Ruolo del sistema endocannabinoide nei disturbi d'ansia: evidenze precliniche

FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE,

FISICHE E NATURALI

CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE

LAUREA DI PRIMO LIVELLO

RUOLO DEL SISTEMA ENDOCANNABINOIDE

NEI DISTURBI D’ANSIA:

EVIDENZE PRECLINICHE

RELATORE CANDIDATA

Dr.ssa Viviana Trezza Rossella Belardi

Matricola 282200

ANNO ACCADEMICO 2012/2013

INTRODUZIONE

Il sistema endocannabinoide è costituito da molecole di natura lipidica, definite

endocannabinoidi, dai loro recettori e dagli enzimi responsabili della loro biosintesi e

degradazione. Gli endocannabinoidi devono il loro nome alla capacità di legare e attivare i

recettori target del THC, principio attivo della marijuana. Questi lipidi sono sintetizzati dai

neuroni e, a differenza della maggior parte dei neurotrasmettitori che sono immagazzinati in

vescicole, attraversano la membrana cellulare per diffusione facilitata subito dopo la sintesi. I

primi endocannabinoidi ad essere isolati dal tessuto cerebrale sono stati l’anandammide e il 2-

L’attività

arachidonilglicerolo (2-AG). degli endocannabinoidi viene limitata da due eventi: la

ricaptazione nel neurone mediante un trasportatore proteico e la degradazione enzimatica.

L’enzima che degrada l’anandammide è l’idrolasi dell’ammide degli acidi grassi (FAAH);

l’inattivazione del 2-AG

quello che catalizza è la monoacilglicerolo-lipasi (MGL). I recettori

cannabinoidi conosciuti sono i recettori CB1, abbondantemente espressi nel Sistema Nervoso

Centrale (SNC), e i recettori CB2, presenti sulle membrane dei leucociti e di alcuni neuroni

nel cervello.

La localizzazione dei recettori CB1 nel SNC interessa aree preposte all’attività cognitiva e al

controllo emozionale.

Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di studiare il ruolo del sistema

degli stati d’ansia, esaminando i risultati di diversi studi

endocannabinoide nella regolazione

preclinici condotti su roditori. In particolare, l’inattivazione farmacologica e genetica della

degradazione di un endocannabinoide, l’anandammide, si è dimostrata efficace in diversi test

Gli studi preclinici presentati in questa trattazione attestano l’efficacia

comportamentali.

ansiolitica dell’inibizione dell’idrolisi dell’anandammide ma, allo stesso tempo, non

identificano l’inattivazione farmacologica come una terapia definitiva. L’attività

dell’anandammide, difatti, è influenzata da numerosi fattori che devono essere considerati

prima di poter giungere ad un nuovo farmaco per trattare i disturbi d’ansia.

1

INDICE

Capitolo 1:

Il sistema endocannabinoide 4

Cos’è il sistema endocannabinoide

1.1

1.2 Regolazione della trasmissione Gabaergica

1.3 Regolazione della trasmissione Glutammatergica

Capitolo2:

Disturbi d’ansia 13

2.1 Eziologia e sintomi

2.2 Terapia farmacologica

2.2.1 Effetti collaterali delle benzodiazepine

Capitolo 3:

Ruolo del sistema endocannabinoide nel controllo degli stati emozionali 17

3.1: Il sistema endocannabinoide nello sviluppo del SNC e nel controllo delle emozioni:

infanzia e adolescenza

Effetti dell’esposizione

3.2 ai cannabinoidi

Capitolo 4:

