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Sindrome di Rett e sviluppo di nuovi potenziali farmaci ad azione agonista sul recettore serotoninergico 5-HT7 Appunti scolastici Premium

Tesi per Firenze - Unifi della facoltà di Farmacia elaborata dall’autore nell’ambito del corso di Chimica farmaceutica e tossicologia tenuto dal professore Campiani dal titolo Sindrome di Rett e sviluppo di nuovi potenziali farmaci ad azione agonista sul recettore serotoninergico 5-HT7. Scarica il file in formato PDF!

Materia di Chimica farmaceutica e tossicologia relatore Prof. G. Campiani

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dei movimenti spontanei, tremori, irregolarità nella respirazione e spesso convulsioni. I

sintomi peggiorano con il tempo, e gli animali muoiono entro 6-10 settimane di vita.

-/+

I topi femmina eterozigoti Mecp2 sono vitali e fertili. Il loro sviluppo sembra normale

fino a 4-6 mesi di vita, quando iniziano a manifestare i sintomi RTT.

308/y

Nei topi Mecp2 , la mutazione causa in MeCP2 una delezione della porzione C-

terminale, ma risparmia i due domini funzionali più importanti ovvero il dominio MBD e il

dominio TRD risultano funzionali. In questo fenotipo si osserva una sintomatologia molto

-/+

meno marcata rispetto al Mecp2-null e Mecp2 , tuttavia si osservano comunque deficit

nella capacità cognitiva e di apprendimento.

Uno studio del 2007 condotto dal Dott. Bird ha evidenziato come la riattivazione del gene

-/+

MECP2, sia nel fenotipo Mecp2-null e Mecp2 portava ad un significativo miglioramento

dei tremori, della respirazione e in generale della sopravvivenza, mentre la loro mobilità

non veniva recuperata del tutto. Questo studio ha dimostrato che, in modello murino, i

disturbi correlati alla proteina mutata MeCP2 possono essere revertiti anche se trattati in

17

stadi avanzati. 7

1.7 I RECETTORI 5-HT E LA LORO IMPLICAZIONE NELLA RTT

7

Nel tentativo di individuare nuovi target farmacologici e nuove terapie efficaci per la cura

della RTT, recentemente è stata individuata una forte correlazione tra i recettori

serotoninergici 5-HT e questa patologia neurodegenerativa. Recenti ricerche hanno

7

dimostrato come la modulazione di questi recettori da parte di ligandi agonisti apporti un

28

netto miglioramento nel quadro clinico di pazienti affetti da RTT. Per una migliore

comprensione dell’argomento è riportata di seguito un’analisi dei recettori 5-HT in

7

relazione alla RTT.

Il recettore della serotonina 7 (5-HT ), codificata dal gene Htr7 (OMIM# 182137), è tra i

7

recettori della serotonina di più recente scoperta. È un recettore che appartiene alla

famiglia delle GPCR, caratterizzato da sette eliche transmembrana accoppiato ad una

29

proteina G. Nell'uomo esistono tre varianti del recettore denominati 5-HT , 5-HT e 5-

7A 7B

HT che differiscono nella regione C-terminale. Nello specifico il recettore 5-HT è

7D 7A

composto da 445 amminoacidi,

mentre il recettore 5-HT è

7B

composto da 432 amminoacidi ed

infine l'isoforma 5-HT definita

7D

come sequenza canonica "full-

length" è composta da 479

amminoacidi. L'isoforma 5-HT è

7C

stata ritrovata solo in tessuti di ratto,

ma non in quelli umani e viceversa

non è stata rintracciata l'isoforma 5-

HT . Poiché le differenze

7D

interessano solo la porzione C-

terminale è stato osservato che le

attività dei ligandi che agiscono sulle Figura 4 Rappresentazione tridimensionale del modello del

recettoriale 5-HT . EL indica i loop extracellulari, IL i loop

7

varie isoforme recettoriali presentano intracellulari. Il composto 1 è la serotonina, agonista

endogeno dei recettori serotoninergici.

attività del tutto simili (in questa tesi la

nomenclatura 5-HT fa riferimento all'isoforma 5-HT , ovvero alla sequenza canonica).

7 7D

Tra tutti i sottotipi recettoriali serotoninergici, i recettori 5-HT sono quelli che mostrano la

7 30

maggiore affinità per la serotonina (1) con valori di attività nanomolari (Figura 4). 8

I recettori 5-HT sono molto diffusi a livello del sistema nervoso centrale e periferico, in

7

particolar modo sono altamente espressi nel talamo, ipotalamo e nell'ippocampo di topi e

ratti; quantità significative sono state rilevate nella corteccia cerebrale, l'amigdala,

cervelletto e midollo spinale. A differenza dei roditori, nel cervello umano i recettori 5-

31

HT sono stati trovati anche ad alti livelli nel nucleo caudato, putamen e substantia nigra.

7

Nel cervello dei roditori si è visto che i livelli di espressione dei recettori 5-HT è

7

particolarmente elevato nelle diverse aeree precedentemente elencate al momento della

nascita. Pur mantenendo un ruolo importante, negli esemplari adulti vengono meno

espressi. Oltre alla sua implicazione in disturbi psichiatrici, dolore ed epilessia, di recente è

emerso che ha un ruolo chiave nei processi cognitivi, in modo particolare nella capacità di

apprendimento e nella memoria a livello del ippocampo e nella regolazione della plasticità

32

neuronale. In accordo con queste osservazioni, l'attivazione del recettore 5-HT attiva una

7

cascata di segnalazione mediata dalle proteine G e G che provoca l'attivazione di

s 12

effettori a valle che hanno un ruolo di rilievo nelle funzioni cognitive e nella plasticità

neuronale come ERK (Extracellular Receptor-activated Kinase), AMP (Adenosina

Monofosfato), Cdk5 (Cyclin-dependent kinase 5).

Nello specifico, una volta stimolato il recettore 5-HT si accoppia alla proteina G , che a

7 s

sua volta induce l’attivazione dell’AMP, con formazione del cAMP e l’attivazione della

PKA (Protein Kinasi A). A valle della formazione di cAMP, i recettori 5-HT possono

7

attivare ERK. Si è visto che ERK può essere mediata sia da PKA o da una via cAMP-

dipendente PKA-indipendente. Quest’ultima coinvolge direttamente le proteine di scambio

33

direttamente attivate da cAMP.

I recettori possono anche accoppiarsi alla proteina G , proteina eterotrimerica che modula

12

l’attività di piccole GTPasi monomeriche della famiglia delle Rho quali Rac e Cdc42.

Attraverso l’attivazione di G dipendente di RhoA e Cdc42 viene regolata la trascrizione

12

genica e la morfologia neuronale. I meccanismi con cui il recettore 5-HT si accoppia a G

7 s

34

o G non è chiaro (Figura 5).

12

Evidenze scientifiche suggeriscono che la neurotrasmissione monoaminergica e della

serotonina è deficitaria sia nei pazienti con RTT che in modelli murini della malattia,

suggerendo un nuovo bersaglio terapeutico per la RTT. I risultati presentati dimostrano che

l’attivazione del recettore 5-HT , mediante l’utilizzo di un agonista selettivo, ripristina i

7 28

difetti neuronali e comportamentali associati alla mutazione di MECP2 (Figura 5).

Tuttavia in seguito alla somministrazione intracerebrale della tossina batterica CNF-1

(fattore citotossico necrotizzante attivo su uomo e animali) venivano attivate

9

specificamente le Rho GTPasi cerebrali contrastando efficacemente i deficit di

apprendimento e la ridotta plasticità sinaptica presente in topi con mutazione di MeCP2.

Ulteriori evidenze suggeriscono che la somministrazione di agonisti che determinano

palmitoilazione dei recettori 5-HT vanno a colpire esclusivamente l’attività mediata da G ,

7 s

senza alcun effetto su quella G . Questo potrebbe indicare che processi di palmitoilazione

12

possono determinare un cambiamento dell’attività costitutiva del recettore, cambiando così

35

l’effetto finale.

