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Mutazioni puntiformi e le loro conseguenze

Consideriamo le conseguenze alcuni tipi di mutazione nella trascrizione e traduzione. Un esempio è l’anemia falciforme. La molecola di emoglobina contiene quattro catene polipeptidiche, due catene alfa e due catene beta. Le catene beta normali presentano l’amminoacido acido glutammico, le catene beta delle cellule di anemia contengono l’amminoacido valina. C’è un solo nucleotide diverso tra i codoni di mRNA che codificano l’acido glutammico e la valina. Le sequenze GAA e GAG indicano l’acido glutammico; mentre GUA e GUG sono i codoni della valina.
Quindi la differenza tra i due mRNA è dovuta alla sostituzione di una molecola di adenina con un uracile, mentre nel filamento stampo di DNA da cui viene trascritta l’mRNA, la differenza consiste nella sostituzione di una timina con una adenina.

La mutazione

La mutazione è un cambiamento della sequenza o del numero di nucleotidi nell’acido nucleico di una cellula. Le mutazioni che si verificano nei gameti, o nelle cellule che danno origine ai gameti, sono trasmesse alle generazioni successive e le mutazioni che si verificano nelle cellule somatiche sono trasmesse alle cellule figlie prodotte per mitosi e citodieresi.

Mutazioni puntiformi: sono quelle che riguardano soltanto la sostituzione di un singolo nucleotide e possono portare a cambiamenti nella proteina codificata dal gene.
• Mutazione di non senso: è una mutazione che determina l’inserimento di un amminoacido diverso da quello presente nella proteina. Si conoscono più di 100 mutazioni di senso riguardanti i geni che codificano per le catene alfa e beta della molecola di emoglobina: una ventina di esse danno origine a malattie gravi.
• Mutazione di non senso: il risultato della sostituzione di un nucleotide è un codone di arresto, provocando la fine della sintesi proteica prima che sia stato tradotto l’intero polipeptide. Per questo essa dà più spesso origine a malattie gravi, come per la distrofia muscolare di Duchenne, in cui manca la produzione della proteina distrofina, fondamentale nel tessuto muscolare.
• Mutazione silente: avviene quando il cambiamento di un nucleotide non corrisponde un cambiamento di amminoacido nel momento della traduzione e, quindi, non si hanno conseguenze sull’individuo. Per esempio se sull’mRNA la tripletta GCC venisse sostituita dalla tripletta GCA, il tRNA corrispondente al nuovo codone, porterebbe comunque all’amminoacido alanina. Quindi non c’è cambiamento negli aminoacidi o modifiche della proteina.

Altri cambiamenti nella sequenza amminoacidica di una proteina possono derivare da una delezione, ovvero quando viene tolto un nucleotide per l’errore, o da una inserzione se viene aggiunto uno o più nucleotidi nel gene. Da ciò, il sistema di lettura di un gene può spostarsi, cioè cambia il modo in cui tutti i nucleotidi sono raggruppati in triplette, dando origine ad una proteina nuova. Questi si chiamano spostamenti di sistema di lettura e portano quasi inevitabilmente a proteine non funzionali. Tra gli agenti che provocano mutazioni, ci sono i raggi X, materiali radioattivi e altre sostanze chimiche. La maggior parte delle mutazioni tuttavia avviene spontaneamente, ma il tasso è in genere basso. Geni differenti e alleli differenti dello stesso gene, hanno differenti tassi di mutazione: si pensa che queste differenze siano in relazione sia alla composizione chimica del gene in questione, sia alla sua posizione sul cromosoma. Le mutazioni possono, infine, interessare anche le regioni non codificanti dei geni, anche queste possono avere effetti.

