Palmitoiletanolamina nella dispepsia funzionale

CAPITOLO IV: RISULTATI

4.1. EFFETTO DELLO STIMOLO ACIDO SULL'ATTIVITA' DEI

MASTOCITI NEL DUODENO

I risultati ottenuti dalle analisi biologiche e chimiche hanno evidenziato che

un incremento dell'acido duodenale ha causato un aumento della densità dei

mastociti (MC) e delle cellule positive alla triptasi nella mucosa duodenale di

tutti i soggetti, sebbene sia stato osservato un aumento significativamente

maggiore nei pazienti dispeptici rispetto al gruppo di controllo (P <0.001 vs

controllo) (Figura 8). Allo stesso modo, il rilascio dei mediatori da parte dei

mastociti (MC) come l'istamina, il fattore di crescita nervoso (NGF), la

prostaglandina D2 (PGD2) e la triptasi sono aumentati significativamente

nella FD (Figura 8 E–H). L'analisi dell'immunofluorescenza ha mostrato che

le cellule positive alla triptasi erano localizzate in stretta prossimità alle fibre

positive alla proteina nucleare neuronale (NeuN), suggerendo probabilmente

che un'interazione mastociti MC e fibre nervose può verificarsi dopo la

stimolazione acida della mucosa duodenale (Figura 8 C). 42

Figura 8. Effetti della sfida acida sui numeri e sull'attivazione di MC della

mucosa. (A) Immagini istochimiche che mostrano cellule positive alla toluidina

(frecce) e (B) quantificazione relativa di MC nella mucosa duodenale di campioni

bioptici dispeptici e di controllo coltivati rispettivamente a pH 3,0 e 7,4 e in

presenza o assenza di TTX. I dati mostrano il numero di MC contati per millimetro

quadrato di tessuto. (C) Immagini di immunofluorescenza rappresentative che

mostrano la stretta vicinanza delle cellule immunoreattive alla triptasi (rosso) alle

fibre NeuN- positive (verde). (D) Quantificazione relativa delle cellule

immunopositive alla triptasi. I dati mostrano il numero di cellule triptasi positive

per millimetro quadrato di tessuto. (E – H) Saggi ELISA, rispettivamente, che 43

quantificano il rilascio di triptasi, istamina, NGF e PGD2 in FD e campioni di

biopsia della mucosa duodenale sana. Tutti i risultati sono espressi come media ±

DS di 20; n = 20 e 10 (B e D) e 10 e 6 (F-H) soggetti dispeptici e di controllo,

rispettivamente.

È interessante notare che il pretrattamento con tetradotossina (TTX)

(107 mol/L) ha inibito significativamente l’attivazione, indotta dall'acido, di

MC e il rilascio di istamina, NGF, PGD2 e triptasi in campioni bioptici sia di

FD che di soggetti di controllo (P <0.05 e P <0.01 vs non trattato per i

controlli e pazienti con FD, rispettivamente) (Figura 8). L'osservazione che il

numero di MC e il rilascio dei loro mediatori era simile sia nei pazienti

dispeptici che nei controlli, a pH neutro, mentre erano aumentati

significativamente nei dispeptici dopo l'esposizione all'acido duodenale,

probabilmente suggerisce che ciò rappresenti una risposta fisiologica

all'acido che è significativamente amplificata nei pazienti con FD. Inoltre, la

capacità del TTX di inibire tali effetti indotti dall'acido indica che questo

meccanismo, almeno in parte, è mediato dall'attività dei circuiti nervosi

locali. 44

4.2. EFFETTO DELLO STIMOLO ACIDO SULL' ESPRESSIONE DEI

RECETTORI TRPV1 E TRPV4

L’aumento dell’acido duodenale, rispetto ad un pH neutro, ha comportato

un rialzo complessivo dell'espressione di TRPV1 e TRPV4, sia nei pazienti

dispeptici che nei controlli.