Un’altra considerazione interessante è che l’espressione di G rimane costante durante lo

s

sviluppo, mentre quella di G in parallelo con i recettori 5-HT è superiore nei neonati.

12 7

Infatti, la via metabolica 5-HT -G sembra avere un ruolo cruciale nello sviluppo delle

7 12 32

sinapsi, infatti sono stati osservati nell’ippocampo di topi giovani ma non in quelli adulti.

Una caratteristica particolare di recettori 5-HT , simile ad altre GPCR, è la capacità di

7

formare complessi recettoriali, sia omo che eterodimerici. Ad esempio, è stato suggerito

che una interazione eterodimerica 5-HT -5-HT gioca un ruolo di modulazione nel

7 1A

controllo della temperatura corporea. L’eterodimerizzazione può anche influenzare i

percorsi di segnalazione regolati da un determinato monomero recettore che può

comportarsi come un “interruttore” accoppiato a proteine G. In questo modo

l’eterodimerizzazione fornisce un meccanismo supplementare che regola i processi

cellulari attraverso la messa a punto della segnalazione mediata da recettori. L’analisi

funzionale della dimerizzazione tra 5-HT in cui ricordiamo essere accoppiato ad una

7

proteina G e 5-HT che al contrario è accoppiato ad una proteina G porta ad una

s 1A i

riduzione dell’attività del 5-HT con una riduzione della proteina G , senza però

1A i

influenzare l’attività dei 5-HT mediata dalla G . È stato dimostrato che

7 s

l’eterodimerizzazione mediata da un agonista può avviare l’internalizzazione dei recettori

5-HT solitamente resistenti all’internalizzazione quando svolgono il loro ruolo da soli.

1A

Una volta internalizzato, il recettore 5-HT può attivare vie di segnalazione alternative. Si

1A

è inoltre supposto che uno squilibrio del rapporto tra omo ed eterodimeri tra 5-HT e 5-

1A

HT a livello dei neuroni pre e post sinaptici dell’ippocampo possa avere un ruolo

7 36

sull’insorgenza di ansia e depressione. 10

Figura 5 Disegno schematico del recettore 5-HT e delle vie di segnalazione e gli effettori a valle che

7

portano al rimodellamento della morfologia neuronale. Le linee piene indicano vie accertate, le linee

tratteggiate indicano vie possibili. Infine, i pannelli inferiori sono foto di neuroni striatali in cui si

evidenza la lunghezza del neurone e le SD. Immagine di Volpicelli, "The serotonin receptor 7 and the

structural plasticity of brain circuits";2014. 11

1.8 RUOLO DEI RECETTORI SEROTONINERGICI NELLO

SVILUPPO DELLE SINAPSI

I recettori serotoninergici (5-HT) svolgono un ruolo cruciale nel determinare la struttura

del cervello e dei circuiti neuronali durante lo sviluppo attraverso la modulazione della

proliferazione delle cellule neurali, della migrazione, della differenziazione. I suddetti

recettori regolano inoltre anche altri processi quali la crescita dei neuriti e la formazione

delle sinapsi. Di conseguenza, i primi cambiamenti nei livelli cerebrali dei recettori 5-HT

durante lo sviluppo riguardano l'organizzazione funzionale delle reti cerebrali e possono

essere alla base della patogenesi dei disordini dello sviluppo neurologico, tra cui l’autismo.

Mentre il ruolo dei recettori 5-HT nello sviluppo del cervello è stata ormai assodata, solo

di recente è emerso l’importanza dei recettori 5-HT . È stato dimostrato in uno studio di

7

Ponimaskin, condotto su neuroni dell’ippocampo di topo,che la stimolazione di 5-

HT /RhoA e Cdc42 porta ad un allungamento dei neuriti, ad un incremento della densità

7 32

delle SD, delle sinapsi e della quantità di recettori AMPA espressi a livello delle sinapsi.

1.9 FUNZIONI FISIOLOGICHE DEL RECETTORE 5-HT 7

I recettori 5-HT controllano diverse funzioni del corpo, tra cui il ciclo sonno-veglia, la

7

temperatura corporea e la nocicezione; è noto come questi recettori influenzino fortemente

l'umore e l'apprendimento, due funzioni cerebrali superiori che sono strettamente correlate.

La maggior parte delle funzioni regolate da recettori 5-HT sono state studiate con topi

7

37

knock-out (5 HT -KO). Di seguito sono riportati i processi in cui i recettori 5-HT

7 7

svolgono una funzione chiave nella loro regolazione.

TEMPERATURA CORPOREA: si è visto che la somministrazione di agonisti 5-HT in

7

porcellini d’india e topi induce una diminuzione della temperatura corporea nei soggetti

38

wt, cosa che non si verifica nei modelli 5-HT -KO.

7

NOCICEZIONE: Studi di immunoistochimica hanno fornito prove per la localizzazione dei

recettori 5-HT in lamine superficiali del corno dorsale e nelle cellule dei gangli delle

7

radici dorsali piccole e medie dimensioni, che è coerente con il ruolo dei recettori 5-HT

7

39

nella nocicezione. Generalizzando si può dire che a livello periferico agonisti 5-HT

7

40

mediano un effetto pro-nocicettivo, mentre a livello centrale un effetto anti-nocicettivo. 12

MEMORIA E APPRENDIMENTO: I recettori 5-HT sono espressi ad alti livelli

7

nell'ippocampo, una zona fondamentale per l'apprendimento, e modulano la trasmissione

41

sinaptica e la plasticità neuronale. Studi comportamentali condotti su topi privi dei

recettori 5-HT (5-HT -KO) e sugli animali wt hanno dimostrato che l'attivazione dei

7 7

recettori 5-HT esercita un'azione pro cognitiva su diversi tipi di memoria. Topi 5-HT -KO

7 7

non hanno mostrato una riduzione della capacità di riconoscere gli oggetti (memoria

episodica), mentre l’apprendimento spaziale è venuto a mancare, infatti il topo aveva

difficoltà a riconoscere una posizione nuova. La stessa problematica si è verificata nei topi

32

wt trattati con antagonisti 5-HT ).

7

SONNO E RITMO CIRCANDIANO: I recettori 5-HT hanno un ruolo nel sonno, e questo è

7

emerso in seguito a studi che hanno utilizzato approcci sia farmacologici e che genetici.

Topi 5-HT -KO mostrano una riduzione della durata del sonno REM, mentre il tempo

7

trascorso durante la veglia o la fase non-REM del sonno non risultava diverso da topi wt.

La somministrazione in vivo di un antagonista del recettore 5-HT in animali wt ha ridotto

7

la durata del sonno REM. Tuttavia, in contrasto con questi risultati, la somministrazione

sistemica di un agonista del recettore 5-HT riduce la durata del sonno REM, insieme a

7

indurre uno sfasamento nel sonno. Come possibile spiegazione, è stato proposto che i

recettori 5-HT non si comportano secondo il classico modello "agonista-attivazione

7 32

recettoriale; antagonista-blocco recettoriale".

1.10 TRATTAMENTO FARMACOLOGICO DELLA RTT

Considerando l'assenza di una terapia specifica ed efficace per il trattamento della RTT, il

ruolo della terapia non farmacologica gioca un ruolo chiave nella vita di queste giovani

pazienti.

Nei primi anni di vita si consiglia un trattamento di tipo psicomotorio al fine di mantenere

le funzioni che erano state acquisite come abilità relative all'uso della comunicazione, non

solo strettamente linguistica, gestuale, mimica, tonica e delle modulazioni affettive

emozionali. Fondamentale è il mantenimento delle abilità motorie, non solo a livello

esecutivo pratico, ma anche a livello cognitivo nella elaborazione dello schema corporeo,

dell'utilizzo dello spazio e del tempo, della motivazione del soggetto. Il tutto deve essere

incoraggiato con strategie ludiche. Da non sottovalutare anche la “pet therapy” e musico

42

terapia. 13

Da un punto di vista farmacologico, il trattamento della patologia mira soltanto a

migliorare e ridurre la sintomatologia senza fornire una cura efficace. La somministrazione

quotidiana di desipramina (2; Figura 6) diminuisce significativamente i decessi per arresto

respiratorio e aumenta largamente le prospettive di vita in modelli animali con RTT. La

somministrazione di farmaci è volta principalmente a contrastare il disturbo motorio e a

43

tale scopo sono stati impiegati gli agonisti per i recettori dopaminergici.

