Microbiologia

Microbiologia generale

Microrganismi

Con la parola microrganismo (o microbi) si intende qualsiasi organismo tanto piccolo da poter essere visto solo con l'aiuto di un microscopio. Esistono 5 classi di microrganismi: batteri, miceti, virus, elminti e protozoi.

• Batteri: sono organismi procarioti, ossia sono formati da cellule che hanno la caratteristica di essere molto semplici poiché composte esclusivamente da membrana, citoplasma e nucleolo.
• Miceti: eucarioti uni o pluri cellulari.
• Virus: non sono delle cellule ma parassiti intracellulari obbligati.
• Protozoi: sono eucarioti unicellulari, si dividono in varie classi a seconda del tipo di movimento:
  • Ciliati: si muovono grazie a delle ciglia.
  • Flagellati: si muovono grazie ad un flagello.
  • Protozoi-amoebae.
• Elminti: sono eucarioti pluricellulari e sono divisi in tre categorie quali Nematodi, Cestodi e Trematodi.

Batteriologia generale

I batteri sono organismi procarioti privi di nucleo, hanno il DNA localizzato in una zona chiamata nucleolo e non presentano organelli citoplasmatici. Hanno varie dimensioni che vanno da 0,4 a 1.5 micron, visibili attraverso un microscopio ottico. Inoltre, i batteri sono caratterizzati da varie forme:

• Cocchi: rotondi.
• Bacilli: allungati.
• Aspirali: spirochete.
• Virgola: vibrione.
• Altri hanno forme intermedie.

Inoltre, i batteri possiamo trovarli o isolati o raggruppati es: streptococchi, tetradi, stafilococchi e tetradi. Questo accade perché i batteri si riproducono per scissione binaria; una volta moltiplicati se non si separano e rimangono quindi attaccati. Se l'unione è lungo lo stesso piano allora si forma una sorta di collana ed in tal caso si parla di streptococchi. Se lo stesso fenomeno avviene su due piani si parla di tetradi e se infine avviene su tre piani si forma un grappolo e si parla di stafilococchi.

Le parti del batterio sono:

• Membrana cellulare: circonda la cellula ed è fatta da un doppio strato di fosfolipidi con delle proteine di membrana dentro. La membrana cellulare ha due differenze sostanziali rispetto a quella delle cellule eucariote, ossia che non c’è il colesterolo ed avviene la fosforilazione ossidativa.
• Citoplasma: sono presenti cromosomi circolari detti plasmidi, proteine solubili, ribosomi e granuli di riserva di vari materiali.
• Elementi genetici: esistono tre elementi genetici in una cellula batterica:
  • Cromosoma: ossia l’elemento fondamentale in cui risiede il DNA. Tale cromosoma può essere di dimensione variabile inoltre è a doppio filamento ed è circolare. Solitamente è uno solo ma possono essere vari (fino ad un massimo di quattro).
  • Plasmidi: ossia gli elementi genetici accessori, capaci di replicazione autonoma, portano geni per fattori di resistenza ai farmaci e fattori di virulenza.
  • Elementi mobili: dentro al cromosoma si possono staccare e riattacare in altre parti ma non si replicano autonomamente.

Il patrimonio genico nei batteri varia per mutazione che possono essere spontanee o indotte oppure varia a causa di scambi genici che consiste nell’acquisizione di nuovo DNA e/o nella ricombinazione tra sequenze omologhe. Esistono tre meccanismi di scambio genico: trasformazione (cellula ricevente si trova vicino ad una cellula batterica che muore e rilascia il suo DNA esternamente, a quel punto la cellula ricevente lo capta e lo integra al suo), coniugazione (cellula donatrice forma un ponte con la cellula ricevente e scambia il materiale) e trasduzione (fago infetta una cellula quando arriva la distruzione di tale cellula per sbaglio il fago ingloba un pezzetto di DNA e nel momento in cui infetta una nuova cellula gli tramanda anche il DNA della cellula che aveva precedentemente infettato e distrutto).