Test pre-clinici 20

4.1 Scopi dello studio

4.1.1 Materiali e metodi

4.2 Risultati

4.2.1 Effetti del trattamento con diazepam

Effetti dell’inattivazione genica di FAAH

4.2.2 2

Effetti dell’inibizione farmacologica di FAAH

4.2.3 d’ansia

4.3 Gli endocannabinoidi nei disturbi

4.3.1 Influenza delle condizioni ambientali

4.3.2 Effetto della dose e localizzazione dei recettori CB1

4.3.3 Risposta tonica e risposta fasica

4.3.4 Sensibilità

4.3.5 Adattamento allo stress: equilibrio tra la neurotrasmissione GABAergica e quella

glutammatergica

4.3.6 Ruolo dei recettori CB2, TRPV1, serotoninergici e dei recettori per la colecistochinina

Conclusioni 40

Bibliografia 42

3

CAPITOLO 1 IL SISTEMA ENDOCANNABINOIDE

Cos’è il

1.1 sistema endocannabinoide

Il sistema endocannabinoide comprende molecole segnale di natura lipidica, definite

endocannabinoidi, gli enzimi necessari per la loro biosintesi e per la loro degradazione, e i

corrispondenti recettori bersaglio, distinti in due sottotipi: il sottotipo CB1 e il sottotipo CB2.

I recettori CB1 sono espressi nel Sistema Nervoso Centrale (SNC) e i CB2 sono espressi nel

Sistema Nervoso Periferico e nelle cellule del sistema immunitario. Alcuni recettori sono

presenti anche in diverse cellule endoteliali e muscolari lisce (Piomelli, 2003).

A livello del SNC, il sistema endocannabinoide è coinvolto nella regolazione delle funzioni

cognitive, motorie e nel controllo emozionale: per questo motivo è oggetto di studio, in

quanto la comprensione del suo funzionamento potrebbe essere utile nel trattamento

terapeutico di alcune patologie.

Il tetraidrocannabinolo (THC) [Fig.1] è il principio attivo della Cannabis, pianta impiegata in

Europa da diversi secoli nel settore tessile e, tuttavia, nota agli studiosi europei per le sue

proprietà psicotrope solo a partire dal XIX secolo. I suoi effetti sono multipli e contrastanti:

euforia, irascibilità, pigrizia. (Piomelli, 2003).

Questo cannabinoide è anche noto per le sue proprietà analgesiche, anti-emetiche e stimolanti

l’appetito. Per questo motivo gli unici usi terapeutici consentiti dalla Food and Drug

Administration sono come antidolorifico nei pazienti malati di cancro e in quelli affetti da

nel trattamento dell’anoressia

sclerosi multipla, e come farmaco nei pazienti malati di AIDS

(Laviola et al., 2011). 4

Fig. 1 Struttura chimica del THC e di agonisti e antagonisti cannabinoidi di sintesi

(Immagine tratta da Piomelli,2003)

I molteplici effetti di questo cannabinoide sono il risultato di una trasduzione del segnale

mediata dal legame del THC a recettori transmembrana, presenti in neuroni di alcune aree

cerebrali. Il primo sottotipo recettoriale, CB1, fu clonato nel 1990 (Matsuda et al., 1990)

mentre il sottotipo CB2 fu identificato tre anni più tardi. A queste scoperte seguì l’isolamento

di alcuni composti THC-simili, cannabinoidi endogeni sintetizzati nel cervello e denominati

endocannabinoidi proprio per la loro capacità di legare i recettori target del THC [Fig.2].

5

Fig.2 Struttura chimica degli endocannabinoidi

( Immagine tratta da Piomelli, 2003)

A differenza della maggior parte dei neurotrasmettitori, gli endocannabinoidi sono molecole

lipidiche che non vengono rilasciate dai neuroni per esocitosi di vescicole, in quanto

attraversano il plasmalemma per diffusione facilitata. Questo tipo di trasporto non richiede

energia ma dipende dalla presenza di un carrier proteico specifico per il ligando che, in

seguito ad un cambiamento conformazionale, consente il passaggio di queste molecole

idrofobiche attraverso la membrana cellulare.

isolato è stato l’ammide dell’acido

Il primo endocannabinoide ad essere arachidonico e

dell’etanolammina, seguito dall’arachidonil-glicerolo

noto come anandammide (AEA),

(2-AG) e da altri composti, come la virodamina e la noladina (Sugiura T. et al.,1995).