L’uso di naltrexone (3; Figura 6) ha mostrato miglioramenti dei sintomi respiratori e

44

comportamentali, riducendo anche le crisi epilettiche, anche se per contrastare

45

quest’ultime sono stati impiegati con successo anche gli antiepilettici.

1.11 TERAPIE FUTURE PER IL TRATTAMENTO DI RTT

Come si è ampiamente discusso nei paragrafi precedenti, molti si sono adoperati nello

sviluppare razionalmente dei composti attivi sui recettori 5-HT . A tale scopo sono stati

7

sviluppati dei composti che hanno attività agonista ed altri che invece hanno attività

46

antagonista.

Composti agonisti: possiamo vedere come in questa categoria siano presenti composti che

mostrano una selettività ed un'affinità diversa sui vari sottotipi recettoriali. Il composto E-

47

55888 (4; Figura 6) è l'agonista più selettivi fino ad ora descritti. Di particolare interesse

è il composto LP-211 (5; Figura 6) che mostra una buona affinità per il recettore 5-HT e

7

nonostante problemi di farmacocinetica è in grado di superare la barriera ematoencefalica.

Altri analoghi di LP-211 con una migliore selettività e proprietà farmacocinetiche sono

48-49

stati sintetizzati. Infine, possiamo riportare come composto con ottima affinità, ma

nessuna selettività sui recettori serotoninergici il 8-idrossi-N,N-dipropil-aminotetralina (8-

50

OH-DPAT; 6; Figura 6).

Composti antagonisti: sono noti anche composti che hanno mostrato un'ottima affinità per i

recettori 5-HT con una funzione però antagonista. Tra questi sono noti alcuni composti

7 51

con azione antipsicotica e antidepressiva. 14

Infine il composto EPI-743 (7; Figura 6), che pur non avendo un'attività sui recettori 5-

HT , è un antiossidante già approvato negli stati uniti per un’altra patologia mitocondriale,

7

la malattia di Leighs. Si è visto tuttavia che questa molecola potrebbe avere un razionale

impiego nel trattamento delle crisi epilettiche e nella RTT, infatti si trova in fase II della

52

sperimentazione clinica per la potenziale cura della RTT.

Figura 6 Composti in fase di studio per la RTT. 15

CAPITOLO 2: OBIETTIVO DELLA TESI

2.1 PROGETTAZIONE DI LIGANDI SELETTIVI PER IL

RECETTORE 5-HT 7

La RTT, pur essendo una patologia rara, porta con sé conseguenze molto gravi e rende le

pazienti completamente invalide, le quali necessitano di un’assistenza continua.

Fino a questo momento la ricerca cercando soluzioni terapeutiche ha fornito soltanto

farmaci che, pur non essendo una cura alla patologia, possono quanto meno migliorare la

qualità della vita dei pazienti.

Molte sono le energie che si stanno impiegando per sviluppare nuovi potenziali farmaci

che hanno come bersaglio il recettore 5-HT che sembra avere un ruolo chiave

7

nell’espressione del gene MECP2 e nella formazione di sinapsi tra neuroni.

Data la scarsità di molecole agoniste selettive su questo recettore, l’impegno di questa tesi

è stato incentrato sullo sviluppo di nuovi potenziali ligandi che, a livello computazionale,

fossero selettivi in un primo momento sulla famiglia di recettori 5-HT e in un secondo

momento questa selettività fosse mantenuta anche negli altri recettori della classe A delle

GPCR considerati in questo studio. Obbiettivo ambizioso, considerando l’elevato grado di

conservazione di sequenze che caratterizza le GPCR specialmente a livello del sito di

legame.

Inoltre, data l’assenza di modelli cristallografici del recettore 5-HT è stato necessario

7

creare un modello per omologia e in un secondo momento validarlo al fine di poter avere

delle predizioni attendibili.

Per questo motivo il lavoro svolto è stato diviso in due fasi utilizzando vari software, sotto

elencati, presenti nella suite di Maestro (Maestro, version 9.2, Schrödinger, LLC, New

York, NY, 2011):

1. Costruzione di un modello per omologia del recettore 5-HT :

7

I. Scelta dei migliori templati per modellare ogni singola elica con Prime “Structure

Prediction” (Prime, version 3.0, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2011)

II. Minimizzazione dei loop intra ed extracellulari con Prime “Refinement Loop”

(Prime, version 3.0, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2011)

III. Selezione da www.bindingdb.org di 161 molecole attive su 5-HT e successivo

7

studio di docking con la procedura Induced Fit Docking (IFD) (Prime, version 3.0,

16

e Glide version 5.7, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2011) presente nella suite

di Maestro.

IV. Per i recettori 5-HT , 5-HT e 5-HT è stato necessario la costruzione del

1A 2A 2C

modello di omologia con Prime “Structure Prediction” (Prime, version 3.0,

Schrödinger, LLC, New York, NY, 2011), mentre per 5-HT e 5-HT erano

1B 2B

presenti le strutture cristallografiche. Tutti questi modelli sono stati validati

utilizzando il protocollo di Induced Fit Docking.

V. I modelli sono stati ulteriormente validati utilizzando il metodo dei decoys generati

a partire da un set di ligandi attivi per ogni recettore considerato. I Docking Score

ottenuti sono stati utilizzati per creare le curve “Receiver Operating Characteristic”

(ROC) al fine di valutare l’efficacia del protocollo di docking attraverso un’analisi

statistica.

2. Progettazione di nuovi ligandi selettivi per 5-HT :

7

I. Selezione di molecole di riferimento non selettive, attive su tutti i recettori 5-HT.

II. Preparazione delle librerie di reagenti e modifiche delle molecole di riferimento

con l’ausilio del software CombiGlide.

III. Analisi dei risultati ottenuti dai docking con CombiGlide, selezione delle migliori

soluzione e successivo docking molecolare con IFD (Prime, version 3.0, e Glide

version 5.7, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2011) dei migliori sui 5-HT

selezionati.

IV. Calcolo delle energie libere di legame delle migliori pose selezionate con Prime

MM-GBSA (Prime, version 3.0, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2011)

V. Conferma della selettività in silico con IFD su altri 15 recettori della classe A delle

GPCR di cui erano disponibili le strutture cristallografiche nel PDB (recettore

adenosinico, A ; recettore adrenergico, β ; recettore muscarinico M ; recettori per

2A 2 2

μ,

le chemochine CXCR-1, CXCR-4 e CCR-5; recettori oppioidi k e δ; recettori

attivati da proteasi PAR-1; recettore dell’angiotensina II AT ; recettore

2

dell’istamina H ; recettore dopaminergico D ; recettore della sfingosina-1 fosfato;

1 3

recettore purinergico P2Y ).

12

Seguendo questo protocollo è stato possibile, generare un elevato numero di ligandi, che

pur non essendo selettivi per il recettore di interesse, mostravano un’ottima affinità per i

recettori 5-HT considerando i valori molto elevati del docking score rispetto ai ligandi 5-

HT non selettivi conosciuti. È stato inoltre possibile ottenere in silico una molecola che

mostra una marcata selettività per il recettore 5-HT confermando che il protocollo

7 17

computazionale utilizzato è sicuramente idoneo per poter identificare ligandi selettivi

attraverso famiglie di recettori con strutture altamente correlate come i recettori

serotoninergici. Per una migliore comprensione delle fasi che hanno caratterizzato questo

lavoro, la Figura 7 vuole rappresentare proprio il work-flow di questo periodo di tesi.