Parete batterica: ha la caratteristica di dare rigidità alla cellula e di separarla dall’ambiente esterno. È parzialmente permeabile. La parete batterica è formata da peptidoglicani (zuccheri + peptidi). Gli zuccheri sono glucosi modificati e sono:

• NAM = N-Acetil Muramico
• NAG = N-Acetil Glucosammina

Questi due zuccheri sono legati da un legame beta1-4glucosidico (lineare). Attaccato al NAM ci sono quattro amminoacidi che formano un tetra-peptide che vanno a formare legami trasversali tra il terzo amminoacido del primo strato e il quarto di quello successivo. In alcuni casi questo legame è diretto, in altri avviene mediante un ponte amminoacidico di cinque glicine. In sintesi, la parete batterica è composta da peptido-glicano (zuccheri acetilati e peptidi): gli zuccheri sono il NAM (acido N-acetilmuranico, al quale si lega una catena di quattro proteine) e NAG (acido N-acetilglucosamidico). Il legame trasversale (cross-link) si ottiene facendo il legame tra la D-Alanina (quarto amminoacido) di uno strato e il meso Diaminopimelic di un altro (terzo amminoacido), il legame tra NAM e NAG è un legame glicosidico. Alcuni, per facilitare il legame, introducono un ponte di glicine.

La parete batterica va a determinare se un batterio è gram+ o gram-. Per determinare questo esiste una tecnica conosciuta come "colorazione di Gram" che consiste in vari passaggi:

• Prendo la piastra dove ho seminato la colonia batterica e la metto sul vetrino.
• Fisso i batteri al vetrino (con il calore o con l’etanolo), il fissaggio ha lo scopo di uccidere il batterio in modo da poter lavorare tranquillamente e ovviamente di attaccarlo al vetrino.
• Prendo il vetrino e lo immergo in una soluzione di cristal violetto per 1 minuto.
• Prendo il vetrino e lo immergo nel reattivo di Lugol (soluzione ionica) entrambi riappariranno blu.
• Decolora il campione e procedi a un rapido risciacquo. Si usa acetone ed etanolo.
• Colorare nuovamente con safranina o fucsina, i gram+ si colorano di blu i gram- di rosa.

Questo accade perché i gram+ hanno un peptidoglicano più spesso dei gram-, quindi, essendo più grande assorbe il colorante e lo trattiene, il gram- essendo più sottile rilascia il primo colorante blu e quando viene a contatto con il secondo colorante lo riassorbe apparendo rosa.

Parete gram+: è fatta da peptidoglicani all’80% e da strutture fibrillane che si chiamano acidi teicoici.

Parete gram-: è fatta da uno strato fine di peptidoglicani, da uno spazio periplasmatico vuoto con delle proteine e infine c’è una membrana esterna. Nella membrana esterna sono presenti porine e lipopolisaccaridi quali LPS o endotossina. Un lipolisaccaride (LPS) è composto da un Lipide A (con attività tossica), un core (fatto da oligosaccaridi) e un antigene O (struttura ramificata, fino a 40 saccaridi), è quindi composto da tre strati:

1. Lipide A: dentro il doppio strato.
2. Core zuccherino.
3. Antigene O: struttura ramificata fatta da zuccheri.

In sintesi quindi possiamo dire che la parte grassa della membrana esterna è nascosta internamente nel doppio strato mentre la parte zuccherina è esterna.

Capsula: (componente accessoria) è una struttura polisaccaridica che circonda alcuni batteri. Ha il compito di resistere alla fagocitosi ed è quindi un fattore di virulenza, poiché costituisce un ingombro fra il recettore adibito alla fagocitosi di quel batterio e il sito di attacco per il recettore del batterio stesso.

Flagelli: (componente accessoria) organi di movimento formati da flagellino. È composto da tre parti: corpo basale, uncino e filamento. La rotazione del flagello è energia dipendente, i batteri possono avere uno o più flagelli.

Pili: (componente accessoria) presenti soprattutto nei gram-, sono composti da pilina, sono di vari tipi e si differenziano per la funzione anche se quella principale è l’adesione, le funzioni secondarie sono:

1. Coniugazione: tipica dei pili sessuali.
2. Sito di attacco per fagi.

Spore

Le spore sono forme batteriche cripto biotiche adattate a condizioni ambientali sfavorevoli quali essiccamento, variazione di pH, CO₂, O₂ e radiazioni. Le spore sono prodotte da Bacillus, Clostridium, Actinomiceti e Sarcine, inoltre sono naturalmente inattive e possono rimanere in questa condizione molto a lungo anche centinaia di anni finché non si presentano le condizioni adatte per la riattivazione. Strutturalmente parlando le spore sono composte da una parte centrale in cui ci sono i resti della vecchia cellula batterica, poi verso l’esterno abbiamo cortex, tunica primaria, tunica esterna e esosporio. Le caratteristiche fondamentali delle spore sono che:

• Hanno elevata termo resistenza.
• Elevata resistenza ad antibiotici.
• Sopravvivono nei tessuti inanimati.
• Si formano in carenza di nutrienti.
• Metabolicamente crescenti.
• Vivono in condizioni ostiche.