dell’anandammide è catalizzata da due enzimi: l’N-aciltrasferasi

La sintesi (NAT) e la

fosfolipasi D (PLD). Il primo enzima trasferisce la catena di acido arachidonico da un lipide

di membrana, la fosfatidilcolina, ad un altro fosfolipide, la fosfatidiletanolammina, formando

l’intermedio N-arachidonyl-PE. Quest’ultimo è idrolizzato dall’enzima PLD ad acido

(un estere di due acidi grassi e glicerolo in cui l’alcol è legato ad un

fosfatidico gruppo

fosfato) e anandammide [Fig.3] (Piomelli, 2003).

6

dell’anandammide

Fig.3 Biosintesi

( Immagine tratta da Piomelli,2003) ++ l’enzima acil-trasferasi

La biosintesi dell’anandammide è Ca dipendente: infatti è inattivo in

++

assenza di Ca e la sua azione catalitica è incrementata dalla fosforilazione mediata da una

l’AMP

proteinchinasi A, a sua volta attivata da un secondo messaggero, ciclico (Piomelli,

2003).

L’anandammide può essere prodotta dal neurone anche con un meccanismo indipendente dal

++ a seguito dell’attivazione di alcuni

Ca , recettori metabotropici, come quello legante la

l’attivazione di alcune fosfolipasi

dopamina. Probabilmente il recettore metabotropico causa

nell’induzione della biosintesi

implicate (Piomelli, 2003).

Un altro endocannabinoide oggetto di studio è il 2-AG, un monoacilglicerolo che, a

dell’N-arachidonil-PE,

differenza è presente in elevate concentrazioni nel cervello poiché

rappresenta sia il precursore di alcuni lipidi sia il prodotto finale di differenti vie metaboliche.

La prima è catalizzata dall’enzima

Il 2-AG può essere prodotto tramite due vie biosintetiche. quest’ultimo è

fosfolipasi C (PLC), che idrolizza il fosfatidil-inositolo a 1,2-diacilglicerolo;

poi convertito da una diacilglicerolo lipasi (DGL) a 2-AG [Fig.4] (Piomelli, 2003).

7

La seconda via metabolica coinvolge un altro tipo di fosfolipasi che trasforma il fosfatidili-

inositolo in un intermedio, un arachidonil-lisofosfolipide, poi idrolizzato dalla Lyso-

fosfolipasi C ad arachidonil-glicerolo [Fig.4] (Piomelli, 2003).

La sintesi di questo monoacil-glicerolo si attiva in seguito ad un incremento intracellulare dei

++

livelli di Ca (Piomelli, 2003) .

Fig. 4 Vie biosintetiche del 2-AG

( Immagine tratta da Piomelli,2003)

Il segnale trasdotto dagli endocannabinoidi cessa in seguito alla loro ricaptazione nel neurone,

dell’anandammide

seguita da inattivazione enzimatica. La degradazione enzimatica è

dell’ammide degli acidi grassi

catalizzata dall’idrolasi (FAAH), una serin-idrolasi legata alla

l’anandammide

membrana, che idrolizza ad etanolammina e acido arachidonico. Si ipotizza

che il trasporto e la degradazione siano due meccanismi correlati tra loro nel caso

dell’anandammide, FAAH impedisce la

dato che la somministrazione di inibitori dell’enzima

ricaptazione dell’anandammide (Piomelli, 2003). dall’enzima monoacil-glicerolo

Il 2-AG viene idrolizzato ad acido grasso e glicerolo lipasi

(MGL). (Piomelli, 2003)

I recettori degli endocannabinoidi sono metabotropici, accoppiati a proteine G inibitorie

sull’enzima adenilato ciclasi (G ).

i

Essi sono caratterizzati da un dominio N-terminale extracellulare, responsabile del legame

con la molecola bersaglio, da sette domini ad alfa-elica transmembrana e da un dominio

8

C-terminale citosolico, legato con interazioni deboli, non covalenti, alla proteina G (Cella et

al., 2010).