Validazione scelta

molecole reagenti CombiGlide

attacco delle

e Preparazione

modificare di 7

dei

delle 5-HT

punti librerie tramite

Fine Scelta dei

da selettivi

Validazione ROC

decoy di

tramite con MM-GBSA

selettività dell’Energia

c’è Calcolo

curve

con Binding

Non

Preparazione molecole Ligandi

nuove

1A 1B 2A 2B 2C

7 ligando

5-HT

5-HT 5-HT 5-HT 5-HT 5-HT strutture)

cristallizzate

con GPCR

molecole 5-HT7

generate SP 1

le classe

dockate

Tutte Glide del sulle

su (15

IFD

Validazione ligandi IFD

20 docking ∆XP

DockingScore DockingScore 5.00

XP Confronto

selettività

Minimizzazione c’è

-5.00 -5.00 se

e Refinement” Glide >

Se Se

modelli Non Score

e

“Loop Segue

> < Pose

in

dei docking

templato Mode XPScore XPScore modelli

Selettività

i con con

Costruzione Costruzione Costruzione

con Verifico

-8.00 -8.00 IFD 5-HT

server Prime Prime Consesus

modello modello

modello in

Segue

1 > < su

elica Se Se

1

Templati

Scelta

Figura 7 Diagramma del protocollo utilizzato durante il periodo di tesi.

In BLU viene messo in risalto la prima fase di sviluppo di modelli che fossero in grado di discriminare correttamente

le molecole già note. In ROSSO viene messo in risalto la seconda fase della ricerca, ovvero la fase di sviluppo di

nuovi potenziali ligandi potenzialmente selettivi per 5-HT7. Si sottolinea che l’assenza di selettività, in alcuni casi,

ha comunque portato alla progettazione di alcuni ligandi con buona affinità per i recettori 5-HT in silico. 18

CAPITOLO 3: RISULTATI E DISCUSSIONE

3.1 COSTRUZIONE DEI MODELLI DI OMOLOGIA E

VALIDAZIONE TRAMITE STUDI DI DOCKING MOLECOLARE

DEI RECETTORI 5-HT , 5-HT , 5-HT , 5-HT , 5-HT , 5-HT

1A 1B 2A 2B 2C 7

Costruzione

modello con i 5-HT

1A

server Validazione Validazione

5-HT

20 ligandi 1B

Costruzione con decoy

Minimizzazione

modello con IFD tramite

Scelta dei modelli e

Prime 5-HT

7 curve ROC

Templati “Loop

1 elica 1 templato Fine Validazione

Refinement” 5-HT

2A

Costruzione

modello con 5-HT

Prime 2B

Consesus Mode 5-HT

2C

3.1.1 COSTRUZIONE DEL MODELLO PER OMOLOGIA DEL RECETTORE 5-

HT7

Data l’assenza di strutture cristallografiche del recettore 5-HT è stato necessario creare un

7

modello tridimensionale utilizzando la tecnica computazionale nota come homology

modelling. A tal fine, sono stati tentati diversi approcci, sia utilizzando server specializzati

(SWISS-MODEL, I-TASSER), sia utilizzando software come Prime presente nella suite di

Maestro.

Per poter utilizzare i server è stato necessario fornire la sequenza primaria che è stata

scaricata in formato fasta da UniprotKB (codice fasta 5-HT umano: P34969 ).

7

I modelli che sono stati generati presentavano delle problematiche quali: le 7 eliche

transmembrana non erano ripiegate in modo corretto, in altri casi non presentavano la

lunghezza appropriata oppure i loop non connettevano correttamente le eliche, o venivano

addirittura eliminati.

Dato che la generazione dei modelli con l’approccio sopraindicato non ha fornito risultati

interessanti, si è reso indispensabile un cambio di approccio che prevedeva l’utilizzo del

software Prime. Questo software offre numerosi metodi per generare modelli per

omologia. Se si decide di utilizzare “multiple template-based homology modeling", ovvero

l’uso di più templati per generare un unico modello per omologia, è necessario scegliere

una delle seguenti metodiche per la costruzione del modello: “Composite model”, “Homo-

19

multimer”, “Consensus model”. Questa strategia che prevede l’utilizzo di più templati per

la costruzione di un modello per omologia, è già stata utilizzata all’interno del nostro

gruppo di ricerca nella creazione del modello 5-HT , mostrando peraltro buoni risultati in

1A

53

quanto migliora la qualità del modello stesso. Come primo passo nella costruzione dei

modelli è stato effettuato quello della ricerca di potenziali templati che fungessero da

“stampo” per generare i modelli tridimensionali dei recettori in esame, cercando quali

fossero i recettori già cristallizzati che avessero la più alta percentuale di identità e

similarità di sequenza con il recettore in esame. Questo passaggio è stato fatto

confrontando le sequenze primarie tramite lo strumento “Homology model template

selection" presente in GPCRDB (http://www.gpcr.org/7tm/ data di accesso Giugno

54

2015).

I templati selezionati per la generazione del modello del recettore 5-HT sono riportati in

7

Tabella1.

Tabella 1 Risultati relativi all'allineamento delle strutture primarie dei templati utilizzati per la

generazione del modello per omologia del recettore 5-HT . I dati relativi sono stati reperiti sul sito

7

GPCRDB.

ID Identità Similarità Tipo

Recettore Ligando

PDB % % Ligando

2Y00 ß Adrenergico 42 63 Y00 Agonista

1

3PDS ß Adrenergico 40 62 ERC Agonista

2 5-HT 1B

4IAQ 44 60 2GM Agonista

Serotoninergico

3PBL D Dopaminergico 40 57 ETQ Antagonista

3

MEDIA 41.5 60.5

Dalla Tabella 1 si può osservare un elevato grado di identità tra i templati selezionati e il

recettore 5-HT , ed una elevata percentuale di similarità che, come abbiamo già discusso

7

precedentemente, è una caratteristica intrinseca delle GPCR. Questo elevato grado di

53

conservazione si manifesta specialmente a livello delle 7 eliche transmembrana, mentre i

loop sono porzioni altamente variabili. Una volta scelti i 4 templati riportati in Tabella 1,

questi sono stati utilizzati nella fase di costruzione del modello tramite l’uso del software

Prime attraverso la tecnica del “Consensus Model". Attraverso questa tecnica il modello

che viene creato deriva da una media dei modelli generati per ciascun templato. Per

esempio se si utilizzano 3 templati per la costruzione di un modello, se due templati hanno

un loop nella stessa regione spaziale ma nel terzo modello il loop occupa una regione

20

differente, il modello verrà costruito sui due templati che mostrano una maggiore similarità

nella loro struttura secondaria.

Purtroppo però il risultato ottenuto è stato che i loop intra ed extra cellulari erano stati

eliminati perché non c’era un sufficiente grado di conservazione in quelle zone e quindi

Prime non è stato in grado di modellare la sequenza di amminoacidi formanti i loop.

Quindi i modelli risultanti non erano sicuramente utilizzabili per ulteriori studi.

Conseguentemente, è stato necessario utilizzare un’altra tecnica sfruttando l’utilizzo di più

templati come dettagliatamente riportato nel paragrafo successivo.

3.1.2 COSTRUZIONE MODELLO COMPOSITE MODEL

Come precedentemente descritto l’utilizzo della tecnica di homology modeling in Prime

sfruttando la funzione “Consensus Model” non ha prodotto risultati apprezzabili. Si è

passati quindi dalla selezione di templati che venivano usati per modellare tutta la proteina

ad un “Composite Model” dove invece è necessario specificare quale templato deve essere

utilizzato per ogni regione della sequenza.

Tabella 2 Di seguito sono stati riportati i dati per la costruzione del modello per omologia del recettore 5-HT 7

attraverso il "Composite Model" presente nel software Prime. Sono riportati di seguito il miglior templato,

ovvero quello che presenta la più alta percentuale di similarità e/o identità per ogni singola elica in seguito

all’allineamento del templato con la sequenza primaria del recettore 5-HT .