Regolazione genica nei procarioti

Nel genoma umano, ci sono proteine indispensabili alle cellule durante la vita, quelle del citoscheletro, e i geni che le codificano, non hanno quindi bisogno di un controllo sofisticato, essendo sempre attivi; detti geni costitutivi (housekeeping) e non costitutivi (espressione sottoposta a diversi meccanismi di regolazione e possono essere tradotti in proteine in momenti diversi).
• geni costitutivi: sono tutti geni che trasformano le proteine che creano le membrane nucleari, enzimi della catena respiratoria ecc... Le cellule però, per non sprecare energia, non producono continuamente tutte le proteine possibili, ma solo quelle necessarie in quel momento e a seconda dei cambiamenti dell’ambiente esterno. Alcuni mutanti e simili sono svantaggiati, perché costretti ad un inutile consumo di energia e di materia prima per produrre enzimi di cui non hanno bisogno.

Regolazione genica negli eucarioti

Negli eucarioti soprattutto nei pluricellulari, i meccanismi di regolazione genica sono più complessi e consentono alla cellula di rispondere alla variazione di stimoli dall’esterno. Un organismo pluricellulare si sviluppa a partire da una cellula uovo fecondata, lo zigote, che si divide per mitosi e citodieresi, dando luogo a molte cellule; le cellule iniziano a differenziarsi diventando poi cellule muscolari, nervose, intestinali, ecc… Le cellule che appartengono allo stesso individuo avranno quindi lo stesso genoma, ossia lo stesso patrimonio genetico e lo stesso tipo di DNA, ma un diverso proteoma, dato che ogni tipo di cellula, appena si differenzia, inizia a produrre proteine differenti che lo rendono distinguibile da altri tipi di cellule dal punto di vista strutturale e funzionale.

Es. globuli rossi: nei primi stadi di vita embrionale, i globuli in via di maturazione sintetizzano un tipo di emoglobina che ha una maggiore affinità per l’ossigeno, ma in seguito allo stato di feto, queste cellule contengono secondo tipo di emoglobina con un’affinità minore, dopo poco la nascita dell’individuo, i globuli rossi cominciano a produrre le catene polipeptidiche caratteristiche dell’emoglobina degli adulti. Così, i geni sono espressi in una sequenza temporale ben controllata. Inoltre, i segmenti di DNA che codificano per queste molecole di emoglobina, sono espressi solo nei globuli rossi in via di maturazione. Tuttavia, è certo che tutte le informazioni genetiche originariamente presenti nello zigote, si trovano ancora in ogni cellula diploide dell’organismo. Per esempio, i segmenti di DNA che codificano per i tre tipi di emoglobina (embrione, feto, adulto) sono presenti in ognuna delle cellule di tutti i 200 tipi di cellule del nostro corpo. Analogamente la sequenza di DNA che codifica per l’ormone insulina, è presente non solo nelle cellule del pancreas specializzate nella sua produzione, ma anche in tutte le altre cellule, pure senza essere espressa.

Quindi è chiaro che nei pluricellulari i meccanismi di regolazione genica sono importanti per il processo di differenziamento, il quale dipende dall’inattivazione di certi gruppi di geni e dell’attivazione di altri.

Regolazione della trascrizione mediante specifiche proteine di legame

La trascrizione negli eucarioti è simile a quella dei procarioti. Essa inizia con l’attacco dell’enzima RNA-polimerasi al promotore di un determinato gene della molecola di DNA. La polimerasi si sposta lungo la molecola usando il filamento 3’-5’ come stampo per la sintesi di molecole di RNA. Le molecole di RNA trascritte (rRNA,tRNA e mRNA) svolgono poi le loro specifiche funzioni nella produzione di proteine delle informazioni genetiche. Nonostante questa somiglianza di base, vi sono alcune importanti differenze:
• Negli eucarioti ogni gene strutturale viene trascritto separatamente e la sua trascrizione sottoposta ad una specifica regolazione.
• Il promotore delle cellule eucarioti è costituito da tre regioni differenti: la TATA box, è la particolare sequenza nucleotidica che funziona da sito di riconoscimento per l’RNA polimerasi, e un’altra, il sito di inizio della trascrizione che è la regione del DNA in cui la trascrizione effettivamente inizia. La TATA box e il sito di inizio della trascrizione formano un complesso chiamato promotore basale.
• Negli eucarioti, trascrizione e traduzione sono separate; dopo che nel nucleo la trascrizione è terminata, i trascritti di mRNA vengono ampiamente modificati prima di essere trasportati nel citoplasma, dove avviene la traduzione.

