Determinazione di Nuovi oppioidi sintetici in matrice cheratinica mediante UPLC-MSMS

Università degli Studi di Verona

Università degli Studi di Verona

Laurea Triennale in Biotecnologie (L2)

Dipartimento di Diagnostica e Sanità Pubblica

Sezione di Medicina Legale

Determinazione di Nuovi Oppioidi Sintetici in

matrice cheratinica mediante cromatografia liquida

accoppiata alla spettrometria di massa

Laureanda: Anna Bacci VR458535

Relatore: Prof. Vettori Andrea

Correlatore: Prof.ssa Gottardo Rossella

Anno 2022/2023 Università degli Studi di Verona

S

OMMARIO

1 INTRODUZIONE .......................................................................................................................... 1

.................................................................................. 3

1.1 NSO: NUOVI OPPIODI SINTETICI

.......................................................................................................... 4

1.1.1 F

ENTANYL E SUOI DERIVATI

....................................................................................................................................... 6

1.1.2 N ITAZENI ..................................................................................................................................... 7

1.1.3 X

YLAZINA

L’ ............................................................. 8

1.2 ANALISI DEL CAPELLO IN TOSSICOLOGIA FORENSE 10

1.3 LC-MS/MS...........................................................................................................................

................................................................................................. 11

1.3.1 SPE: S P E

OLID HASE XTRACTION

.................................................................................................................................. 12

1.4 S

COPO

2 MATERIALI E METODI .............................................................................................................. 13

...................................................................................... 13

2.1 S .

OLUZIONI STANDARD E REAGENTI .................................................................... 13

2.2 S .

TRUMENTAZIONE E CONDIZIONI ANALITICHE

.............................................................................................. 15

2.3 P

REPARAZIONE DEI CAMPIONI

3 VALIDAZIONE DEL METODO .................................................................................................. 17

......................................................................................................................... 17

3.1 S ENSIBILITÀ ........................................................................................................... 18

3.2 A ( )

CCURATEZZA BIAS

.......................................................................................................................... 18

3.3 P

RECISIONE

........................................................................................................................... 19

3.4 L

INEARITÀ ......................................................................................... 20

3.5 C - ( )

ARRY OVER TRASCINAMENTO

................................................................................................. 20

3.6 S S

ELETTIVITÀ O PECIFICITÀ ........................................................ 21

3.7 EFFETTO MATRICE RECUPERO ESTRATTIVO

E

............................................................................................................................ 22

3.8 S TABILITÀ

4 RISULTATI E DISCUSSIONE ..................................................................................................... 23

......................................................................................... 23

4.1 O UPLC-MS/MS

TTIMIZZAZIONE

....................................................................................................................... 25

4.2 V

ALIDAZIONE ...................................................................................................... 25

4.2.1 P RECISIONE E ACCURATEZZA

................................................................................................................................... 26

4.2.2 L INEARITÀ ............................................................................................................................... 27

4.2.3 C -

ARRY OVER

................................................................................................................................ 28

4.2.4 S

ELETTIVITÀ ’EFFETTO ....................... 28

4.2.5 V MATRICE RECUPERO ESTRATTIVO

ALUTAZIONE DELL E DEL

....................................................................................................... 29

4.2.6 S (LOD LLOQ)

ENSIBILITÀ E

.................................................................................................................................... 29

4.2.7 S

TABILITÀ ............................................................................................... 29

4.3 A

NALISI DEI CAMPIONI REALI

5 CONCLUSIONI .............................................................................................................................. 36

6 RIFERIMENTI ............................................................................................................................ 37

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1 INTRODUZIONE

L’uso inappropriato e abuso di oppioidi sintetici è un fenomeno che si è sviluppato dagli inizi degli anni

’90 e si è manifestato ancor più con il verificarsi della pandemia di SARS-Cov2 (Sameer Imtiaz, 2021).