7

Codice Identità Similarità

ELICA Recettore

PDB % %

elica 1 2Y00 ß adrenergico 29 51

2

(74-108)

elica 2 3PBL D dopaminergico 53 73

3

(115-144)

elica 3 2Y00 ß adrenergico 56 79

2

(152-185)

elica 4 4IAQ 5-HT serotoninergico 46 54

1B

(196-219)

elica 5 2Y00 ß adrenergico 38 75

2

(237-268)

elica 6 2Y00 ß adrenergico 53 68

2

(315-352)

elica 7 3QAK A adenosinico 43 70

2A

(364-386)

MEDIA 45.43 67.14 21

In questo modo è possibile selezionare per ogni parte della struttura primaria il templato

che presenta un grado di conservazione più elevato.

In tale ottica si è deciso di scegliere il miglior templato per ogni elica transmembrana,

ovvero quello che avesse la più alta percentuale di identità e similarità (Tabella 2).

È stata necessaria un’analisi su GPCRDB per capire quali fossero i templati migliori per

ogni singola elica. Questo ha permesso di aumentare in modo significativo l’identità di

sequenza di ogni singola elica con il templato di riferimento. Inoltre, si può notare

confrontando le due tabelle (Tabelle 1 e 2), che il recettore ß nonostante abbia

1

mediamente un elevato grado di similarità sull’intero recettore, non è stato utilizzato nella

costruzione di nessuna elica perché la percentuale relativa ad ogni elica era più bassa

rispetto a quella di altri templati. Al contrario, il recettore A ha mediamente una

2A

percentuale di similarità e identità inferiore ai templati che abbiamo visto in Tabella 1, ma

presenta un grado di identità di sequenza su una singola elica maggiore dei templati

analizzati e quindi è stato utilizzato per la costruzione dell’elica selezionata. Questa analisi

è stata svolta su ogni singola elica durante la costruzione del modello tridimensionale del

recettore 5-HT . Una volta scelti i templati da utilizzare, li abbiamo scaricati dal Protein

7

Data Bank (PDB) e sono stati importati in Maestro.

I templati scelti, riportati in Tabella 2, sono stati ottimizzati. Infatti per la cristallizzazione

delle proteine vengono aggiunti dei residui che servono sostanzialmente a stabilizzare il

recettore. È il caso ad esempio del recettore 5-HT (Codice PDB 4IB4) in cui il recettore è

2B

stato fuso con il citocromo solubile di Escherichia coli (codice UniprotKB P0ABE7).

Come viene riportato in letteratura, questi artifizi utili alla cristallizzazione possono

inficiare la qualità del modello generato. Per ovviare a questo problema è stato applicato

un protocollo di rifinitura dei templati già utilizzato nel nostro team di ricerca per la

generazione del modello per omologia del recettore serotoninergico 5-HT che prevede

1A

l'eliminazione delle porzioni che costituiscono gli artifizi di cristallizzazione.

Una volta ottimizzate le varie proteine, la sequenza primaria del recettore 5-HT (codice

7

fasta UniprotKB 5-HT umano: P34969) è stata importata in Prime. Successivamente sono

7

stati importati i templati, precedentemente ottimizzati, dal "Project Table" e sono stati tutti

allineati utilizzando il software Clustal omega presente all’interno della suite di Maestro.

Nel passaggio successivo è stata esplicitata la struttura secondaria basandosi sulla

lunghezza delle eliche come riportato dal server GPCRDB. Una volta fatto questo ulteriore

passaggio, si è passati a selezionare prima il “Composite Model" e quindi a selezionare le

porzioni di ogni templato per modellare ogni singola elica con il templato di riferimento. 22

Grazie a questa procedura il modello tridimensionale del recettore 5-HT è stato generato e

7

successivamente rifinito, trattandolo con l’applicazione Protein Preparation Wizard. Dopo

questa prima grossolana rifinitura il modello è stato sottomesso al server RAMPAGE per

55

generare il grafico di Ramachandran

(http://mordred.bioc.cam.ac.uk/~rapper/rampage.php data di accesso 15 Novembre 2015).

Da questa prima analisi risulta evidente che la quasi totalità dei residui localizzati nelle

zone sfavorite erano appunto quelli posizionati sui vari loop. Per questo motivo tutti i loop,

sia intracellulari (IL 1-3) che extracellulari (EL 1-3), sono stati considerati nel processo di

rifinitura successivo.

Infatti, il modello 5-HT è stato sottoposto ad un procedimento di rifinitura con il software

7

Prime “Refinement Loop”. Al termine di questo lungo lavoro è stato rigenerato lo spettro

di Ramachadran con la stessa metodica descritta in precedenza.

Come è possibile vedere in Figura 8, analizzando il grafico, solo 6 residui (1.9%) sono

presenti nelle zone “non consentite” e sono comunque residui localizzati sui loop che per

loro natura sono porzioni altamente mobili e senza una conformazione fissa. Abbiamo

ritenuto questo primo risultato soddisfacente e sufficiente per passare alla fase di

validazione del modello tramite studi di docking molecolare.

Figura 8 Spettro di Ramachandran per il recettore 5-HT in seguito alle operazioni di rifinitura.

7 23

3.1.4 COSTRUZIONE MODELLI PER OMOLOGIA DI 5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT2C

Data l’assenza di strutture cristallografiche per i recettori appratenti alla famiglia dei 5-HT

(5-HT , 5-HT , 5-HT ), è stato necessario l’utilizzo della tecnica di homology

1A 2A 2C

modelling anche per la costruzione dei loro modelli tridimensionali.

Inizialmente è stato selezionato il migliore templato su GPCRDB con la funzione

“Homology model template selection”. Il migliore templato per i recettori 5-HT , 5-HT ,

1A 2A

5-HT è risultato il recettore 5-HT (codice PDB: 4IB4; Tabella 3).

2C 2B

Tabella 3 Di seguito sono riportati i dati relativi all'allineamento delle strutture primarie dei recettori 5-

HT , 5-HT , 5-HT . Le sequenze sono state allineate sul sito GPCRDB.

1A 2A 2C

Recettore da Codice Miglior Identità Similarità

modellare UniprotKB templato % %

5-HT P08908 4IB4 (5-HT ) 57 74

1A 2B

5-HT P28223 4IB4 (5-HT ) 67 85

2A 2B

5-HT P28335 4IB4 (5-HT ) 67 86

2C 2B

I 3 modelli, data l’elevata percentuale di identità e similarità, sono stati costruiti con il

software Prime Structure Prediction utilizzando un solo templato. Nel passaggio

successivo si è esplicitato la struttura secondaria basandosi sui dati reperiti da GPCRDB e

si è quindi passati alla generazione dei modelli. Questa volta non sono stati riscontrati

problemi con la generazione dei 3 modelli, infatti le 7 eliche transmembrana rispettavano

le lunghezze sperimentalmente determinate e i loop connettevano correttamente le eliche.

Successivamente, le strutture sono state rifinite con il protocollo di rifinitura presente nel

software Prime.

3.1.5 VALIDAZIONE DEI MODELLI

Per la validazione dei modelli prima di tutto sono state identificate venti molecole per ogni

sottotipo recettoriale 5-HT. Dieci sono state considerate “attive” con Ki < 150 nM, mentre

le altre dieci con Ki > 800 nM sono state considerate come “inattive”.

Per il recettore 5-HT è stata inoltre creata una libreria di 161 molecole “attive” al fine di

7

estendere ulteriormente la valutazione sull’affidabilità del modello tridimensionale

generato. 24

Questi gruppi di molecole sono state disegnate grazie all’ applicazione “2D sketcher” di

Maestro e poi sono state trattate con il software LigPrep presente nella suite di Maestro che

serve a generare una conformazione della molecola tridimensionale, oltre che a generare i

vari tautomeri e a calcolare lo stato di ionizzazione al pH impostato di 7.00 ± 0.5.

Una volta ultimate le varie librerie di composti per ogni recettore si è passati alla fase di

docking molecolare.