Sia negli eucarioti sia nei procarioti la trascrizione è controllata dall'azione di proteine che si attaccano in punti specifici della molecola di DNA; nelle cellule eucariote queste proteine di regolazione e sono dette fattori di trascrizione generali (GTF), che sono cinque e si legano al promotore basale per consentire l’attacco dell’RNA-polimerasi. Poi si forma il complesso di pre-inizio che è la struttura molecolare indispensabile per cominciare la trascrizione del DNA in RNA.

Nelle cellule eucariote esistono geni regolatori controllati da due tipi di proteine, gli attivatori e i repressori, chiamati enhancer o silencer a seconda che favoriscano o inibiscano l’avvio della trascrizione di un determinato gene.
➢ Trascrizione: è quando un attivatore si lega al relativo enhancer, favorendo l’attacco di un fattore di trascrizione alla TATA box e si forma il complesso di pre-inizio. Questo legame favorisce l’azione di speciali enzimi che agiscono sugli istoni rendendo meno compatta la cromatina e consentendo così l’aggancio dell’RNA-polimerasi. Sei i geni enhancer e silencer si trovano lontani occorre un mediatore che mette in comunicazione questi geni di regolazione con i promotori. Questa lontananza può creare problemi ai ricercatori poiché diventa complicata la sua identificazione.

La regolazione genetica a livello della traduzione

una cellula può controllare la produzione finale delle proteine anche grazie a meccanismi che hanno luogo durante o al,termine della traduzione . tra i meccanismi di regolazione della sintesi proteica c'è la possibilità di impedire temporaneamente l'attacco dell'mRNA ai ribosomi, modificando chimicamente la sequenza leader di attacco della sua catena nucleotidica, oppure mediante l'azione di un repressore traduzionale; questo agisce legandosi all'mRNA , per esempio quando la relativa proteina si trova in quantità sufficienti e viene poi disattivato quando occorre riprendere la sintesi. un esempio di,repressore traduzionale è la proteina FMRP che regola la traduzione di specifici mRNA presenti nelle cellule nervose; una mutazione del gene che codifica per questa proteina e la sua conseguente carenza nel citoplasma sembra essere legata alla sindrome dell'X fragile. la regolazione che avviene al termine della traduzione invece si attua allungando o accorciando il tempo di permanenza delle proteine all'interno della cellula. si può limitare la loro azione idrolizzandole dopo un periodo più o meno lungo, oppure modificandole chimicamente, tal volta in maniera reversibile, mediante la liberazione di messaggeri chimici.

La genetica dei batteri

I batteri contengono un solo cromosoma che ha di solito forma circolare, questo cromosoma si trova nel nucleoide e non è avvolto dalla membrana. La maggior parte del cromosoma è costituita da geni strutturali, mentre i restanti geni sono coinvolti nell’espressione genica e nella duplicazione batterica. A differenza di quanto avviene nel DNA eucariote, la duplicazione dei batteri ha un solo punto d’origine, che funziona da sito d’inizio per l’assemblaggio delle varie proteine necessarie alla duplicazione. I batteri contengono plasmidi che posseggono solo uno o due geni, quelli più grandi possono avere anche diverse decine.

Plasmidi e coniugazione

I plasmidi sono circolari e hanno un DNA a doppio filamento, si possono duplicare autonomamente grazie al loro punto d’origine della duplicazione. Alcuni plasmidi si duplicano in sincronia con il cromosoma e ogni cellula figlia riceve soltanto una copia del plasmide, altri si duplicano più frequentemente del cromosoma e le cellule possono contenere copie multiple del plasmide; però se il plasmide si duplica meno frequentemente del cromosoma le cellule figlie possono non ricevere alcuna copia.
Esistono cinque categorie di plasmidi:
• I plasmidi degradativi che consentono ai batteri di metabolizzare determinate sostanze, anche tossiche, come il petrolio o pesticidi,
• I plasmidi Col, che codificano per colicine, proteine in grado di uccidere altri batteri,
• I plasmidi della virulenza che trasformano le cellule ospiti in patogene,
• I plasmidi F, che consentano ai batteri di scambiare tra loro materiale genetico,
• I plasmidi R, i cui geni resistono ad alcuni agenti antibatterici (per esempio gli antibiotici)