Nel corso degli ultimi decenni si sono verificate diverse epidemie da oppioidi. La prima avvenne negli

anni ‘90 ed era legata all’abuso di oppioidi da prescrizione, quali metadone, oxicodone e idrocodone.

Nel 1995 l’American Pain Society aveva iniziato una campagna per il trattamento e controllo del dolore,

sostenuta da varie agenzie nazionali e federali, portando il Congresso degli Stati Uniti riunito nel 2000

a dichiarare lo stesso anno come inizio del “Decennio del controllo del dolore” (Darnall et al, 2019). I

morti per overdose da oppioidi iniziarono ad aumentare.

La seconda epidemia di overdosi invece risale al 2010 ed è legata prevalentemente al consumo di eroina;

mentre la terza, che ha avuto inizio nel 2013 e che perdura fino ad oggi, ha avuto come principali

protagonisti tramadolo e fentanyl (SIF, 2018).

Nonostante le restrizioni legate alle normative vigenti, la possibilità di acquistare sostanze tramite dark

ha facilitato la diffusione dell’uso di sostanze psicoattive.

web Questo fenomeno è aumentato in

particolare durante il periodo pandemico, quando il confinamento domiciliare ha incrementato la

richiesta di consumo di sostanze in solitudine, come oppiacei, nuovi oppioidi sintetici e le nuove

benzodiazepine.

In particolare negli USA, in corrispondenza della pandemia da Covid, si è registrato un aumento

esponenziale dei decessi per overdose da queste sostanze determinando una grande preoccupazione nel

Dipartimento Statunitense della Salute e dei Servizi Umani, il quale ha dichiarato che la crisi degli

oppioidi è un’emergenza sanitaria pubblica nazionale (Ghose R., 2022).

In anni recenti, l’Osservatorio europeo delle droghe e delle tossicodipendenze (EMCDDA), di concerto

con l’FDA e la National Academy of Medicine, ha elaborato delle normative per ridurre il rischio di

dispersione dei farmaci dall’uso appropriato (AIFA, 2016). Al fine di diminuire il numero di prescrizioni

di oppioidi per trattare dolore acuto o cronico non oncologico sono state redatte delle linee guida per la

l’offerta di

terapia con oppioidi che prevedono, oltre alla formazione dei medici prescrittori, anche

terapie alternative (Jason W. Busse, 2017). Nel caso sia invece necessario trattare i pazienti con gli

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oppioidi si raccomanda di valutare attentamente il farmaco migliore in base alla casistica considerando

il dosaggio, la durata, la valutazione dei progressi e un’eventuale interruzione. Si esorta il monitoraggio

dei pazienti (CDC, 2016). “Sola ossia è la

Già il medico alchimista svizzero Paracelso con la sua massima dosis venenum facit”,

dose che fa il veleno, aveva compreso che una sostanza per quanto utile può ragionevolmente essere

sopportabile per l’organismo.

tossica se la dose assunta è maggiore della dose-soglia

i dati e grafici riportati dall’NIH

Secondo (NIH), numericamente parlando, nel 2021 sono stati segnalati

circa 106.000 morti per overdose di droga negli Stati Uniti, sia per droghe illecite che per oppioidi da

prescrizione. Di questi, 70.601 sono dovuti ad oppioidi sintetici tra cui principalmente fentanyl. Vi è

stato un aumento di 7.5 volte nel 2021 rispetto al 2015.

l’andamento dal 1999 al 2021

Se confrontiamo nella figura 1, si registra un aumento esponenziale delle

overdosi sostenute dall’assunzione di oppioidi, in particolare dal 2014

(https://nida.nih.gov/sites/default/files/Overdose_data_1999-2021%201.19.23.xlsx).

USA drug-involved overdoses death

120000

100000

80000

60000

40000

20000

0 Total overdoses death

Presence of xylazine

Synthetic Opioids other than Methadone (primarily fentanyl)

Figura 1: National Drug-Involved Overdoses Death, fonte NIH, CDC e DEA.