Tuttavia, la quantizzazione dell'immunofluorescenza ha mostrato che

l'aumento relativo era significativamente più alto nella mucosa dei pazienti

dispeptici rispetto ai soggetti di controllo (P<0.001). L'analisi Western blot ha

confermato che l'espressione indotta dall'acido sia di TRPV1 che di TRPV4

era più alta nei pazienti dispeptici rispetto ai controlli. A ulteriore supporto

del coinvolgimento dei neuroni enterici nelle risposte duodenali, l'aumentata

espressione sia di TRPV1 che di TRPV4 è stata inibita dal pretrattamento con

TTX e questo effetto era più evidente nei soggetti dispeptici che nei soggetti

di controllo (P <0.05 e P <0.001 rispetto al pretrattamento per controlli e

pazienti dispeptici, rispettivamente) (Figura 9). 45

Figura 9. La sfida acida regola l'espressione di TRPV1 e TRPV4 nelle

terminazioni nervose della sottomucosa. (B) relative barre del grafico che

quantificano le cellule positive per TRPV1 nella mucosa duodenale di campioni

bioptici dispeptici e di controllo coltivati a pH 3,0 e 7,4, rispettivamente, e in

presenza o assenza di TTX. I dati mostrano il numero di cellule TRPV1 positive per

millimetro quadrato di tessuto. (F) Analisi densitometrica (unità arbitrarie

normalizzate sull'espressione della proteina β-actina domestica) che quantifica

l'espressione della proteina TRPV4 nei dispeptici e nei controlli in presenza o assenza

di TTX.

4.3. RILASCIO DELLA PEA NEI PAZIENTI DISPEPTICI

La palmitoiletanolamide (PEA) è una molecola endogena rilasciata su

richiesta, che esercita proprietà antinfiammatorie e analgesiche ed è stato

20-22

dimostrato che inibisce direttamente l'attivazione dei mastociti. Nel

25,26

contesto sperimentale, a un pH neutro, il rilascio di PEA era praticamente

assente sia nei controlli che nei pazienti. Dopo lo stimolo acido, il rilascio di

46

PEA è aumentato significativamente nei controlli, ma non nel gruppo con FD

(P < 0.001) (Figura 10 A e B). Il pretrattamento con TTX ha causato una

significativa inibizione del rilascio di PEA indotto dall'acido (P < 0.05 rispetto

al pretrattamento con TTX sia per i controlli che per i soggetti dispeptici)

(Figura 10 A e B), suggerendo probabilmente che il rilascio di PEA è neuro-

mediato.

Figura 10 A: Analisi rappresentativa della cromatografia accoppiata alla

spettrometria di massa tandem del rilascio di PEA in pazienti dispeptici e nei

controlli a pH 3.0 e pH 7.4 47

Figura 10 B: Quantificazione relativa dei livelli di PEA (espressi come

concentrazione nanomolare negli omogenati duodenali) dalla mucosa di 20 dispeptici

e 10 campioni bioptici di controllo, coltivati a pH 3.0 e 7.4, rispettivamente e in

presenza o assenza di TTX. Tutti i risultati sono espressi come medie ± SD.

Sebbene l'attività farmacologica della PEA non sia ancora completamente

chiarita, è stato dimostrato che gli effetti della PEA dipendono in parte dalla

sua capacità di attivare i recettori PPARα. E’ stato osservato che,

29

parallelamente al rilascio di PEA, l'espressione di PPARα è aumentata

significativamente nei controlli in seguito alla stimolazione acida, ma non nei

soggetti con dispepsia funzionale (P < 0.001 rispetto al controllo a un pH di

3.0). 48

4.4. EFFETTO DELLA PEA ESOGENA NEI CAMPIONI BIOPTICI

In studi analoghi è stato dimostrato che la somministrazione di PEA esogena

era in grado di ridurre le risposte infiammatorie intestinali in campioni

bioptici del colon di pazienti affetti da colite ulcerosa e sono state quindi

64

condotte una seconda serie di esperimenti per verificare la capacità della

PEA di contrastare le risposte indotte dall'acido nel duodeno di pazienti

dispeptici. E’ stato riscontrato che la PEA ha ridotto significativamente il

numero complessivo dei mastociti e di cellule positive alla triptasi e ha

prodotto una riduzione consistente dell'immunopositività di TRPV1 e TRPV4

nella mucosa esposta all'acido (P < 0.001) (Figura 11 A-H).