3.1.6 VALIDAZIONE TRAMITE INDUCED FIT DOCKING

In un primo momento si è provato ad utilizzare Glide Ligand Docking utilizzando il

protocollo XP (Extra Precision) per il docking dei 20 composti selezionati per il 5-HT

7

(Tabella 3). Tuttavia non è stato ottenuto il risultato sperato, ovvero una separazione dei

ligandi “attivi” da quelli “inattivi” in termini di XP Score. Anche se le procedure di

docking non riescono a discriminare molecole con differenze minime di Ki, quando la

differenza di Ki si attesta su 3 o più ordini di grandezza, se il modello è costruito

correttamente e il protocollo di docking è adeguato, questa differente affinità è

apprezzabile con valori di Docking Score sostanzialmente diversi.

È stato quindi utilizzato il protocollo di docking nominato Induced Fit Docking, che

accoppiando i software Prime e Glide è in grado di indurre cambiamenti conformazionali

nel sito di legame per accomodare il ligando, minimizzando le catene laterali e il

“backbone” della proteina. 56

Abbiamo quindi selezionato il residuo Asp 162 nel recettore 5HT , corrispondente al

7 57

residuo 3.32 secondo la numerazione di Ballesteros and Weinstein, come residuo di

riferimento su cui centrare la griglia per il docking per tutti i recettori usati in questo studio

per ottenere risultati di docking che potessero essere in qualche modo comparabili anche

per differenti classi di GPCR.

Come risultato finale della procedura di docking per il recettore 5-HT è stato ottenuto che

7

7 strutture su 10 considerate “attive” venivano correttamente riconosciute tali e gli sono

stati attribuiti valori di docking score inferiori a -9.00 kcal/mol (Tabella 4). 25

Tabella 4 Molecole utilizzate per la validazione del modello del recettore 5-HT tramite Induced Fit

7

Docking. Per quanto riguarda le molecole che riportano la sigla CHEMBL le Ki e la nomenclatura è stata

presa dal sito bindingdb.org. Le altre sono state arbitrariamente nominate e sono state selezionate dalla

56, 58-59

letteratura. Molecole Ki XP

Molecola

Attive nM Score

4 E-55888 2.5 12 LP-44 -10.985

8 CIMBI-717 7.5 13 5_EJOC_05_14 -10.684

9 2FP3 8.4 8 CIMBI-717 -10.578

10 41_T12_PET 0.90 15 CHEMBL3290017 -10.455

11 40_T12_PET 2.93 4 E-55888 -10.144

12 LP-44 0.22 23 CHEMBL1812286 -10.005

13 5_EJOC_05_14 7 16 SB-269970 -9.737

14 6_EJOC_05_14 7 25 CHEMBL197796 -9.670

5-HT 7 15 CHEMBL3290017 5.6 18 33_T12_PET -9.479

“Top 16 SB-269970 1.26 10 41_T12_PET -9.447

poses”

IFD Molecole Ki

ordinate Inattive nM

per 17 32_T12_PET > 1000 26 CHEMBL133868 -9.335

docking

score 18 33_T12_PET > 800 14 6_EJOC_05_14 -9.204

(XP

Score) 19 CHEMBL599000 > 10000 19 CHEMBL599000 -8.910

20 CHEMBL596958 > 10000 17 32_T12_PET -8.880

21 CHEMBL590501 > 10000 21 CHEMBL590501 -8.638

22 CHEMBL1258452 > 10000 9 2FP3 -8.405

23 CHEMBL1812286 > 10000 11 40_T12_PET -8.336

24 CHEMBL1672288 > 10000 22 CHEMBL1258452 -8.176

25 CHEMBL197796 > 10000 20 CHEMBL596958 -6.729

26 CHEMBL133868 24000 24 CHEMBL1672288 -6.626 26

Strutture molecole utilizzate 27

Per validare ulteriormente il protocollo di docking IFD sul recettore 5-HT è stato ampliato

7

il campione di molecole “attive” portandolo a 161 successivamente sottoposte alla stessa

procedura di IFD mantenendo sempre la griglia centrata sul residuo 3.32 (Asp 162). In

appendice A sono riportate tutte le strutture dei ligandi usati.

Una volta analizzati i risultati dei docking che confermavano i dati precedenti ottenuti con

venti molecole attive, abbiamo generato tramite il server DUDE-E

(http://dude.docking.org/ data di accesso Luglio 2015) 19051 decoys partendo dalle 161

strutture precedentemente sottoposte al protocollo di docking nominato IFD.

I decoys sono delle molecole inattive e sono generate a partire da una molecola attiva di

riferimento mantenendo invariato i seguenti 5 parametri: peso molecolare, il numero di

legami ruotabili, il numero di donatori di legame idrogeno, il numero di accettori legame

idrogeno e il coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua.

Abbiamo quindi generato la griglia di docking tramite l’applicazione Glide Receptor Gride

Generation partendo dal recettore 5-HT sempre centrata sul residuo 3.32 (Asp 162). Con

7

l’ausilio del software LigPrep è stata preparata la libreria per i successivi studi di docking

costituita da 19051 decoys e 161 ligandi attivi.

In seguito con l’applicazione Glide con precisione SP, selezionando il file contenente i

19051 decoys e 161 molecole attive precedentemente sottoposte al protocollo di docking

IFD.

Dopo aver selezionato le migliori soluzioni per ogni ligando si è passati all’analisi

statistica dei risultati attraverso il calcolo della curva ROC in Figura 2 (ulteriori dettagli

60

riguardanti l'analisi delle curve ROC sono forniti nel Box 1). 28

Box 1 L’area sottostante la curva ROC viene

definita con l’acronimo AUC (Area Under the

Curve) ed il suo valore massimo è 1. Questo

rappresenta una misurazione statistica di

accuratezza, infatti se l’AUC è 1 vuol dire che

l’accuratezza è del 100%, un valore di 0.5

l’accuratezza è del 50% e il nostro test, quindi,

non è in grado di fornire alcun tipo di

60

informazione. Swets propose una scala per

interpretare la curva ROC in cui:

AUC = 0.5 il test non è informativo Schema generale per l'interpretazione di una

0.5 < AUC < 0.7 il test è poco accurato curva ROC. La linea rossa rappresenta una

0.7 < AUC < 0.9 il test è moderatamente accurato condizione per la quale il test non fornisce

0.9 < AUC < 1.0 il test è altamente accurato nessuna informazione utile sulla predittività. La

AUC = 1.0 il test perfetto curva azzurra indica una condizione media

Generalmente si considera attendibile un modello accuratezza. La linea tratteggiata Blu

rappresenta una situazione ideale in cui

la cui accuratezza si attesta attorno al 80% l’accuratezza è del 100% e l’AUC corrisponde a

(AUC = 0.8). 1.

Considerando i risultati ottenuti per il 5-HT , che presenta un AUC di 0.79, possiamo

7

dunque considerare il nostro modello sufficientemente accurato nella corretta valutazione

dell’affinità delle molecole per il recettore considerato (Figura 9).

Figura 9 Curva ROC costruita per la validazione del recettore 5-HT considerando i 161 ligandi attivi e

7

19051 decoys. 29

3.1.6 VALIDAZIONE RECETTORI 5-HT TRAMITE INDUCED FIT DOCKING

Una volta finito la validazione del recettore 5-HT , si è quindi passati alla valutazione

7

dell’affidabilità del protocollo di docking sugli altri recettori (5-HT 5-HT 5-HT 5-

1A, 1B, 2A,

HT 5-HT ).

2B, 2C

Come precedentemente riportato per i recettori 5-HT sono state selezionate 20 molecole

7

per ogni recettore di cui 10 sono state considerate “attive” e le altre 10 “inattive”.

La libreria di 20 strutture è stata sottoposta alla procedura di docking molecolare con IFD,

centrando la griglia sul residuo Asp 3.32 che risulta essere conservato in tutti i recettori 5-

HT considerati. Di seguito saranno riportate le tabelle con le Ki e i risultati del protocollo

di Induced Fit Docking utilizzato.

