Microbiologia

Virologia

Cos’è un virus?

Un virus è un microrganismo, un agente in grado di infettare, di piccole dimensioni e di composizione molto semplice, che può moltiplicarsi solamente all’interno di cellule animali, batteriche o vegetali.

⇒ Per moltiplicarsi i virus devono parassitare una cellula: sono parassiti endocellulari obbligati.

I virus possono infettare cellule animali o vegetali oppure batteriche.

“Virus” deriva dal latino “virus”, che significa veleno.

Definizione di Baltimore (Nobel 1986): a piece of bad news enwrapped in a protein coat.

Origine dei virus

Non sappiamo esattamente da dove derivino i virus, quando siano comparsi per la prima volta e come abbiano fatto ad evolversi. Esistono 3 teorie diverse, ma non ce n’è una vincente rispetto alle altre.

1. Teoria regressiva: i virus derivano da parassiti intracellulari che erano inizialmente molto più complessi e per motivi di evoluzione hanno perso tutte le strutture inutili mantenendo solamente le strutture essenziali.
2. Teoria dell’origine cellulare: i virus derivano da cellule eucariotiche che per motivi evolutivi hanno ridotto al minimo la loro struttura creando i virus. Sembra potenzialmente che i virus derivino dai mitocondri.
3. Teoria dell’entità indipendente: i virus sono nati per sé stessi (coevoluzione con altri agenti viventi).

L’ultima teoria è quella che sembra maggiormente accreditata e si basa sul fatto che perché un agente vivente abbia origine è richiesta la capacità del microrganismo di riprodurre se stesso, il che implica l’autocatalisi intrinseca: è necessario che qualche cosa abbia in sé tutte le possibilità di riprodursi.

Le molecole con proprietà catalitiche sono le proteine, ma non sono in grado di riprodurre sé stesse.

Invece gli RNA sono in grado sia di contenere informazioni genetiche sia di catalizzare reazioni.

Sono stati scoperti RNA con attività autocatalitica → i virus potrebbero essere comparsi nel mondo insieme agli RNA, circa 5 milioni di anni fa (prima o in contemporanea con le prime cellule).

1500 a.C.: si suppone che già ci fosse la poliomielite, paralisi flaccida che colpisce prevalentemente uno dei due arti inferiori.

Il primo virus umano scoperto nel 1901 è quello della febbre gialla, poi quello della rabbia nel 1903, nel 1933 l’influenza, ecc… 2

I virus sono organismi viventi?

Il dibattito è ancora aperto.

Le caratteristiche necessarie per definire qualcosa vivente sono:

• Crescita: deve essere in grado di aumentare il numero delle proprie componenti. Per il virus non succede, perché un virus esce dalla cellula esattamente come entra.
• Organizzazione: nei virus non è complessa.
• Riproduzione: gli elementi viventi sono in grado di riprodurre sé stessi utilizzando DNA/RNA. I virus portano un’informazione genetica grazie alla quale possono riprodursi, ma necessitano della struttura riproduttiva della cellula che infettano.
• Capacità di adattarsi: sono in grado di evolvere, ma non perché hanno una spinta intellettuale, grazie al caso e alla necessità. I virus più dinamici introducono a volte mutazioni nelle loro riproduzioni.
• Risposta agli stimoli: un virus risponde ad alcuni stimoli chimici, ma è comunque frutto di una casualità e necessità.

Evoluzione dei virus

I virus possono evolvere, seguono l’evoluzione in base al caso e alla necessità. Per un virus evolversi significa cambiare il proprio assetto genomico, introdurre mutazioni nel proprio genoma.

Non tutti i virus introducono mutazioni all’interno del proprio genoma.

Le mutazioni avvengono tutte le volte che il genoma del virus si riproduce.

Esistono virus con genoma a RNA e virus con genoma a DNA. Quelli più propensi a evolvere sono i virus con genoma a RNA, perché le polimerasi che utilizzano hanno una attività proof-reading molto bassa. Quindi le mutazioni inserite sono dovute al fatto che la RNA polimerasi è poco in grado di correggere i propri errori. 4 5

In media vengono introdotte 1 mutazione ogni 10⁴/10⁵ nucleotidi polimerizzati.

I virus a DNA invece sono molto più conservati e stabili, perché usano delle DNA polimerasi con attività proof-reading maggiore. Mantengono specie-specificità, hanno tropismo ristretto, causano la stessa risposta immunitaria.