Figura 11 A-H: (A) Immagini immunoistochimiche che mostrano le cellule positive

alla toluidina (frecce) e (B) quantificazione relativa delle MC nella mucosa duodenale

derivante da campioni bioptici di pazienti dispeptici coltivati a (1) pH = 3.0, in

presenza di (2) PEA esogena (0.1 µmol/L), in co-incubazione con (3) antagonista di

49

PPARa, MK866 (3 µmol/L) o (4) antagonista di PPARγ (GW9662 9 nmol/L). I dati

mostrano il numero di MC contati per millimetro quadrato di tessuto. Colorazione in

immunofluorescenza di NeuN (verde) e (C) triptasi, (E) cellule TRPV1-, (G)

TRPV4-positive (tutte in rosso) e relative barre grafiche che quantificano (D) cellule

triptasi-positive, (F) TRPV1-positive e (H) TRPV4-positivi. I dati mostrano il

numero di cellule immuno-reattive contate per millimetro quadrato di tessuto.

Analogamente, la PEA ha indotto una riduzione significativa e

concentrazione-dipendente dell'espressione delle proteine TRPV1 e TRPV4 e

del rilascio di istamina, triptasi, PGD2 e NGF (P < 0.05, P < 0.01 e P < 0.001

per la PEA a 0.001, 0.01 e 0.1 μmol/L, rispettivamente) (Figura 11 J-M).

Figura 11 J-M: (J) l'espressione delle proteine TRPV1 e (K) TRPV4 a (1) pH = 3.0,

in presenza di concentrazioni crescenti di PEA esogena (2) 0.001 µmol/L, (3) 0.01

µmol/L, (4) 0.1 µmol/L da sola o in co-incubazione con (5) antagonista di PPARa,

50

MK866 (3 µmol/L) o (6) antagonista di PPARγ (GW9662 9 nmol/L). (L-M) Saggi

ELISA che quantificano, rispettivamente, il rilascio di triptasi, NGF (pg/mL),

istamina e PGD2 in campioni bioptici dispeptici, coltivati nelle stesse condizioni

sperimentali.

4.5. LA SOMMINISTRAZIONE DELLA PEA ESOGENA RIDUCE

I SINTOMI DISPEPTICI

Dopo aver valutato gli effetti della PEA esogena in vitro sui campioni

bioptici dei pazienti affetti da dispesia funzionale, sono stati studiati gli

effetti in vivo sulla sintomatologia dispeptica.

I pazienti arruolati nello studio sperimentale (23 pazienti; 16 femmine; 7

maschi; età media 41 ± 8.9 anni) sono stati classificati nei sottogruppi della

dispepsia: EPS (2 pazienti), PDS (3 pazienti) e OVERLAP (18 pazienti). Nella

stragrande maggioranza dei pazienti i sintomi più comuni sono risultati: la

ripienezza gastrica (83%), il gonfiore (75%), e il dolore epigastrico (71%); nel

sottogruppo EPS predominava il bruciore epigastrico e le eruttazioni, a

differenza del sottogruppo PDS in cui prevalevano il gonfiore e la ripienezza

gastrica (Figura 12). 51

Figura 12. Istogramma di prevalenza dei sintomi al baseline

I risultati ottenuti dallo studio osservazionale prospettico sui pazienti con

dispepsia funzionale, dopo il trattamento con Inibitori di Pompa Protonica

(IPP, pantoprazolo 20 mg b.i.d) e dopo il trattamento con IPP in associazione

alla Palmitoietanolamide ultra-micronizzata, hanno evidenziato un

significativo miglioramento della severità dei sintomi rispetto al baseline e

un più evidente miglioramento con l’associazione di IPP + PEA rispetto alla

sola terapia con IPP.

Inoltre, si è osservata una significativa riduzione degli score totali del PAGI-

SYM, rispetto al baseline, sia nel gruppo trattato con IPP, sia nel gruppo

trattato con IPP + PEA (p=0.03 e p=0.02, rispettivamente). Il miglioramento

dei sintomi è stato testimoniato anche dalla riduzione degli score ottenuti dai

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