È possibile inattivare la vitalità delle spore con: autoclave, tindalizzazione, incenerimento ecc.

Patogenicità batterica

La patogenicità batterica è la capacità di un batterio di dare malattia, va distinta dalla virulenza che è la misura del grado di patogenicità. I due principali meccanismi di difesa verso le infezioni batteriche sono:

1. Fagocitosi.
2. Cascata del complemento.

L’infezione batterica prevede una serie di fasi quali: entrata in contatto con il batterio, invasione e moltiplicazione. Non tutte le infezioni batteriche portano malattia, essa esiste solo se c’è un danno all’ospite. In caso opposto può accadere che le tre fasi si susseguano senza lo sviluppo di effetti collaterali.

Il batterio può definire con l’ospite varie relazioni:

• Mutualismo: entrambi traggono vantaggio.
• Commensalismo: il batterio ha vantaggi, l’ospite è indifferente.
• Parassitismo: per sopravvivere danneggia l’ospite.

Negli uomini esistono fisiologicamente dei distretti non sterili in cui sono presenti dei batteri. Si definisce microbiota l’insieme della popolazione batterica presente nell’uomo, mentre si definisce microbioma i geni dei batteri presenti nell’uomo. Esistono tuttavia anche dei distretti fisiologicamente sterili come: SNC, organi interni, sangue e urine.

I batteri possono essere divisi in tre classi:

1. Non patogeni.
2. Patogeni opportunisti: causano danno in certi ospiti se si presentano condizioni favorevoli.
3. Patogeni obbligati: causano danno sempre. Questo danno può essere causato dal batterio stesso oppure può essere mediato dall’ospite poiché la risposta immunitaria diventa un’arma a doppio taglio.

Tappe processo infettivo

Il processo infettivo ha quattro fasi:

1. Esposizione al patogeno: siamo continuamente esposti ai patogeni.
2. Adesione ad una mucosa da parte del patogeno: è la prima fase della colonizzazione, l’adesione conferisce al microrganismo la capacità di resistere alla rimozione meccanica operata sulle mucose. Una volta adeso il patogeno può rimanere fermo esternamente oppure può invadere.
3. Invasione: l’invasione avviene in due modi, il primo è passando da cellula a cellula, il secondo è distruggendo il tessuto connettivo.
4. Colonizzazione e produzione di fattori di virulenza: possono dare tossicità o invadere altre parti dando malattia in entrambi i casi.

Il sistema immunitario in tutto questo cerca ovviamente di distruggere il patogeno ma contemporaneamente lui cerca di "distrarre" il s.i per sopravvivere e moltiplicarsi.

Tossine batteriche

Esistono due principali classi di tossine batteriche: endotossine (dentro alla cellula) ed esotossine (rilasciate esternamente alla cellula).

Endotossine: (LPS), fatte da lipidi e zuccheri. In quantità ridotte attiva la cellula bersaglio ma in quantità massicce causa danni importanti come shock settico e coagulazione intravascolare.

Esotossine: emanate sia dai gram+ che dai gram-. Sono fatte da due sub-unità. Fanno parte le neurotossine quali ad esempio le seguenti:

• Tossina tetanica: quando presente in un organismo, si va a posizionare bloccando il rilascio del neurotrasmettitore causando un rilascio continuo di acetilcolina causando paralisi spastica, in assenza di essa invece viene rilasciato un neurotrasmettitore che blocca l’acetilcolina.
• Tossina botulinica: in presenza di questa viene bloccato il rilascio di acetilcoa causando un rilassamento costante dei muscoli, in condizione fisiologica invece, quando la tossina botulinica non è presente l’acetilcoa si andrebbe ad adattare ai recettori inibendo il rilascio e causando contrazione.
• Tossina coleica: CT ed LT. In caso di presenza di questa tossina, formata da due unità: l’unità A entra nell’intestino epiteliale e attiva l’adenincocillasi che converte ATP in AMPciclico. All’esterno invece c’è la sub unità B che si stanzia bloccandola. A questo punto Cl-, HCO₃- e H₂O si muovono verso l’esterno causando diarrea.
• Emolisine: tossine presenti solo nei gram+ che formano fori a livello delle membrane di cellule sensibili.

Farmaci antibatterici

Il farmaco antibatterico più famoso è l’antibiotico (prodotto naturale), tuttavia esistono altri tipi di farmaci antibatterici come i chemioterapici (prodotto di sintesi) oppure la terapia antibatterica che comprende un insieme di farmaci con attività antibatterica selettiva. I farmaci antibatterici possono essere classificati in vari modi:

1. In base alla struttura chimica.
2. In base al meccanismo di azione.
3. In base allo spettro di azione.
4. In base alla farmacocinetica.
5. In base all’effetto biologico: si classificano in tre classi:
   • Batteriostatico: inibizione reversibile della crescita batterica.
   • Battericida: inibizione irreversibile crescita batterica poiché causa morte.
   • Batteriolitico: inibizione irreversibile crescita batterica poiché causa lisi e morte.

