrana esterna a quella plasmatica; eventualmente, possono fermarsi allo strato di peptidoglicano. Sono poi presenti delle proteine transmembrana idrofile, dette porine, che permettono il passaggio di metaboliti dall’esterno della cellula verso l’interno. Il batterio è in grado di modificarle per evitare l’ingresso di determinati farmaci sviluppando resistenza;
  • Gram variabili: struttura esterna formata da uno strato sottile di peptidoglicano appena fuori la membrana plasmatica, a sua volta legato ad una serie di zuccheri complessi come arabinogalattani e lipoarabinomannani, che insieme formano una struttura molto complessa e compatta. Sono presenti anche cere e acidi grassi detti acidi micolici; la maggior parte della parete è perciò di natura lipidica e perciò rende molto impermeabile la struttura.

Il peptidoglicano è un polimero costituito in parte da peptidi e in parte da zuccheri. L’unità monomerica del peptidoglicano è costituito da N-acetilglucosammina (NAG) legata con un legame glicosidico all’acido N-acetilmuramico (NAM); da quest’ultimo, dipartono 4 amminoacidi in questo ordine: L-alanina, D-acido glutammico, acido m-diamminopimelico (tipico dei batteri) e D-alanina. I singoli monomeri si associano a formare il polimero corrispondente, generando legami glicosidici tra NAG e NAM e legami peptidici tra il 3° aa di un’unità monomerica e il 4° aa della seconda unità; a sua volta, questa userà il suo 3° aa per fare un nuovo legame. Nei Gram+, però, il legame tra le varie unità è rinforzato…