Concetti Chiave
- La PCR (reazione a catena della polimerasi) è un processo di replicazione in vitro che amplifica specifiche regioni di DNA, utilizzando DNA stampo, primer, TAQ polimerasi, dNTPs, buffer e magnesio.
- Le fasi della PCR includono la denaturazione a 90/95 gradi, l'appaiamento dei primer a circa 55 gradi e l'allungamento a 72 gradi, ripetute per 30/35 cicli per ottenere un miliardo di copie del DNA.
- I primer devono avere una lunghezza di circa 20 basi per evitare self-appaiamenti e devono essere selezionati in base alla sequenza del DNA target.
- L'elettroforesi degli acidi nucleici separa i frammenti di DNA e RNA in base alla dimensione, utilizzando un gel di agarosio e un campo elettrico che fa migrare le molecole cariche negativamente verso il polo positivo.
- Durante l'elettroforesi, l'etidio bromuro viene utilizzato per visualizzare i frammenti di DNA, che emettono fluorescenza quando illuminati.
È una sorta di replicazione in vitro, mima il fenomeno naturale della replicazione in provetta. L'obiettivo è amplificare il DNA ovvero ottenere molteplici copie di una regione target del DNA.
Indice
Componenti essenziali per la PCR
Per la PCR servono:
-DNA genomico = DNA stampo, che voglio copiare.
-primer = oligonucleotidi a singolo filamento, tratti di DNA a singolo filamento costituita da pochi nucleotidi, cost da circa 20 pb. Serve per dare un innesco all’enzima. Non esiste né in natura né in vitro una polimerasi capace di attaccare nucleotidi senza un innesco. Questo perché l’innesco è una molecola di DNA che fornisce un 3’ OH libero, a cui attaccare il nucleotide successivo.
L’enzima della PCR è la TAQ polimerasi, enzima termoresistente.
-dntps =desossinucleotidi, nucleotidi del DNA.
-buffer= tampone che garantisce pH della reazione.
-magnesio= coenzima ovvero il coadiuvante della taq polimerasi.
Processo di denaturazione e appaiamento
-denaturazione= 90/95 gradi, si rompono legami H e si ottengono singoli filamenti.
-appaiamento= abbasso la temperatura da 95 a 55 e si appaiano i primer, al DNA denaturato, si andranno ad appaiare dove trovano complementarietà.
Interviene polimerasi, fase di allungamento es 72 gradi, si aggiunge un nucleotide alla volta, e lo aggiunge attaccandolo al 3’ OH libero e lo attacca in base alla complementarietà del DNA stampo. L’OH serve per creare lo scheletro del DNA, per creare legami fosfodiesterici.
Cicli di PCR e importanza dei primer
Gli step vengono ripetuti per 30/35 cicli, il risultato è che ottengo circa un miliardo di copie del DNA.
La fase critica è l’appaiamento. I primer devono avere una sequenza precisa. 20 pb perchè è più probabile trovarla 1 volta sola nel organismo anziché 6 pb che è più probabile trovarlo molte volte. Se avesse più di 20 pb rischierebbe di fare un self appaiamento, trovando i complementari con facilità.
Per fare la PCR, devo conoscere la sequenza dei primer.
In che direzione lavora la TAQ polimerasi? Attacca i nucleotidi in 5’ → 3’
Ci sono due primer: forward e reverse perché i due filamenti sono complementari e antiparalleli.
La polimerasi li attacca in base alla complementarietà del DNA stampo, smette di lavorare quando ridenaturo il DNA, in base al tempo che ho fissato.
Al 2 ciclo di PCR, denaturo e ho 4 molecole di DNA. Si ferma quando incontra un altro primer perché è finita la sequenza. Al terzo ciclo di PCR, ottengo il target DNA, dal 3 ciclo in poi il DNA target sarà preponderante.
Elettroforesi degli acidi nucleici
L’elettroforesi degli acidi nucleici permette di separare frammenti di DNA ed RNA per dimensione poiché i frammenti di minori dimensioni migrano attraverso il gel a velocità maggiore rispetto ai frammenti di maggiori dimensioni.
L’EF si basa sul principio in cui le molecole di DNA sono cariche (-) e migrano in un campo elettrico verso il polo (+) con velocità inversamente proporzionali alle loro dimensioni (in paia di basi).
Come gel elettroforetico si utilizza il gel di agarosio che è uno zucchero che crea una maglia all’interno del gel e forma pori dove il DNA può passare. Più è alta la concentrazione di agarosio più piccoli sono i pori e viceversa.
Mediante etidio bromuro, dopo aver fatto migrare il frammento di DNA, si vanno ad illuminare con sostanze elettrofluorescenti ed emettono fluorescenza.
Il DNA migra attraverso i pori del gel EF sttraverso due principi:
-carica (DNA -).
-peso molecolare, più è pesante più è lento a migrare.
Domande da interrogazione
- Qual è l'obiettivo principale della PCR?
- Quali sono i componenti essenziali per eseguire una PCR?
- Quali sono le fasi principali della PCR?
- Come funziona l'elettroforesi degli acidi nucleici?
- Perché è importante la sequenza dei primer nella PCR?
L'obiettivo principale della PCR è amplificare il DNA, ottenendo molteplici copie di una regione target del DNA.
I componenti essenziali per la PCR includono DNA genomico, primer, TAQ polimerasi, dNTPs, buffer e magnesio.
Le fasi principali della PCR sono denaturazione, appaiamento e allungamento, ripetute per 30/35 cicli.
L'elettroforesi separa frammenti di DNA e RNA per dimensione, sfruttando la carica negativa del DNA che migra verso il polo positivo in un campo elettrico.
La sequenza dei primer è cruciale perché devono appaiarsi precisamente al DNA target per iniziare la replicazione, evitando self-appaiamenti.
Accedi a tutti gli appunti
Tutor AI: studia meglio e in meno tempo
