Sintesi e caratterizzazione di nuovi targeting vectors per applicazioni diagnostiche

H H

7 11 H H

14 16

H

15

H H H H

2 3 4

O H H O Br

8 9 H H

H H

O O H

H H

H H

12 13

Purificazione : Il prodotto ottenuto grezzo si presenta come un solido rosso

scuro. Si procede alla purificazione tramite cromatografia flash su gel di silice.

La cromatografia si esegue su silice (pore size 60 Å, 200-400 mesh), impaccata

con etere di petrolio, usando come fase mobile una miscela CH Cl /MeOH 98:2.

2 2

Le frazioni sono opportunamente riunite dopo aver controllato mediante TLC

(cromatografia su strato sottile) la presenza del prodotto; la camera eluente

utilizzata è la stessa della fase mobile utilizzata in per la cromatografia su

colonna. Le frazioni che contengono il prodotto sono riunite, e il solvente

allontanato mediante evaporatore rotante. Dalla cromatografia si ottengono

0,2147g di Curcumina-3-Br purificata. La resa cromatografica della reazione è

del 35%. Il prodotto si presenta come un solido di colore rosso acceso.

Questa sintesi è stata ripetuta diverse volte per ottenere un quantitativo di

prodotto tale da permettere la caratterizzazione e la successiva sintesi del

PC21-3Br con il metodo 2.

Il prodotto è stato caratterizzato mediante NMR, spettrometria di massa e

analisi elementare.

H1 H2, H3 H5 H6 H7 H8 H9 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1

H4 0 1 2 3 4 5 6

6,5 7,6 5,8 6,5 7,1 6,9 7,0 7,1 7,1 6,9 3,9 3,9 4,2 2,4 3,6

0 2 3 2 3 5 7 0 5 3 3 7 2 1 6

Tabella 7: Chemical shift dei protoni (in ppm) relativi all'analisi dello spettro H-NMR

1

del Curcumina-3Br 16

Figura 13: Numerazione degli idrogeni del Curc-3Br per l'assegnazione dei

picchi nello spettro NMR

Tabella 8: Chemical shift dei protoni (in ppm) relativi allo spettro H-NMR in CDCl del

1 3

Curcumina-3Br

Figura 9: Spettro H-NMR del Curcumina-3Br in CDCl a 298K

1 3

Figura 14: Spettro H-NMR del Curcumina-3Br in CDCl a 298K

1 3 17

Figura 15: Spettro di massa del Curcumina-3Br

Analisi Effetti

element vo

are

teorica

per

C H BrO

24 25 6

C 58,91% 60,07

%

H 5,15% 6,04%

N 0% 0,10%

Tabella 2: Percentuali teoriche e pratiche di C, H, N da

analisi elementare del Curc- 3Br

C/H 11,4 9,95

Composto PM RM mmol Densit Purezza Quantità

(g\mo à

l) (g\mL)

Curcumina 368,3 1 2,600 95% 1,0083g

9

Idrazina 50,01 3 7,734 1,02 80% 0,474mL

monoidrata

Acido acetico 60,05 Slv 1,05 ̴̴30mL 18

2.1.2 Sintesi del PC21 (pirazolo della curcumina)

1,3-bis-(4-idrossi-3-metossifenil)etenilpirazolo H

N

N

 CH

CH

CH O O 3 3

3 O CH

+ +

O O O 2 H O

3

H N NH 2

2 2 C H C O O H

3 OH

H

O OH H

O

Sintesi: In un pallone da 100 mL si sciolgono 1,0083g curcumina in circa 30mL

di acido acetico ponendolo in agitazione e riscaldando in bagno d’olio con

refrigerante a bolle fino a ricadere per 1 ora. La soluzione inizialmente si

presenta arancione con riflessi gialli mentre dopo un’ora è di colore rosso scuro

con riflessi gialli. Si aggiungono 0,474mL di idrazina monoidrata goccia a

goccia, durante l’aggiunta si sviluppano vapori bianchi. Al termine delle

aggiunte, la soluzione si presenta di colore rosso acceso. Si lascia in agitazione

con riscaldamento a ricadere per 5 ore. L’andamento della reazione viene

monitorato mediante TLC (camera eluente: etilacetato/n-esano 9:1), per

verificare la scomparsa della curcumina. La reazione è già andata a

completezza dopo 3 ore, ma per sicurezza si lascia andare la reazione per altre

2 ore.