Il fentanyl, in particolare, ha causato molte morti sia se assunto singolarmente sia come adulterante di

l’eroina.

altre droghe, quali Gli adulteranti sono additivi aggiunti nelle preparazioni illecite di sostanze

stupefacenti per migliorarne le proprietà psicoattive oppure per ridurne il costo. Spesso gli adulteranti

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aumentano la pericolosità delle sostanze stupefacenti con effetti tossici spesso fatali. Tra gli adulteranti

per l’eroina e il levamisolo per le polveri di cocaina.

più comuni si ricordano il fentanyl

Tra gli adulteranti riscontrati più recentemente, il Dipartimento di Giustizia statunitense ha espresso

è un farmaco veterinario di cui è stato segnalato l’uso

preoccupazione verso la xylazina. La xylazina

come adulterante nelle preparazioni illecite di eroina e fentanyl Questa molecola sembra essere

responsabile di numerose morti per overdose negli Stati Uniti (Joseph Friedman, 2021).

La percentuale di casi di decesso in cui era riscontrata la presenza di xylazina è passata dal 0.36% del

2015, fino al 6.7% nel 2020 (Joseph Friedman, 2021). Secondo un report della NVSS Vital Statistics

Rapid Release (Merianne Rose Spencer, 2023, p. 6) basato sui dati del National Center for Health

Statistics, nel 2018 vi sono state 102 overdosi che presentavano positività alla xilazina, nel 2019

rispettivamente 627, nel 2020 invece 1499 e nel 2021 si ha avuto un aumento fino a 3468.

La causa di morte per overdose da oppioidi come fentanyl e derivati è data dalla depressione respiratoria

che comporta rigidità della parete toracica e delle vie aeree, portando il soggetto che ha assunto dosi

elevate, o oltre il limite di tossicità, alla morte. Agendo quindi sul tronco encefalico queste sostanze

progredendo fino all’apnea

riducono la frequenza e profondità respiratoria e conseguentemente alla

morte.

Solitamente nel caso di oppiacei si può invertire la condizione di depressione respiratoria assumendo un

μ

antidoto noto come Naloxone, che agisce antagonizzando i recettori oppioidi in modo competitivo.

Può essere somministrato per via endovenosa, via muscolare, via sottocutanea o in forma di spray nasale

(Handal, 1983).

1.1 NSO: NUOVI OPPIODI SINTETICI

I nuovi oppioidi sintetici (NSO) sono sostanze psicoattive che sono annoverate tra le NPS (Novel

dai “drug designer”

Psychoactive Substances). Le NPS sono sostanze chimiche sintetizzate sia in

laboratori clandestini sia in laboratori di chimico-farmaceutica come intermedi, come nuove molecole

ma strutturalmente e farmacologicamente simili a droghe già esistenti.

sono quindi a tutti gli effetti sostanze d’abuso.

Esse mimano gli effetti psicoattivi delle droghe vietate,

Tuttavia, non sono sotto il controllo della Convenzione Unica sugli Stupefacenti del 1961 e della

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Convenzione delle Sostanze Psicotrope del 1971. Di conseguenza non sono inserite nella tabella delle

sostanze illegali costituendo così una minaccia per la salute pubblica. Oppure, anche se inserite nella

lista subito vengono prodotti analoghi sostituti legali. Ogni anno vengono create e poi identificate

numerose nuove NPS, alcune diventano diffuse e ampiamente consumate, altre invece dimenticate

perché non utilizzate (UNODC, 2022). μ. L’attivazione

Gli oppioidi sintetici agiscono mediante interazione coi recettori del recettore oppioide

μ, stimola lo scambio di GTP con GDP sul complesso della proteina G e in seguito inibisce l'adenilato

ciclico

ciclasi. Questo provoca una diminuzione dell’AMP intracellulare che inibisce l'afflusso di calcio

mediato da cAMP nella cellula attraverso i canali del calcio e quindi si traduce in iperpolarizzazione e

L’effetto complessivo è l’induzione di analgesia, ma si verifica anche la

ridotta eccitabilità neuronale.

depressione respiratoria che può essere fatale.