Trasformazione e trasduzione nei batteri

I batteri si riproducono in maniera asessuata per scissione binaria, dando origine a cellule figlie geneticamente identiche a quella di partenza. La coniugazione, insieme alle mutazioni casuali, è il principale processo naturale che determina modificazioni del patrimonio genetico dei batteri. Altri due eventi che permettono alle cellule batteriche di variare il proprio assetto genetico sono la trasformazione e la trasduzione.

Trasformazione: si verifica quando un batterio cattura dall’ambiente extracellulare un filamento di DNA appartenuto a un altro batterio morto. Lo inserisce o ricombina nel proprio cromosoma e modifica il proprio patrimonio genetico.
Solo i batteri che possiedono speciali proteine dette fattori di competenza, che facilitano la cattura, l'ingresso e il reinserimento del DNA estraneo possono compiere la trasformazione.
Trasduzione: avviene quando un virus, dopo aver infettato un batterio e averne acquisito parte del genoma, penetra in un secondo batterio ed inserisce il materiale genetico derivante dal primo batteri infettato. Come la coniugazione è il trasferimento di geni da una cellula batterica a un’altra, però nella coniugazione si tratta di plasmidi, mentre nella trasduzione, di virus.


La struttura dei virus

I virus sono costituiti da una molecola di acido nucleico racchiusa in un involucro proteico, o capside, che può essere costituito da un’unica molecola proteica ripetuta più e più volte o essere formato da proteine diverse. Alcuni virus, come quello dell’influenza, hanno un rivestimento lipoproteico che deriva dalla membrana della cellula ospite. Gran parte dei virus presentano sulla superficie glicoproteine di membrana svolgono una funzione di riconoscimento della cellula bersaglio e facilitano la penetrazione all’interno di esse. Questi involucri esterni determinano il tipo di cellula ospite da aggredire ( per esempio il virus del raffreddore invade le cellule del rivestimento del sistema respiratorio umano).
Il virus possono moltiplicarsi sono all’interno di una cellula viva; inoltre, in alcune infezioni virali, il rivestimento proteico viene abbandonato fuori dalla cellula ed entra solo l’acido nucleico; in altre invece è il virus completo che penetra nella cellula ma il rivestimento proteico viene comunque distrutto una volta all’interno e l’acido nucleico viene liberato. L’acido nucleico virale può essere costituita da DNA o da RNA, quando i virus a DNA infettano una cellula, il DNA virale si duplica formando molte molecole di DNA e viene poi trascritto in mRNA, il quale dirige la sintesi delle proteine virali.

Il virus come vettori

Anche i virus possono fungere da vettori, o carrier, che spostano pezzi di DNA da una cellula all’altra. I batteriofagi temperati hanno la capacità di rimanere nascosti per molte divisioni cellulare prima di iniziare un ciclo litico in cui la cellula ospite viene distrutta. Il DNA dei batteriofagi integrati sono noti come profagi e i batteri che li ospitano sono chiamati batteri lisogeni.