Work-up : si elimina il solvente all’evaporatore rotante, si aggiunge acqua che

manda in soluzione prodotti salificati ed eventuale acido acetico residuo,

mentre il prodotto, essendo poco solubile in acqua,

precipita e può essere filtrato su filtro Gooch. Il prodotto si

presenta di color giallo pallido (Figura 16). La massa

ottenuta è di 0,729g, e dunque la resa è stata del 77%. Dai

dati H-NMR il prodotto risultava avere una purezza

1

superiore al 95%, quindi non si è proceduto ad ulteriore

Figura 16: PC21

purificazione.

Il PC21 così ottenuto è stato caratterizzato tramite H-NMR

1

e utilizzato nella seguente sintesi del PC21-3Br con il metodo 1.

H

H H H

H H

H

H H 4

O O

N N 3 H

5

H H

O O

H H

H

H H

2

Figura 17: Numerazione degli idrogeni del PC21 per l'assegnazione dei picchi

H

1 8

H H 6

7

H1 H2 H3 H4 H5 H7 H8

6,54 6,80 6,99 7,04 3,82 6,71 6,90

Tabella 3: Chemical shift dei protoni (in ppm) relativi all'analisi dello spettro H-NMR del PC21

1 19

Figura 18: Spettro H-NMR del PC21 in MeOD-d a 298K

1 4 20

2.1.3 Sintesi del PC21-3Br (metodo 1)

1-[(4-(3-bromopropil)ossi-3-metossifenil)etenil]-3-[(4-idrossi-3-metossifenil)etenil]pirazolo

Composto PM RM mmol Densit Purezza Quantità

N NH

N NH (g\mo à

D M F

+ Br

l) (g\mL)

H

O

Br

H

O Br O

K C O K I

OH 2 3

PC21 363,3 1 1,384 95%* 0,5029g

O

O H C

H C O

O 3

3 H C

H C 9 3

3

1,3- 201,8 1 1,375 1,989 99% 0,141mL

dibromopropano 9

DMF Slv ̴̴40mL

K CO 138,0 1,2 1,651 0,2280g

2 3 5

KI 166 0,1 0,171 0,0284g

2

*: considero il prodotto della sintesi precedente come puro al 95%

Sintesi : In un pallone a tre colli da 100 mL si aggiungono 0,2280g di K CO e

2 3

0,0284g di KI e si sciolgono in DMF (circa 15mL) lasciando in agitazione per

mezz’ora a 40°C. Si aggiungono poi 0,5029g di PC21 ottenuti da precedenti

sintesi, preventivamente sciolti in DMF, e si lascia in agitazione per un’ora. In

questa fase il K CO deprotona uno dei due ossidrili del PC21 rendendo così la

2 3

molecola un buon nucleofilo per la seguente fase della reazione. E’ necessario

controllare che il PC21 sia ben disciolto in questa fase. Si aggiungono 0,141mL

di 1,3-dibromopropano goccia a goccia e si lascia in agitazione a 40°C per 48

ore. In questa fase avviene una sostituzione nucleofila con meccanismo S 2

N

che sostituisce uno dei due Br del 1,3-dibromopropano con il PC21 deprotonato

linker

permettendo l’attacco del a tre atomi di carbonio al PC21.

Work-up : si filtra lavando con acetato di etile, nella beuta di raccolta si

aggiunge acqua satura di NH Cl, e si estrae con acetato di etile in imbuto

4

separatore avendo cura di separare bene le due fasi e “lavando” la fase

organica ottenuta con acqua satura di NH Cl e NaCl. Si anidrifica la fase

4

organica con MgSO per un’ora, si filtra e si allontana il solvente a pressione

4

ridotta mediante evaporatore rotante. Una volta concentrato il prodotto, si

aggiunge acqua in modo da favorire la separazione del prodotto per

precipitazione, il composto può così essere recuperato tramite filtrazione su

buchner.