Quest’ultima è costituita da un trimero di subunità (α,β,γ) con attività GTP-asica. Quando il

recettore non lega l’endocannabinoide, la subunità α è legata al GDP (Cella et al., 2010).

in cui il recettore lega l’endocannabinoide,

Nel momento esso subisce un cambiamento

aumenta l’affinità per il trimero mentre

conformazionale che ne il GDP è sostituito dal GTP.

α-GTP si separa dal dimero βγ

La subunità che, quale forma attiva della proteina G, può

interagire con proteine bersaglio: canali ionici ed enzimi (Cella et al., 2010).

Il legame degli endocannabinoidi ai recettori cannabinoidi genera la chiusura dei canali per il

++ +

, l’apertura di quelli per il K l’inibizione dell’adenilato ciclasi

Ca , e la stimolazione di

protein- chinasi (Piomelli, 2003).

Nel cervello i recettori CB1 sono altamente espressi su neuroni GABAergici e

determina l’inibizione del

glutammatergici; il segnale trasdotto dopo la loro attivazione

rilascio dei neurotrasmettitori GABA e glutammato, perciò gli endocannabinoidi possono

“modulatori dell’attività

essere definiti sinaptica”. Essi agiscono legandosi a recettori

cannabinoidi localizzati a livello presinaptico. (Piomelli, 2003)

1.2 Regolazione della trasmissione GABAergica dell’attività dei neuroni a livello delle

La plasticità sinaptica consiste nella modificazione

sinapsi.

Tale modulazione può realizzarsi a livello presinaptico o postsinaptico. Nella modulazione

presinaptica un neurone modulatore rilascia, su un neurone presinaptico, un

neurotrasmettitore inibitorio o eccitatorio che origina, rispettivamente, un potenziale sinaptico

eccitatorio. Quello inibitorio, attraverso l’iperpolarizzazione

inibitorio o nella cellula

presinaptica, riduce il rilascio del neurotrasmettitore dal terminale presinaptico (inibizione

presinaptica) (Silverthorn, 2010).

sinaptico eccitatorio causa l’effetto opposto

Il potenziale tramite una depolarizzazione, che

++

potenziale d’azione (PdA) l’apertura dei canali per il Ca

genera un a cui seguono e

l’esocitosi delle vescicole contenenti il neurotrasmettitore (facilitazione presinaptica).

(Silverthorn,2010) un’inibizione

Come accennato nel paragrafo precedente, gli endocannabinoidi determinano

presinaptica in neuroni sintetizzanti GABA e glutammato di alcune aree cerebrali, come

l’ippocampo, l’amigdala, i gangli basali e il romboencefalo (Piomelli, 2003).

9

L’acido γ-amminobutirrico (GABA) è un neurotrasmettitore amminoacidico con funzione

inibitoria. Un esempio di come gli endocannabinoidi modulino l’attività GABAergica nel

SNC avviene a livello dell’ippocampo (Piomelli, 2003).

L’ippocampo è coinvolto nella modulazione della memoria e nelle funzioni cognitive. I

neuroni GABAergici che lo costituiscono possiedono recettori di tipo CB1 e sono quindi

sensibili all’attività degli endocannabinoidi. Quando nelle cellule piramidali si aprono i canali

++

per il Ca , la depolarizzazione di membrana che ne consegue porta ad un incremento della

sintesi di 2-AG, che lega i corrispondenti recettori sui neuroni presinaptici producenti GABA.

+

l’apertura dei canali per il K l’iperpolarizzazione di membrana,

Tale interazione provoca e

l’esocitosi delle così l’effetto

che blocca vescicole contenenti il GABA, riducendo inibitorio

dell’amminoacido sui neuroni piramidali [Figure 5 e 6] (Piomelli, 2003).

fenomeno è noto come “soppressione dell’inibizione indotta da depolarizzazione”

Questo nell’ippocampo,

(DSI) e, sembra essere correlato alla regolazione dei processi cognitivi.