La tecnologia del DNA ricombinante

Nelle ricerche sul DNA ricombinante, segmenti di molecole di DNA prelevati da fonti diverse vengono modificati, ricombinanti e poi inseriti in altre cellule, utilizzando plasmidi, virus e trasponi mediante cui i geni possono spostarsi da un sito all’altro. Gli studi sul DNA ricombinante consentono agli scienziati di:
• avere segmenti di DNA abbastanza piccoli da essere analizzati manipolati
• Ottenere grosse quantità di questi piccoli segmenti
• conoscere la loro sequenza nucleotidica
• essere in grado di identificare i segmenti specifici presi in considerazione

Come ottenere brevi segmenti di DNA

Nel corso degli studi sui batteriofagi si scoprì che i virus che infettano u ceppo del batterio E. Coli non solo capace di infettarne un altro, perchè nei batteri ci sono enzimi chiamati enzimi di restrizione che tagliano le molecole estranee di DNA in piccoli segmenti prima che vengano duplicate o trascritte. Questi enzimi tagliano le molecole estranee di DNA in corrispondenza di specifiche sequenze nucleotidiche dette sequenze di riconoscimento perché vengono riconosciute dagli specifici enzimi di restrizione. I nucleotidi delle sequenze di riconoscimento che si trovano sul cromosoma batterico vengono modificati chimicamente.
Alcuni enzimi di restrizione, come la l’HpaI operano tagli netti in entrambi i filamenti della molecola di DNA; altre invece, come gli enzimi EcoRI e HindIII, tagliano i due filamenti con lo scarto di alcuni nucleotidi: di conseguenza, vi è una breve sequenza di nucleotidi spaiati su ciascuna estremità del taglio che sono dette appiccicose perché possono riattaccarsi tra loro quando si formano con spontaneamente dei legami a idrogeno fra le basi azotate complementari. Per il processo di ricucitura è necessaria anche la presenza del DNAligasi, che unisce le estremità tagliate di ciascun filamento. Le estremità appiccicose possono appaiarsi anche con segmenti di DNA che hanno provenienza diversa e estremità complementari perché tagliati per lo stesso enzima di restrizione.
I segmenti che risultano dall’azione di determinato enzima di restrizione sono chiamati
frammenti di restrizione e hanno una lunghezza che dipende dalla distanza dei siti in cui si trovano le sequenze di riconoscimento per quel dato enzima.

La rivoluzione biotecnologica

Le biotecnologie hanno come punto di partenza gli studi sul DNA ricombinante per conoscere l’esatta identità del gene o dei geni che vengono trasferiti. Per il settore biotecnologico è importante ottenere nuovi tipi di organismi inserendo nel loro corredo cromosomico geni provenienti da un organismo apparentemente a una specie o a un genere differente.

La sintesi di proteine utili mediante batteri

La prima proteina umana sintetizzata in una cellula batterica è stato l’ormone somatostatina, proteina di piccole dimensioni composta solo da 14 aminoacidi. Attualmente, la proteina ricombinante di maggiore importanza economica per l’industria farmaceutica è l’eritropoietina umana, una sostanza che stimola la formazione dei globuli rossi. Un altro importante risultato è la produzione di vaccini contro le malattie virali. Tutti i virus sono costituiti da acido nucleico racchiuso da un capside proteico. Le proteine del capside provocano la formazione di anticorpi che hanno un ruolo fondamentale per la difesa dai virus. Un esempio di questo tipo di vaccino è quello utilizzato per combattere il virus dell’epatite B, una grave malattia che colpisce il fegato.

Il trasferimento di geni in organismi eucarioti

I biologi hanno cominciato a tentare di trasferire geni anche tra cellule eucarioti. La speranza è quella di curare le malattie genetiche umane sostituendo i geni non funzionanti con geni sani. Il trasferimento di geni tra cellule eucarioti può dare luogo alla nascita di un organismo transgenico, cioè un organismo che possiede nel proprio genoma uno o più geni appartenenti ad individui di un’altra specie. Per prima cosa è necessario isolare il gene che si vuole trasferire; in seguito, il nuovo gene dovrà essere inserito, spesso mediante aghi di dimensioni microscopiche, in alcune cellule dell’organismo.

Topi knockout

Gli scienziati hanno studiato gli effetti derivanti dalla mancanza di un gene. Così hanno provato a inattivare determinati geni di alcuni animali. Per poter osservare le conseguenze di questa inattivazione e ottenere così un knockout genico occorre eseguire poi una serie di incroci e ottenere alla fine un organismo che sia omozigote per quel gene.