Un virus non può mai modificare la propria natura: un virus a DNA non può mai diventare a RNA e viceversa.

Non cambia la struttura conformazionale, la struttura del rivestimento proteico.

Tendenzialmente nessun virus introduce troppe mutazioni perché la finalità è sempre quella di riprodursi → non deve uccidere l’ospite che infetta.

Generalità sui virus

Uno dei virus più grandi conosciuti (vaiolo) raggiunge un ø di 300-400 nm. Il più piccolo (poliovirus) ha un ø di 30 nm.

Non si conoscono virus con diametro superiore al 3 μm.

Tutti i virus sono composti da due componenti fondamentali:

• Genoma: una singola molecola di DNA oppure di RNA, porta l’informazione genetica.
• Capside: riveste la molecola. È una struttura proteica composta da subunità proteiche (capsomeri).

Genoma + capside = nucleocapside.

Esistono alcuni virus che per loro natura hanno una terza struttura che ricopre il capside, ancora più esterna, detta envelope. L’envelope è biochimicamente identico alla membrana cellulare delle nostre cellule, costituito da un doppio strato fosfolipidico. I virus che hanno l’envelope lo devono sempre mantenere.

Viruses components (2)

I virus senza envelope vengono detti virus nudi.

3. Envelope

Virione: è in grado di infettare una cellula perché ha tutte le componenti necessarie.

• Phospholipidic Double Layer

Envelope VIRUS without envelope NAKED VIRUSES

Sul doppio strato fosfolipidico dell’envelope vi sono poche proteine. L’envelope deriva dalla cellula che viene infettata.

Un virus con envelope entra nella cellula, deve riprodursi: quando esce dalla cellula deve avere anche l’envelope prendendolo dalla cellula stessa. Preleva un pezzo di membrana cellulare, esce per budding (esocitosi in una sorta di vescicola).

Le proteine nell’envelope sono di natura virale, codificate dal virus. Questo è possibile perché nella replicazione il virus traduce delle proteine tra cui quelle dell’envelope e le trasporta sulla superficie della cellula.

WHERE THE ENVELOPE COMES FROM

Quando il virus deve uscire viene avvolto dalla membrana cellulare della cellula che presenta le proteine proprie del virus.

L’envelope quindi è una struttura ibrida.

La funzione dell’envelope è di rivestimento esterno, quindi essendo la parte più esterna del virione presenta le proteine che riconoscono la cellula da infettare, sono i recettori virali che riconoscono i recettori cellulari.

Sono anche le strutture antigeniche maggiori, cioè quelle contro le quali il sistema immunitario crea gli anticorpi.

Funzioni:

• Recettoriale
• Antigenica 4

L’envelope è una struttura abbastanza debole, quindi i virus con envelope sono meno resistenti all’ambiente (possono essere aggrediti da detergenti per i lipidi).

Capside

Tutti i virus hanno un capside di natura esclusivamente proteica, molto adatta a proteggere il genoma. Per i virus nudi è la parte più esterna, quindi ha natura antigenica per il sistema immunitario. Tutti i capsidi sono costituiti da subunità monomeriche.

La disposizione nello spazio dei capsomeri determina il fatto che tutti i capsidi conosciuti in natura siano riconducibili a due diverse simmetrie:

• Icosaedrica
• Elicoidale
• (Complessa): non riguardano l’uomo, sono pochi.

Un virus non può modificare la disposizione dei propri capsomeri, nonostante possano essere introdotte variazioni amminoacidiche nella composizione delle proteine.

La struttura simmetrica serve per avere la massima stabilità, il numero di legami è il minore possibile e l’energia di legame è minore.

5 PROTOMERS

12 PENTAMERS

Il virus crea un’unica proteina semplice di un numero limitato di aminoacidi usando una piccola porzione del proprio genoma, poi se ne assemblano moltissime ripetizioni → viene economizzato il genoma.

I capsidi si assemblano da soli e i legami non sono covalenti ma deboli, ⇒ perché devono essere facilmente scindibili all’interno della cellula: struttura dinamica.

Simmetria icosaedrica: ciascuna faccia triangolare (capsomero) è formata da 2/3 proteine. La simmetria icosaedrica prevede 3 assi di simmetria attorno a cui si dispongono i vari capsomeri, costituendo l’icosaedro.

PICORNAVIRUS 12 PENTON

Simmetria elicoidale: i capsomeri sono disposti a chiocciola intorno al genoma. La ripetitività è molto elevata, le interazioni sono basse. La forma è allungata.

