Guida completa alla clonazione del DNA e selezione dei plasmidi

Processo di clonazione del DNA

-DNA ricombinante: Il DNA da clonare viene estratto. Poi si tagliano sia il DNA che i plasmidi con gli stessi enzimi di restrizione. I frammenti di DNA avranno quindi le stremità appiccicose identiche.I frammenti di DNA e i plasmidi vengono miscelati, e le DNA ligasi catalizzeranno la formazione dei legami. Ora avremo sia plasmidi ricombinanti che plasmidi vuoti.

-Preparazione cellule ospitiLe cellule batteriche vengono trattate per facilitare l’entrata nello stato di competenza e quindi l’assorbimento dei plasmidi e per inattivare i marcatori selezionabili normalmente presenti dentro di esse (che altrimenti renderebbero inefficaci quelli plasmidici).

Inserzione e selezione dei plasmidi

-Inserzione dei plasmidi: quando hanno assorbito il plasmide le cellule vengono messe a crescere su un mezzo di coltura solido, formando delle colonie. Avremo batteri che non hanno captato il plasmide, batteri col plasmide vuoto, batteri con plasmidi ricombinanti.

-Distinzione delle cellule utili: I batteri utili sono quelli con i plasmidi ricombinanti, che quindi devono essere distinti grazie ai marcatori selezionabili, questo avviene aggiungendo un antibiotico al terreno di coltura e solo i batteri con il plasmide possono resistergli. Inoltre può essere utilizzato il gene LacZ, che contiene al suo interno un gene per la pigmentazione blu con dentro il sito di taglio. Se quindi il plasmide viene tagliato e il gene inserito il gene non si esprime più e non vi sarà colorazione blu.