Alle 10 molecole considerate “attive” ne sono state aggiunte altre 10 "attive", per un totale

di 20 molecole con una marcata affinità per il recettore 5-HT , da cui sono stati generati i

7

decoys tramite il server DUDE-E, preparati poi con LigPrep. Successivamente, si è passati

al docking molecolare con il software Glide della libreria composta da 20 molecole

considerate precedentemente “attive”, e dei decoys. Si è quindi calcolato la curva ROC. In

Figura 10 sono riportate, oltre alle curve ROC, i valori di AUC e i numeri di decoys

generati specificatamente per ogni modello recettoriale considerato. 30

Tabella 5 Molecole utilizzate per la validazione del modello tramite Induced Fit Docking per il recettore 5-

HT . Per quanto riguarda le molecole che riportano la sigla CHEMBL le Ki e la nomenclatura è stata presa

1A

dal sito bindingdb.org. Le altre sono state arbitrariamente nominate e sono state selezionate dalla

56, 58-59

letteratura. Molecole Ki XP

Molecola

Attive (nM) Score

27 28_EJOC_05_14_ 1 31 CHEMBL2079256 -12.825

C

29_EJOC_05_14_

28 2 37 CHEMBL154274 -10.745

C

35_EJOC_05_14_

29 1 32 CHEMBL2159484 -10.625

C

30 CHEMBL281048 140 29 35_EJOC_05_14_C -10.348

31 CHEMBL2079256 0.8 28 29_EJOC_05_14_C -9.916

32 CHEMBL2159484 10 9 2FP3 9.734

33 CHEMBL159143 41 27 28_EJOC_05_14_C 9.690

5-HT 1A 34 CHEMBL204171 35 35 CHEMBL362540 -9.390

“Top 35 CHEMBL362540 0.87 33 CHEMBL159143 -9.300

poses”

IFD 36 CHEMBL186112 1.23 16 SB-269970 -8.888

ordinate Molecole Ki

per

docking Inattive (nM)

score 4 E-55888 > 1000 42 CHEMBL414628 -8.454

(XP 9 2FP3 > 1000 30 CHEMBL281048 -8.358

Score) 37 CHEMBL154274 3162.28 4 E-55888 -8.323

16 SB-269970 > 10000 36 CHEMBL186112 -8.271

38 CHEMBL2031737 > 10000 40 CHEMBL64303 -8.265

39 CHEMBL183329 > 1000 39 CHEMBL183329 -8.190

22 CHEMBL1258452 > 10000 34 CHEMBL204171 -8.112

40 CHEMBL64303 2520 38 CHEMBL2031737 -7.897

41 CHEMBL2031877 > 10000 22 CHEMBL1258452 -7.374

42 CHEMBL414628 3981 41 CHEMBL2031877 -7.231

Molecole Ki

Attive (nM)

43 22_EJOC_05_14_C 2

Ulteriori 44 Amoxapina 87

10 45 Asenapina 2.5

molecole

attive 46 Bromocriptina 12.9

utilizzate 1 Serotonina 0.12

per la

generazi 47 CHEMBL286725 0.06

one 48 CHEMBL138109 0.86

e la

validazio 49 CHEMBL148617 1

ne con 50 CHEMBL47792 0.8

decoys 51 Clozapine 123,9 31

Strutture molecole utilizzate 32

Come si può osservare in Tabella 5 il protocollo di docking molecolare utilizzato,

l’Induced Fit Docking, ha correttamente posizionato nelle prime 10 posizioni 7 molecole

che sono state considerate attive per quanto riguarda il recettore 5-HT .

1A 33

Tabella 6 Molecole utilizzate per la validazione del modello tramite Induced Fit Docking per il recettore 5-

HT . Per quanto riguarda le molecole che riportano la sigla CHEMBL le Ki e la nomenclatura è stata presa

1B

dal sito bindingdb.org. Le altre sono state arbitrariamente nominate e sono state selezionate dalla

56, 58-59

letteratura. Molecole Ki XP

Molecola

Attive (nM) Score

25 CHEMBL197796 16.7 57 CHEMBL198463 -10.445

40 CHEMBL64303 23 54 CHEMBL1241913 -10.315

52 CHEMBL762 0.3 60 CHEMBL2079546 -9.811

53 CHEMBL119443 1.29 25 CHEMBL197796 -9.620

54 CHEMBL1241913 0.80 53 CHEMBL119443 -9.582

55 CHEMBL97450 1.2 56 CHEMBL153451 -8.703

56 CHEMBL153451 95 40 CHEMBL64303 -8.580

5-HT 1B 57 CHEMBL198463 9.7 58 CHEMBL153136 -8.265

58 CHEMBL153136 45 65 CHEMBL52772 -8.132

“Top 59 CHEMBL1789131 47 63 CHEMBL51888 -8.066

poses”

IFD Molecole Ki

ordinate Inattive (nM)

per

docking 24 CHEMBL1672288 >10000 26 CHEMBL133868 -8.065

score 26 CHEMBL133868 >10000 62 CHEMBL27995 -7.804

(XP

Score) 37 CHEMBL154274 5011.87 61 CHEMBL1306 -7.683

38 CHEMBL2031737 >10000 37 CHEMBL154274 -7.515

60 CHEMBL2079546 >10000 59 CHEMBL1789131 -7.425

61 CHEMBL1306 >10000 38 CHEMBL2031737 -7.193

62 CHEMBL27995 >10000 64 CHEMBL62445 -7.074

63 CHEMBL51888 >10000 55 CHEMBL97450 -6.957

64 CHEMBL62445 >10000 52 CHEMBL762 -6.727

65 CHEMBL52772 >10000 24 CHEMBL1672288 -6.134

Molecole Ki

Attive (nM)

1 Serotonina 4.32

45 Asenapine 4

Ulteriori 10 51 Clozapina 519

molecole 66 Eletriptan 7

attive

utilizzate 67 Quetiapina 394

per la 68 Ziprasidone 4

generazione

e la 69 Cabergolina 479

validazione 70 Aripiprazole 832

con decoys 71 Amitriptyline 840

72 Olanzapine 585 34

Strutture molecole utilizzate 35

Come si può osservare in Tabella 6 il protocollo di docking molecolare utilizzato,

l’Induced Fit Docking, ha correttamente posizionato nelle prime 10 posizioni 7 molecole

che sono state considerate attive per quanto riguarda il recettore 5-HT .

1B 36

Tabella 7 Molecole utilizzate per la validazione del modello tramite Induced Fit Docking. Per quanto

riguarda le molecole che riportano la sigla CHEMBL le Ki e la nomenclatura è stata presa dal sito

56, 58-59

bindingdb.org. Le altre sono state arbitrariamente nominate e sono state selezionate dalla letteratura.

Molecole Ki Docking

Molecola

Attive (nM) Score

CHEMBL3290017 9.5 15 CHEMBL3290017 -13.855

15 CHEMBL133868 0.3 78 CHEMBL3289991 -12.916

26 CHEMBL204171 65 75 CHEMBL3290016 -12.697

34 CHEMBL149024 0.23 77 CHEMBL3290004 -12.512

73 CHEMBL260994 17.5 79 CHEMBL3290002 -12.330

74 CHEMBL3290016 0.7 74 CHEMBL260994 -11.901

75 CHEMBL3289972 17 26 CHEMBL133868 -11.651

76 CHEMBL3290004 1.8 76 CHEMBL3289972 -10.991

77

5-HT 2A CHEMBL3289991 3.7 83 CHEMBL220789 -10.695

78 CHEMBL3290002 1.7 85 CHEMBL404352 -10.537

79

“Top-poses” Molecole Ki

Induced Fit Inattive (nM)

Docking

ordinate per E-55888 >1000 34 CHEMBL204171 -10.527

4

docking

score CHEMBL1672288 >10000 4 E-55888 -10.428

24

(XP Score) CHEMBL154274 >10000 38 CHEMBL2031737 -10.425

37 CHEMBL2031737 1355 37 CHEMBL154274 -9.965

38 CHEMBL2203351 4406 81 CHEMBL198123 -9.529

80 CHEMBL198123 >10000 80 CHEMBL2203351 -9.528

81 CHEMBL220521 >10000 82 CHEMBL220521 -9.238

82 CHEMBL220789 >10000 84 CHEMBL223090 -9.127

83 CHEMBL223090 >10000 73 CHEMBL149024 -8.861

84 CHEMBL404352 >10000 24 CHEMBL1672288 -7.444

85 Molecole Ki

Attive (nM)

Asenapina 10.2

45 Quetiapina 526

67

Ulteriori 10 Ziprasidone 0.73

68

molecole

attive Aripiprazolo 17.5

70

utilizzate Amitriptilina 4.3

71

per la

generazione Clorpromazina 3.32

86

e la

validazione Iloperidone 5.6

87

con decoys Imipramina 120

88 Mirtazapina 69

89 37

Strutture molecole utilizzate 38

Come si può osservare in Tabella 7 il protocollo di docking molecolare utilizzato,

l’Induced Fit Docking, ha correttamente posizionato nelle prime 10 posizioni 8 molecole

che sono state considerate attive per quanto riguarda il recettore 5-HT .