ADENOVIRUS 12 PENTONS, FIBERS AND 240 EXON

Simmetria complessa: non è riconducibile a regole matematiche, presenta forme complicate (ad esempio il vaiolo o i batteriofagi).

Genoma

• Dimensione: 3.000-2.000 bp.
• RNA vs DNA: il 30% dei virus in grado di infettare l’uomo ha un genoma a DNA. Il 70% ha genoma a RNA.
• Natura degli strand del genoma: tutti i virus che studieremo hanno DNA double-stranded tranne i parvovirus, che sono a singolo filamento. Tutti i virus a RNA che studieremo sono single-stranded. 5
• Polarità degli strand (nei virus a RNA): senso (+) o antisenso (-). I virus a RNA + e quelli a RNA - si replicano in modo diverso.
• Lineare vs circolare: il genoma a RNA è sempre lineare.
• Molecola unica o suddivisa in segmenti: riguarda la molecola di RNA, che può essere segmentata in diverse parti.

Eccezione: il virus dell’epatite B ha un genoma a DNA double stranded circolare incompleto → un filamento è completo, l’altro presenta dei gap.

Regola generale

• I virus a DNA si replicano nel nucleo della cellula ospite.
• I virus a RNA si replicano nel citoplasma.

Eccezione: il virus dell’influenza orthomyxovirus si replica nel nucleo.

Un RNA + ha polarità come quella del mRNA, è codificante. Un genoma - è complementare di un mRNA. Un virus a RNA + è direttamente infettante, perché il suo genoma può legare direttamente i ribosomi, quindi per la stretta replicazione non serve envelope o capside.

Un virus a RNA - deve essere convertito in mRNA per tradurre le proprie proteine → tutti i virus con RNA - portano con sé nel virione una RNA polimerasi RNA-dipendente, che serve per creare mRNA.

Tutti i virus si dividono in famiglie. La famiglia che comprende i virus ha come suffisso -viridae. In ciascuna famiglia ci sono dei generi. All’interno di ciascun genere ci sono i singoli virus.

RNA viruses

Es: famiglia: picornaviridae; genere: enterovirus; virus: poliovirus.

In una famiglia sono compresi virus con le medesime caratteristiche morfologiche e strutturali.

Virus a RNA

From Principles of Virology Flint et al ASM Press # 6

DNA viruses

Virus a DNA!

Replicazione virale

Tutti i virus hanno un unico scopo: moltiplicarsi per poter uscire dalla cellula e infettarne un’altra.

Devono riprodurre esattamente identica la particella virale, replicare il proprio genoma, creare le proteine del capside che rivestano la molecola genomica, trascrivere e tradurre i propri geni.

Tutto è contenuto nelle informazioni genetiche con l’ausilio della cellula: il genoma e la cellula interagiscono. Il virus per continuare la propria replicazione deve nascondersi dal sistema immunitario, poiché nell’organismo appena viene individuato un elemento estraneo viene scatenata la risposta immunitaria. A questo punto si ha infezione del virus nella cellula che può scaturire in malattia.

Un ciclo replicativo avviene in modo diverso in base al virus, ma ci sono degli step comuni:

1. Trovare una cellula in cui replicare.
2. Legarla → binding.
3. Entrare all’interno della cellula → ingresso o penetrazione.
4. Svestirsi, liberarsi del proprio capside → uncoating.
5. Replicazione del genoma.
6. Trascrizione e traduzione delle proteine virali.
7. Assemblaggio del virione maturo.
8. Uscita del virus dalla cellula. 7

Ciclo vitale dei virus

4 tipi di microbi:

1. Virus.
2. Batteri: microrganismi unicellulari.
3. Parassiti: protozoi uni/pluricellulari.
4. Funghi.

I virus e i batteri hanno l’unico obiettivo di replicarsi, secondo un istinto presente nel codice genetico.

I virus maturi fuori dalle cellule sono una struttura cristallizzata, non fanno nulla → sono incapaci di qualunque forma di vita. Eppure sono classificati tra gli esseri viventi perché quando entrano nelle cellule sono in grado di moltiplicarsi ed avere il controllo della propria moltiplicazione (il che è la base della vita).

Ci sono virus di tutte le cellule viventi → laddove c’è una cellula ancestralmente si sono organizzati dei virus.

