Esplorazione delle biotecnologie: tecniche e applicazioni avanzate

Le Biotecnologie sono una branca della scienza in continuo sviluppo e mutamento: con questo termine si intende indicare tutte le pratiche che utilizzano piante e esseri viventi per creare servizi e prodotti utili all’uomo, tra cui anche la fermentazione che consente la creazione del pane, del vino, della birra e di molto altro. Le biotecnologie tradizionali incontravano molte difficoltà: erano scarsamente controllabili, in quanto la selezione dei caratteri da incrociare era casuale, e nell’accoppiamento tra specie diverse, incontravano barriere fisiche così come di specie; qualora esso fosse possibile, il risultato, come nel caso dell’accoppiamento tra asino e cavallo, da cui nasce il mulo, risulterebbe essere sterile.

Ingegneria genetica moderna

L’ingegneria genetica moderna, invece, permette di mirare al singolo gene e di lavorare sul fenotipo, non sul genotipo; non incontra nessuna barriera di specie , in quanto il codice genetico è universale e posso mischiare i patrimoni genetici. Un grande passo avanti è stato permesso dalla scoperta che il DNA può essere separato, e non necessariamente frantumato, attraverso delle forbici nucleari e altre tecniche che consentono di tagliare l’acido nucleico in particolari punti del filamento, detti siti di restrizioni. Si tratta di particolari sequenze palindrome composte da 4 /8 paia di basi azotate che vengono individuate dagli enzimi di restrizioni, tipiche per ciascuno di essi, in cui il filamento può essere tagliato. Non sono disposti in maniera omogenea lungo il filamento, che può essere rotto da uno o più endonucleasi di restrizione, formando frammenti di DNA detti frammenti di restrizione.

Enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione sono stati scoperti nei batteri, nei quali svolgono il ruolo di protezione della cellula dai virus, in un modo molto simile a quello con cui agiscono gli anticorpi all’interno del corpo umano. Si tratta di proteine che interagiscono con la cellula batterica, rompendo il DNA vitale, diminuendo così la capacità del virus di attaccare il batterio. Gli enzimi possono operare questo taglio nei siti di restrizione in due modi, creando delle estremità nette oppure sfalsate(dette anche coesive): quest’ultime sono preferite perché mettono la DNA ligasi in condizione di ricostruire il legame fosfodiesterico.

Tecnica dell'elettroforesi su gel

Una volta che il DNA è separato in frammenti di restrizioni, essi possono essere separati gli uni dagli altri con la tecnica dell’elettroforesi su gel. Questa tecnica sfrutta il fatto che il gruppo fosfato che possiede il DNA gli conferisce una carica negativa e che quindi, se sottoposto ad un campo elettrico, migrerà verso il polo positivo. Il gel utilizzato viene immerso in una soluzione salina, che consente la condizione di corrente. Il polimero di supporto alla reazione è solitamente l’agarosio, una polisaccaride estratto dalle alghe marine in gradi di creare delle maglie che consentono di separare i frammenti di DNA che differiscono per un numero di nucleotidi compresi tra qualche decina e qualche migliaio. Un altro polimero è il poliacrilammide, che crea delle maglie più strette che permettono di separare i frammenti che differiscono anche solo per un nucleotide. All’interno del gel vengono scavati dei pozzetti, in maggior numero vicino al polo negativo, nei quali vengono posti i campioni di DNA da analizzare e confrontare. Dopo aver applicato il campo elettrico, la miscela di frammenti migra e essi vanno a posizionarsi in punti diversi del gel: dato che il DNA è trasparente, per renderlo visibile viene colorato artificialmente, usando un colorante fluorescente che emette luce se sottoposto ai raggi ultravioletti. Per identificare le dimensioni dei frammenti , all’interno dei pozzetti viene posto anche un miscuglio detto marcatore di peso molecolare, composto da frammenti di DNA di lunghezza nota che fungono da metro per i campioni da analizzare.

Sonde nucleotidiche e loro utilizzo

Le sonde nucleotidiche sono costituite da un filamento singolo di RNA o DNA, capace di legarsi con legami a idrogeno a una sequenza complementare lungo un filamento di un altro acido nucleico, evidenziandone la presenza grazie a sostanze radioattive o fluorescenti. Se io conosco una particolare sequenza di un gene da ricercare in un campione di DNA, costruisco una sonda complementare alla suddetta sequenza e la mischio con gli altri frammenti. Se il gene è presente, la sonda si ibriderà, creando legami ad idrogeno con esso in corrispondenza del tratto di DNA complementare.

Reazione a catena della polimerasi

I campioni di DNA sono talvolta in numero troppo esiguo per essere analizzati mediante una semplice elettroforesi su gel, che richiede almeno una decina di nanogrammi di frammenti. Per analizzare una quantità inferiore si usa un’altra tecnica, la reazione a catena della polimerasi o PCR. Si tratta di una reazione a catena che permette di copiare una sequenza di DNA per un migliaio di volte in una decina di minuti. Essa è catalizzata da un particolare tipo di DNA polimerasi in grado di sopportare le alte temperature necessarie per questa tecnica, detta Taq polimerasi ( devi il suo nome al batterio Thermus aquaticus, studiato nelle sorgenti termali del parco Nazionale del Yellowstone ). Per copiare un tratto di DNA si impiega un sequenza di 15-20 nucleotidi detta primer, progettata per essere complementare all’estremità 3’ dei 2 filamenti del tratto da amplificare. Essa delimita la parte di DNA che deve essere copiata dalla Taq polimerasi. La PCR avviene in 3 passaggi, che si ripetono svariate volte: inizialmente si ha la denaturazione, seguita dall’ibridazione e dell’allungamento. La temperatura è alzata fino ai 90°C, per rompere i legami ad idrogeno e separare le due emieliche del DNA. Anche la DNA polimerasi si srotola, smettendo di funzionare. La temperatura viene poi abbassata ,intorno ai 40/65°C, per permettere al primer di legarsi con le sequenze complementari presenti sui due filamenti del segmento di DNA che ci interessa. La temperatura viene portata a un valore ottimale per che entri in azione la Taq polimerasi e che avvii la sintesi dei filamenti complementari a partire dai primer.