Editing genomico

Editing genomico

Questi procedimenti si servono di alcune fasi:
1) La nucleasi viene guidata verso una sequenza bersaglio specifica nel genoma. Nel caso di CRISPR un RNA guida (gRNA) riconosce la sequenza complementare nel DNA, l’enzima Cas9 effettua un taglio a doppio filamento. Abbiamo così creato un danno controllato nel DNA.
2) Riparazione del danno: può avvenire in due modi.
- Ricombinazione non omologa NHEJ: la cellula “riattacca” le estremità del DNA tagliato senza usare uno stampo. Questo processo spesso introduce piccole inserzioni o delezioni casuali (indel).
Questo è il metodo usato quando vogliamo spegnere un gene (knock-out).
- Ricombinazione omologa HR: la cellula usa uno stampo di DNA omologo per riparare il danno. Se noi forniamo una sequenza di DNA progettata, la cellula può usarla come modello. Questo è il metodo usato quando vogliamo modificare il gene in modo preciso (knock-in).
Ma quali sono gli impieghi dell’editing genomico?
1) Capire la funzione di un gene: un modo per capire la funzione di un gene è spegnerlo.
2) Capire quali geni causano il cancro: modificando un gene vediamo le conseguenze che ha quindi e come se dimostrassimo il rapporto causa-effetto tra mutazione e tumore.
3) Simulare una mutazione specifica in laboratorio: in questo modo possiamo vedere determinate alterazioni a che malattie portano.
4) Terapia genica: andiamo a modificare il gene alterato per farlo tornare normale. Con i tumori dovremmo modificare tutte le cellule cancerogene e sarebbe impossibile, ma con l’editing genomico possiamo “potenziare” le cellule che lo combattono (linfociti T).

Crispr-Cas9

È una tecnica di editing genomico ispirata ad un meccanismo dei batteri: Quando un virus inietta il suo DNA in un batterio, una piccola porzione di questo DNA virale viene tagliata e inserita nel genoma del batterio stesso, in una regione chiamata locus CRISPR. Queste sequenze agiscono come una "memoria storica" delle infezioni passate. Il locus CRISPR viene trascritto in una lunga molecola di RNA, che viene poi tagliata in piccoli frammenti chiamati crRNA. Ogni crRNA contiene la sequenza complementare al DNA di un virus incontrato in precedenza. Questi frammenti si legano alla proteina Cas, che è una forbice molecolare. Se lo stesso virus attacca di nuovo, il complesso crRNA-Cas riconosce il DNA virale grazie alla complementarità delle basi e la proteina Cas lo taglia, neutralizzando la minaccia. Ma la proteina Cas non taglia ovunque, ma riconosce prima una sequenza PAM sul DNA del virus, in modo da accertarsi di non tagliare il DNA del batterio stesso. Dopo aver trovato PAM, la Cas srotola il DNA e si accerta che il crRNA sia perfettamente complementare. Il DNA danneggiato porterà alla morte del virus. Questo meccanismo viene utilizzato anche in applicazioni cliniche, infatti gli scienziati si servono di appositi RNA guida, complementari ai siti che vogliamo tagliare, che guidano la Cas9 a fare il taglio. A questo punto la cellula può usare la ricombinazione omologa che porta ad una perdita della sequenza oppure, se forniamo uno stampo dall’esterno, otteniamo una modifica della sequenza. Possiamo quindi utilizzare questa tecnica per tutti gli impieghi scritti nell’editing genomico. La tecnica Crispr-Cas9 può essere applicata in cellule Ex vivo, cioè fuori dal corpo, o anche in vivo direttamente nella persona. In Ex vivo le cellule vengono modificate e poi reiniettate. In vivo invece il complesso Crispr-Cas9 viene inserito in lipoparticelle, che verranno poi inglobate dalle cellule per endoctosi. Si può iniettare sia la Cas9 sia la mRNA della Cas9.

Organi umani negli animali

Queste tecniche sono state provate anche per produrre organi umani negli animali: Una chimera è un organismo formato da cellule provenienti da due specie diverse. L’idea è che si prende un embrione animale allo stadio di blastocisti (per esempio di maiale) e con CRISPR si elimina un gene essenziale per lo sviluppo di un organo (es. fegato o pancreas). Dopodiché si iniettano cellule staminali pluripotenti umane (iPSC) nella blastocisti e poiché l’embrione animale non può formare quell’organo (perché il gene è stato eliminato), le cellule umane “occupano lo spazio” e formano quell’organo. L’esito migliore di questa pratica si è avuto con i primati, anche se per motivi etici questi embrioni non sono stati portati alla nascita. Questa tecnica è stata bannata per motivi etici: parte delle cellule andava anche nel cervello o nella linea germinale.