Inoltre la DSI potrebbe indurre il potenziamento a lungo termine, caratterizzato dalla sintesi di

nuove proteine.(Piomelli, 2003).

A conferma del fatto che tale segnale retrogrado coinvolge un endocannabinoide, è stato

dimostrato che, in topi privi di recettori CB1 o nei quali essi sono bloccati da un antagonista,

l’inibizione presinaptica non avviene. Quest’ultima, invece, ha luogo in presenza di agonisti

cannabinoidi e caratterizza quei neuroni che esprimono alti livelli di recettori CB1 (Piomelli,

2003). Regolazione presinaptica dell’attività dei canali ionici mediata dai recettori CB1

Fig.5

(Immagine tratta da Piomelli,2003) 10

L’amigdala è un’area cerebrale ed è sotto l’influenza

preposta alla regolazione delle emozioni

degli endocannabinoidi. Diversi risultati sperimentali lo dimostrano: topi con recettori CB1

inattivati in questa parte del cervello hanno un comportamento aggressivo ed ansioso; al

contrario essi manifestano un fenotipo meno ansioso in seguito al trattamento con farmaci che

inibiscono la degradazione dell’anandammide. Inoltre stimoli ansiogenici portano ad un

aumento nella sintesi di anandammide e di 2-AG (Piomelli, 2003).

Studi pre-clinici hanno confermato il coinvolgimento del sistema endocannabinoide anche nel

controllo del dolore: sono stati riscontrati aumenti nei livelli di anandammide in seguito a

nonché l’inibizione presinaptica del rilascio di GABA a seguito

stimoli dolorosi,

dell’attivazione dei recettori CB1. Inoltre roditori a cui veniva iniettato un antagonista dei

recettori CB1 mostravano iperalgesia. (Piomelli, 2003)

1.3 Regolazione della trasmissione glutammatergica

Il glutammato è il principale neurotrasmettitore eccitatorio nel SNC. Gli endocannabinoidi,

con un meccanismo simile alla DSI, ma di effetto contrario, modulano l’attività presinaptica

di neuroni glutammatergici: inibiscono cioè il rilascio di glutammato. Tale fenomeno è noto

come “soppressione dell’eccitazione indotta da depolarizzazione” (DSE) [Fig.6]. Il risultato è

una riduzione dell’eccitazione sui neuroni bersaglio da parte del glutammato (Piomelli, 2003).

11

indotti dall’interazione endocannabinoide-recettore

Fig.6 Eventi di trasduzione del segnale

CB1 nell’inibizione del rilascio di GABA (a) e del glutammato (b).

( Immagini tratte da Piomelli,2003) 12

CAPITOLO 2 DISTURBI D’ANSIA

2.1 Eziologia e sintomi

L’ansia è un’emozione derivante da una condizione fisiologica non necessariamente

dell’organismo all’ambiente

patologica o dannosa: al contrario, essa costituisce una risposta

circostante che gli consente di reagire a stimoli spesso avversi, migliorando le prestazioni e

dell’individuo L’ansia

capacità nel risolvere una situazione. diventa una patologia nel

momento in cui la reazione dell’organismo è esagerata, con conseguente calo delle

I disturbi d’ansia sono classificati in diverse categorie in base alla durata, alla

prestazioni.

presenza di stimoli scatenanti e di caratteristiche tipiche di fenomeni psicopatologici. (Torta

et al., 2008)

Essi sono distinti in: attacchi di panico con e senza agorafobia, agorafobia, fobie specifiche e

fobia sociale, disturbo d’ansia generalizzato, disturbo ossessivo compulsivo, disturbo da stress

acuto, disturbo da stress post-traumatico.

L’attacco di panico, ad esempio, ha un’insorgenza ac