Le strutture e i processi caratteristici dei procarioti rappresentano buoni bersagli per gli antibiotici. Esistono sei classi di antibiotici:

1. Antibiotici che agiscono sulla membrana: come la polixina B, la colistina e la daptomicina. Polixina B e la Colistina agiscono come detegenti solo sui gram-, hanno tossicità elevata e sono battericidi e antibiotici di riserva per gram- multi resistenti. La Daptomicina invece agisce solo sui gram+, passa la parete danneggiandola ed è caratterizzata da una elevata azione battericida e tossicità.
2. Farmaci che agiscono sulla sintesi del peptidoglicano: questi farmaci sono vari come ad esempio:
   • Fosfomicina: lega il peptide trasferasi e blocca la formazione di UDP-NAG piruvato.
   • Cicloserina: lega Alla-racemasi e impedisce isomerizzazione L-Ala a D-ala.
   • Bacitracina: blocco della defosforilazione bactoprenolo.
   • Glicopeptidi: bloccano la trans-glicosilazione e trans-peptidazione.
   • Beta-lattamici: tali antibiotici si legano agli enzimi batterici PBP, enzimi batterici coinvolti nella transpeptidazione, impedendo all’enzima di formare il legame proteico e portando quindi alla lisi della cellula batterica, sono i più comuni grazie alla loro versatilità, efficacia e tollerabilità (i più importanti sono penicilline, cefalosporine, carbapenemi e monobattami). In sintesi, la penicillina è il farmaco beta-lattamico per eccellenza e agisce per bloccare la sintesi del peptidoglicano. In presenza di penicillina infatti il legame peptidico non si forma tra il terzo amminoacido del primo strato e il quarto di quello successivo bensì i beta-lattamici si legano alle PBP impedendo loro di funzionare, questo perché impedisce il cross-link e la parete si disintegra causando la morte della cellula. I beta-lattamici sono batteriolitici, uccidono la cellula e la disintegrano. Ci sono quattro classi di beta-lattamici:
     • Penicilline
     • Cefalosporine
     • Carbapenemi
     • Monobattami
3. Antibiotici che agiscono sulla trascrizione: tipico è la rifampicina, la quale agisce su micobatteri gram+ e gram-. Questo farmaco è un battericida e agisce legandosi alla subunità beta dell’RNA polimerasi e bloccano la trascrizione. È uno dei farmaci cardine nella terapia della tubercolosi.
4. Antibatterici che agiscono sulla replicazione del DNA: esistono due classi di farmaci:
   • Chinoloni: si legano alla subunità A e bloccano la replicazione.
   • Novobiocina: si legano alla sub-unità B e bloccano la replicazione.
5. Antibatterici che agiscono sulla sintesi proteica: esistono vari farmaci tra cui:
   • Aminoglicosidici
   • Tetracicline
   • Macrolidi
   • Cloramfenicolo
   • Lincosamidi
   Il bersaglio per tutti sono i ribosomi fatti da due sub-unità, aminoglicosidici e tetracicline si legano alla sub-unità 30s e bloccano subito la traduzione mentre le altre si legano alla 50s bloccando la traduzione in un secondo momento.
6. Altri antibatterici: Isoniazide, attivo sui microbatteri, usato per il trattamento della Tubercolosi, bloccano la sintesi degli acidi micolici.

La resistenza ai farmaci

Può succedere che in seguito a ricombinazioni geniche i batteri mutano il loro genoma conferendo resistenza ai farmaci. Esistono due tipi di resistenze:

1. Naturale: farmaco nasce con naturale resistenza a quel farmaco.
2. Acquisita: tipica di alcuni ceppi di una specie batterica naturalmente sensibile, ad un certo punto può avvenire qualcosa che lo rende più forte. Le basi genetiche della chemio resistenza genetica sono:
   • Mutazione di un gene esistente, per caso mentre il batterio cresce, uno dei suoi geni casualmente varia e sempre casualmente questa mutazione sarà favorevole alla resistenza al farmaco, a quel punto tutti i batteri sensibili moriranno mentre quelli mutati domineranno.
   • Acquisizione di un nuovo gene, durante la coniugazione c’è lo scambio di materiale genetico tra cui anche il gene per la resistenza.