Evoluzione delle scoperte sul DNA come principio trasformante

Esperimenti di Sia e Dawson

Nel 1931 Richard Sia e Martin Dawson ripetono l’esperimento di Griffith ma in vitro, cioè in provetta. Ripetono le prove fatte da Griffith su batteri IIR e IIIS ma senza usare i topi come ospiti delle infezioni. Semplicemente coltivano i batteri in provetta e poi seminano (“piastrano”) su terreni solidi i batteri dopo i vari trattamenti per osservarne le caratteristiche fenotipiche (il “fenotipo” R o S). In conclusione confermano tutti i risultati ottenuti da Griffith dimostrando che i topi usati in quel caso non avevano alcun ruolo nella trasmissione del “principio trasformante”

Scoperta del principio trasformante

Nel 1944 Avery e MacLyn e McCarty scoprono che il principio trasformante è il DNA.

Avery e colleghi frazionano i batteri virulenti IIIS in componenti subcellulari sfruttando tecniche di centrifugazione.

Lisano le cellule e centrifugano ottenendo un supernatante (che contiene le molecole solubili, lipidi, zuccheri, DNA, RNA, proteine) e un pellet di detriti cellulari (pezzi di parete cellulare, membrane etc). Saggiano la capacità “trasformante” del supernatante e del pellet (solo il primo “trasforma” batteri IIR in IIIS).Poi usano particolari enzimi per inattivare una a una le diverse componenti del supernanante e scoprono che solo quando il DNA viene degradato con la desossiribonucleasi (DNAsi) l’estratto perde la capacità trasformante, quindi concludono che il DNA è il principio trasformante

Critiche ai risultati di Avery

Nonostante la chiarezza delle conclusioni e la metodicità dell’esperimento i risultati di Avery furono criticati perché gli acidi nucleici isolati dai batteri non erano puri, ma contenevano contaminazioni di tipo proteico…. Quindi non si poteva escludere totalmente che le proteine fossero il principio trasformante di Griffith

Esperimenti di Hershey e Chase

1952 Hershey e Chase dimostrano che il materiale genetico dei batteriofagi è il DNA

Si sapeva che gli acidi nucleici contenevano Fosforo (P) ma non Zolfo (S). Lo zolfo era esclusivo delle proteine.

I virus batterici - ad esempio il batteriofago T2 - erano costituiti solo da proteine e DNA.

Il DNA fu marcato con 32P e le proteine furono marcate con 35S.

Il 32P si ritrova all’inizio all’interno delle cellule batteriche e poi associato ai fagi che lisano i batteri.

Al contrario lo 35S rimane all’esterno dei batteri associato alle “ombre fagiche” che sono gusci proteici vuoti dai quali è uscito il DNA iniettato dal fago nel batterio.

In realtà Hershey e Chase trovarono nelle cellule una piccolissima quantità anche di 35S dovuta all’incompleta rimozione delle particelle virali assorbite alla parete dei batteri. Questa piccola“imperfezione” dipendeva ancora una volta dalla mancanza di tecniche che oggi abbiamo e che sono molto più sofisticate sia per quanto riguarda la purificazione delle componenti cellulari che la manipolazione degli acidi nucleici.

Tecniche moderne di trasfezione

Ad esempio oggi si può rimuovere la parete cellulare di un batterio ottenendo dei protoplasti che hanno solo la membrana cellulare (il doppio strato di fosfolipidi). I protoplasti si possono“infettare” con DNA fagico nudo (non quindi con una particella virale ma solo con il suo DNA) in una procedura detta“trasfezione”. Il risultato della trasfezione di protoplasti con DNA fagico è identico all’infezione di una cellula integra con una particella virale e cioè la lisi dei batteri e la produzione di una progenie di fagi. La trasfezione è la dimostrazione inequivocabile che il DNA è il principio trasformante.