2A 39

Tabella 8 Molecole utilizzate per la validazione del modello 5-HT tramite IFD. Per quanto riguarda le

2B

molecole che riportano la sigla CHEMBL le Ki e la nomenclatura è stata presa dal sito bindingdb.org. Le

56, 58-59

altre sono state arbitrariamente nominate e sono state selezionate dalla letteratura.

Molecole Ki XP

Molecola

Attive (nM) Score

45 Asenapina 0.16 94 CHEMBL401509 -10.985

46 Bromocriptina 56.2 95 CHEMBL110847 -10.772

53 CHEMBL119443 2.63 99 Spiroperidolo -10.564

72 Olanzapina 11.9 93 CHEMBL269974 -10.455

90 Amesergide 9 101 CHEMBL87458 -10.259

91 CHEMBL297784 1.29 90 Amesergide -10.175

92 Mianserina 10.9 45 Asenapine -10.094

5-HT 2B 93 CHEMBL269974 2.5 100 Sumatriptan -10.062

94 CHEMBL401509 4.8 53 CHEMBL119443 -9.972

“Top

poses” 95 CHEMBL110847 0.58 92 Miaserina -9.619

IFD Molecole Ki

ordinate Inattive (Nm)

per

docking 24 CHEMBL1672288 >10000 80 CHEMBL2203351 -9.395

score 38 CHEMBL2031737 >10000 46 BROMOCRIPTINA -9.358

(XP

Score) 80 CHEMBL2203351 5097 97 DMA,2,5 -9.061

84 CHEMBL223090 >10000 96 Butacianolo -9.004

96 Butacianolo >10000 38 CHEMBL2031737 -8.946

97 DMA.2.5 6800 84 CHEMBL223090 -8.757

98 QDOB >10000 91 CHEMBL297784 -8.392

99 Spiroperidolo >10000 72 Olanzapina -8.206

100. Sumatriptan >10000 24 CHEMBL1672288 -6.891

101 CHEMBL87458 >10000 98 QDOB -6.181

Molecole Ki

Attive (Nm)

44 Amoxapina 143

66 Eletriptan 6

Ulteriori 10 69 Cabergolina 1.17

molecole 70 Aripiprazolo 0.36

attive

utilizzate 73 CHEMBL149024 0.19

per la 102 CHEMBL267777 0.61

generazione

e la 103 CHEMBL267930 2

validazione 104 [11C]MMP 73.6

con decoys 105 Ketaserina 100

106 CHEMBL76781 5.1 40

Strutture molecole utilizzate 41

Come si può osservare in Tabella 8 il protocollo di docking molecolare utilizzato,

l’Induced Fit Docking, ha correttamente posizionato nelle prime 10 posizioni 7 molecole

che sono state considerate attive per quanto riguarda il recettore 5-HT .

2B 42

Tabella 9 Molecole utilizzate per la validazione del modello 5-HT tramite IFD. Per quanto riguarda le

2C

molecole che riportano la sigla CHEMBL le Ki e la nomenclatura è stata presa dal sito bindingdb.org. Le

56, 58-59

altre sono state arbitrariamente nominate e sono state selezionate dalla letteratura.

Molecole Ki XP

Molecola

Attive (nM) Score

26 CHEMBL133868 5.5 112 CHEMBL1927094 -10.682

53 CHEMBL119443 11 53 CHEMBL119443 -9.638

73 CHEMBL149024 0.02 117 CHEMBL256811 -9.453

107 CHEMBL371352 0.93 26 CHEMBL133868 -9.248

108 CHEMBL183423 13 80 CHEMBL2203351 -9.223

109 CHEMBL363452 15 107 CHEMBL371352 -9.102

110 CHEMBL149564 1 116 CHEMBL182937 -8.770

5-HT 2C 111 CHEMBL269974 15 108 CHEMBL183423 -8.590

112 CHEMBL1927094 3.28 111 CHEMBL269974 -8.505

“Top 113 CHEMBL401745 19 73 CHEMBL149024 -8.444

poses”

IFD Molecole Ki

ordinate Inattive (nM)

per 22 CHEMBL1258452 >10000 85 CHEMBL404352 -8.422

docking

score 24 CHEMBL1672288 >10000 37 CHEMBL154274 -8.367

(XP 37 CHEMBL154274 5011.87 110 CHEMBL149564 -8.268

Score) 61 CHEMBL1306 3646 109 CHEMBL363452 -8.262

80 CHEMBL2203351 > 1000 61 CHEMBL1306 -8.261

85 CHEMBL404352 >10000 113 CHEMBL401745 -8.108

114 CHEMBL402179 970 115 CHEMBL446459 -7.315

115 CHEMBL446459 2145 24 CHEMBL1672288 -6.832

116 CHEMBL182937 > 1000 114 CHEMBL402179 -6.694

117 CHEMBL256811 5000 22 CHEMBL1258452 -6.481

Molecole Ki

Attive (nM)

45 Asenapina 0.13

46 Bromocriptina 7.5

68 Ziprasidone 6

Ulteriori 10 70 Aripiprazolo 10

molecole

attive 118 Sertindolo 0.9

utilizzate

per la 119 Risperidone 12

generazione 120 CHEMBL319009 2.04

e la

validazione 121 CHEMBL3261687 11

con decoys 122 CHEMBL96782 8.11

123 CHEMBL3261690 11 43

Strutture molecole utilizzate 44

Come si può osservare in Tabella 9 il protocollo di docking molecolare utilizzato,

l’Induced Fit Docking, ha correttamente posizionato nelle prime 10 posizioni 7 molecole

che sono state considerate attive per quanto riguarda il recettore 5-HT .

2C

Al termine di queste procedure di docking molecolare condotti con l’IFD sui modelli

recettoriali 5-HT , 5-HT , 5-HT , 5-HT , 5-HT (Tabelle 5, 6, 7, 8, 9,

1A 1B 2A 2B 2C

rispettivamente) e 5-HT (Tabella 4 e in Appendice A), gli studi di docking molecolare si

7

sono ampliati utilizzando le librerie di decoys generate dalle relative molecole attive come

precedentemente descritto per il recettore 5-HT (Paragrafo 3.1.6). I risultati di questi

7

ultimi docking sono stati utilizzati per la costruzione delle curve ROC riportate in Figura

10. Come già precedentemete discusso, tanto maggiore è il valore di AUC tanto più

accurato sarà il modello in esame. Considerando dunque i grafici riportati in Figura 10

relativi ai vari recettori considerati in questo studio, si nota che i valori si attestano tutti

intorno all’80%, rendendo così possibile considerare attendibili i futuri risultati nella

predizione dell’affinità delle molecole generate. 45


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87

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11.33 MB

AUTORE

Pipps91

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in farmacia (a ciclo unco)
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Pipps91 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Chimica farmaceutica e tossicologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Campiani Giuseppe.

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