La replicazione avviene quindi in una cellula e richiede alcuni compiti:

1. Trovare una cellula in cui entrare.
2. Legarsi a quella cellula → binding.
3. Entrare all’interno della cellula → ingresso o penetrazione.
4. Svestirsi, liberarsi del proprio capside per permettere al genoma di essere libero nella cellula → uncoating.
5. Replicazione del genoma.
6. Trascrizione e traduzione delle proteine virali.
7. Assemblaggio del virione maturo.
8. Uscita del virus dalla cellula.

Immediatamente i nuovi virus riprendono il ciclo replicativo.

Avere l’envelope o non averlo può essere un vantaggio o meno: l’envelope è fatto da glicoproteine, i capsidi di proteine. I capsidi sono resistenti, mentre l’envelope può essere disorganizzato con dei detergenti per i lipidi. Per un virus non esiste il concetto di morte ma di inattivazione, incapacità di compiere il ciclo virale. L’envelope è quindi un fattore di debolezza.

⇒ Non c’è un finalismo: il virus si è adattato a entrare in un organismo e usarlo per replicare. Per un virus ammazzare l’organismo è svantaggioso → devono appoggiarsi a un organismo per replicare. 8

La replicazione di un virus a RNA avviene nel citoplasma e non coinvolge il nucleo (generalmente). Eccezioni: influenza e HIV.

Al contrario, i virus a DNA replicano il loro DNA nel nucleo.

1. Cell attachment: adsorbimento

È solo il legame con la superficie della cellula, fondamentale. Il primo step nella replicazione è la capacità di legarsi alla cellula corretta. I virus umani si sono adattati agli esseri umani e ci convivono.

Uno dei principi alla base dell’adattamento è che i virus si sono specializzati a infettare un numero ristretto e selettivo di cellule → tropismo virale. Fortunatamente non c’è un virus pantropo che infetti tutte le cellule. Per replicarsi i virus frenano l’attività della cellula, la uccidono e la distruggono.

Il riconoscimento dipende dalla presenza sulla superficie del virus di recettori virali che trovano una controparte sulla cellula, recettori cellulari. La specificità è assoluta. L’interazione è specifica, ma puramente fisica. Solitamente le due strutture sono fatte in maniera complementare per via della sequenza amminoacidica. Di solito i recettori virali sono altamente conservati → tendono a rimanere stabili e non cambiare, perché il legame è fondamentale per la capacità di replicarsi.

Recettori virali:

• Molecole appartenenti alla superfamiglia delle immunoglobuline.
• Recettori associati alle membrane.
• Canali e trasportatori transmembrana.

I virus utilizzano molecole richieste per le normali funzioni cellulari.

Il tropismo determina il tipo di cellule in cui un virus si replica. Tutto quello che avviene nella fase iniziale è fondamentale per le fasi successive. Es: HIV si lega a CD4 sui linfociti T, infetta le cellule del sistema immunitario che dovrebbe combatterlo → AIDS, sindrome da immunodeficienza primaria. 9

2. Penetrazione

I virus solitamente entrano per endocitosi (fusione), si forma un’invaginazione e una vescicola.

Nel citoplasma la vescicola si rompe e il virus è nel citoplasma.

I virus con envelope entrano per fusione di membrana.

3. Svestimento

I capsidi hanno una funzione protettiva. L’ambiente extracellulare del corpo umano è estremamente ostile per l’RNA, che può andare incontro a degradazione.

La doppia elica di DNA invece possiede una certa stabilità. Il capside è estremamente compatto e in alcuni casi molto resistente. Se il capside non si sciogliesse disaggregando le proteine, diventerebbe un ostacolo alla replicazione → le proteine si aggregano automaticamente e si dissolvono appena è necessario grazie a una serie di segnali scambiati fra la cellula e il capside.

Lo svestimento è lo stadio meno compreso della replicazione.

4. Espressione e replicazione del genoma virale

I virus conducono la propria replicazione. Un enzima dà il via alla realizzazione degli acidi nucleici → polimerasi, i genomi dei virus devono contenere un gene della propria polimerasi, enzima centrale della vita dei virus perché ne determina la replicazione.

Per uscire nuovamente, il virus deve avere capside e eventualmente envelope quindi i genomi dei virus contengono sicuramente gene per:

• Polimerasi.
• Capside. 10
• Envelope.

La polimerasi entra in gioco nel momento della replicazione.

(Baltimore ha scoperto la trascrittasi inversa, rivoluzione del dogma della biologia)

Ciò che dà origine alla sintesi delle proteine è l’mRNA, detto RNA a polarità positiva o RNA senso. Partendo da questo concetto