Purificazione : Il prodotto ottenuto grezzo si presenta come un solido rosa

pallido. Si procede alla purificazione del grezzo di reazione mediante

cromatografia flash su gel di silice (pore size 60 Å, 200-400 mesh), impaccata

con etere di petrolio, usando come fase mobile una miscela CH Cl /Acetonitrile

2 2

1:1. Le frazioni sono opportunamente riunite dopo aver controllato mediante

TLC (cromatografia su strato sottile) la presenza del prodotto; la camera

eluente utilizzata è la stessa della fase mobile utilizzata per la cromatografia su

colonna. Le frazioni che contengono il prodotto sono riunite, e il solvente

allontanato mediante evaporatore rotante. Dalla cromatografia si ottengono

21

0,047g di PC21-3Br. Data la vicinanza dei fattori di ritenzione del prodotto e del

substrato, non è stato possibile riuscire ad ottenere una buona separazione del

prodotto dal reagente.

Figura 19: Spettro H-NMR del PC21-3Br in DMSO a 298K

1

2.1.4 Sintesi del PC21-3Br (metodo 2)

O O CH

3 H

 O

O N N CH

3

+ H N NH

2 2

H

O O Br C H C O O H O

H

O

3

O O

H C CH

3 3 Br

1-[(4-(3-bromopropil)ossi-3-metossifenil)etenil]-3-[(4-idrossi-3-metossifenil)etenil]pirazolo

Composto PM RM mmol Densit Purezza Quantità

(g\mo à

l) (g\mL)

Curcumina-3-Br 489,3 1 0,323 95%* 0,158g

6

Idrazina 50,01 3 0,945 1,02 80% 0,059mL

monoidrata

Acido acetico 60,05 Slv 1,05 ̴̴30mL

*: considero il prodotto della sintesi precedente come puro al 95%.

Sintesi: In un pallone da 50mL si pongono 0,158g di Curcumina-3-Br derivante

da precedente sintesi e purificazione e si sciolgono in circa 30mL di acido

22

acetico mettendo in agitazione e riscaldando in bagno

d’olio con refrigerante a bolle fino a ricadere per un’ora

(la soluzione è arancione). Si aggiungono 0,059mL di

idrazina monoidrata, durante l’aggiunta si formano

vapori bianchi, e si lascia a reagire per 5 ore

controllando con TLC l’avanzamento della reazione

etile/n-esano

(camera Acetato di 9:1, oppure

CH Cl /MeOH 98:2)

2 2

Work-up : si stacca la reazione e si elimina il solvente al rotavapor. Si aggiunge

acqua, che rompe il sale formato tra il prodotto e l’acetato liberando acido

acetico, di cui si avverte l’odore caratteristico in questa fase, e il prodotto che,

essendo insolubile in acqua, precipita e può essere quindi filtrato su Gooch. La

massa di prodotto grezzo è di 0,1320g

H

Figura 20: PC21-3Br H

H

H N H

H H

H

H

N

H

H 4

16 7

O 8

11

13 O H

H

H 1

H

3

O 2

H H

H Br

10 O

9 H

12 H

H

6

H

H H

H

14

15 5

Purificazione: Il prodotto ottenuto deve essere purificato tramite

cromatografia su colonna, come riportato nel paragrafo 2.1.3. Dalla

cromatografia si ottengono 0,0252g di PC21-3Br che risulta essere ben

purificato. La resa cromatografica è del 16%. Di questo prodotto sono stati fatti

gli spettri H-NMR e di massa.

1

H1 H2 H3 H4 H8, H9, H10 H16 H5,H6, H13,H14,

H12 H11 H7 H15

3,56 2,29 4,08 3,79 6,94 6,8 6,52 3,78 6,71- 6,71-7,00

7,00

Figura 21: Numerazione degli idrogeni del PC21-3Br per l'assegnazione dei picchi

nello spettro H-NMR

1

Tabella 4: Chemical shift dei protoni (in ppm) relativi all'analisi dello spettro 1H-NMR del PC21-

3Br 23

Figura 22: Spettro H-NMR del PC21-3Br in CDCl a 298K

1 3

Lo spettro di massa conferma la presenza del prodotto desiderato, il pattern isotopico

del picco dello ione molecolare (485,1078 e 487,1078) è coerente con la presenza di

Br nel composto. Figura 23: Spettro di massa del PC21-3Br 24

2.2 Strumentazio