Biotecnologie agroalimentari

Una pianta transgenica presenta il suo DNA un gene estraneo che le conferisce una nuova qualità. La resistenza ai pesticidi, ai parassiti e agli insetti, è in effetti, la qualità che si trova nella maggior parte degli alimenti geneticamente modificati, ma vi sono anche prodotti quali l’uva senza semi e le fragole che resistono al freddo più a lungo.

La clonazione dei mammiferi: la pecora Dolly

La clonazione di animali evoluti come i mammiferi si basa sulla fusione tra una cellula prelevata dal corpo di un organismo, fatta moltiplicare sul terreno di coltura, e una cellula uovo non fecondata di un altro organismo, precedentemente privata del materiale genetico. Un esperimento di clonazione di mammiferi ha portato alla nascita di una pecora che venne chiamata Dolly. Il nucleo della cellula della pecora donatrice fu inserita nella cellula uovo di un’altra pecora e cominciò a dividersi seguendo il normale sviluppo embrionale; tale sviluppo fu portato a termine nell’utero della terza pecora e dopo circa 21 settimane, nacque una pecorella che aveva un corredo genetico identico a quello della pecora donatrice. Si era così ottenuto una copia geneticamente identica di un organismo maturo, cioè un suo clone.

Ingegneria genetica in campo medico

Moltissime ricerche di genetica sono state effettuate anche negli esseri umani per tentare di sconfiggere malattie ritenute finora incurabili. Però, gli esperimenti sono finora limitati alle terapie che riguardano le cellule somatiche. Negli ultimi anni la genetica molecolare ha permesso di perfezionare metodi diagnostici con cui è possibile individuare già nel feto la presenza di malattie ereditarie o patologie che possono essere risolte nelle prime fasi dello sviluppo.

Diagnosi delle malattie genetiche

Sono oggi a disposizione test attendibili che rendono possibile la diagnosi prenatale di un certo numero di malattie ereditarie come l’anemia falciforme, la sindrome di Down, l’emofilia e la distrofia muscolare. Attualmente sono disponibili anche test genetici per rilevare anomalie associate a certi tipi di tumore, e queste analisi utilizzano enzimi di restrizione e sonde costituite da acidi nucleici.


Individuazione di geni umani e terapie geniche
Anche conoscendo l’esatta sequenza delle basi azotate di un cromosoma, non è possibile individuare direttamente i geni presenti su di esso né associare la struttura molecolare di un gene con le funzioni che dipendono da esso. Per gran parte delle malattie umane l’identità dei geni coinvolti, così come la natura e le conseguenze delle mutazioni che portano alla malattia, è tuttora poco nota.
Tuttavia quando sono conosciute si può provare a introdurre nel paziente un gene sano che sia in grado di sostituire quello malato.
La terapia genica ha come scopo principale quello di neutralizzare l’azione del gene malato; questo risultati in genere si può ottenere sostituendo il gene malato con gene sano, aggiungendo il gene sano o un altro gene che svolga la stessa funzione, oppure impedendo al gene malato di esprimersi.
Ancora oggi però i risultati sono nel complesso deludenti. Le difficoltà sono molteplici: inserire il gene sano, per esempio, ha bisogno di vettori virus e plasmidi che sappiano riconoscere le cellule bersaglio e che non vengano distrutti dal sistema immunitario del ricevente. Le tecniche utilizzate sono principalmente di due tipi: nella terapia ex vivo si estraggono le cellule del paziente e si coltivano in vitro, modificandole mediante un vettore virale prima di reintrodurle nell’organo del paziente; nella terapia in vivo, invece, si introducono direttamente i geni corretti tramite iniezioni o aerosol, con questa tecnica però è spesso impossibile controllare dove si inserisce il gene. A tutti i problemi elencati si deve aggiungere il fatto che i ricercatori dovrebbero sostituire il gene malato non in una singola cellula, ma in miliardi di cellule somatiche difettose. Considerando, inoltre, che tutte le cellule hanno un periodo di vita limitato, gli effetti benefici si esaurirebbero con la morte delle cellule stesse.

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