1.1.1 Fentanyl e suoi derivati

Il fentanyl è un potente analgesico narcotico sintetico e anestetico locale disponibile in terapia per il

trattamento del dolore severo.

è stato preparato per la prima volta da Paul Janssen nel 1959 nell’ambito

Il fentanyl di un brevetto tenuto

l’FDA ne autorizzò l’uso

dalla sua società, la Janssen Pharmaceutica. Nel 1968 come anestetico-sedativo

poiché la sua potenza è da 50 a 100 volte più potente di quello della morfina.

La formula chimica è C H N O dal peso molecolare di 336.5 g/mol.

22 28 2

Dal punto di vista chimico, si tratta di un’ammide di acido monocarbossilico ottenuta dalla

condensazione dell’N-fenil-1-(2-feniletil)piperidin-4-ammina con l’acido propanoico. Per questo viene

infatti definito come agonista oppioide fenilpiperidinico (Fig. 2).

Figura 2: Struttura chimica del Fentanyl, da ChEBI.

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un agonista del recettore μ-oppioide

Il fentanyl è del SNC che imita gli effetti degli oppiacei endogeni.

Viene usato per la terapia del dolore, per trattare pazienti con dolore oncologico o in anestesia.

Si presenta come una polvere bianca granulare o cristallina, da cui vengono prodotte pasticche per uso

orale o anche cerotti transdermici. Può essere assunto tramite via endovenosa, o per via intranasale. Il

fentanyl in forma illegale si presenta come una polvere gialla o come trip di carta (sottili pezzettini di

cartoncino impregnati di fentanyl). Per l’effetto

Fondamentale è il rispetto del dosaggio. analgesico viene raccomandata una concentrazione

mentre per l’anestesia dai

sierica pari a 1-2 ng/ml di fentanyl, 10 ai 20 ng/ml (EMCDDA).

Vi possono essere delle reazioni collaterali come nausea, capogiri, vomito, affaticamento, mal di testa,

costipazione, anemia ed edema periferico. Per concentrazioni superiori a quelle raccomandate si può

andare incontro a overdose data dalla depressione respiratoria, regredibile comunque con il naloxone.

(Ministero dell’interno).

Si può anche andare incontro ad arresto cardiaco o grave reazione anafilattica

μg

Negli esseri umani 250 di fentanil sono sufficienti per provocare il decesso (Ellenhorn, 1988).

Vi sono numerosi analoghi derivanti dal fentanyl. Essi differiscono nella modifica sostitutiva di gruppi

chimici come riportato in Figura 3. Figura 3: Struttura chimica analoghi del fentanyl, da www.research gate.net.

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1.1.2 Nitazeni

I Nitazeni sono oppioidi benzimidazolici derivanti dal 2-benzilbenzimidazolo, sintetizzati a partire dagli

anni ’50 come oppioidi sintetici (Roberts, 2022). Sono stati creati dalla casa farmaceutica svizzera CIBA

i nitazeni agiscono sui recettori μ-oppioidi.

(Maria Antonietta De Luca, 2022). Anche Essi producono

un effetto antinocicettivo superiore, anche di mille volte, rispetto sia alla morfina che al fentanyl (Marthe

M. Vandeputte, 2021), ma hanno una durata di azione minore.

Negli ultimi anni sono comparsi nel mercato illegale differenti analoghi o derivati, tra cui: metonitazene,

metodesnitazene, etonitazene, etodesnitazene, protonizatene, butonitazene, isotonitazene, clonitazene,

flunitazene N-piperidinil etonitazene, N-piperidino etonitazene.

Essi fanno parte di una classe di sostanze che contengono un anello benzimidazolico con l’etilammina

in posizione 1 e un gruppo benzilico in posizione 2 (Administration, 2022). In Figura 4 si riporta la

struttura chimica dei nitazeni e i differenti analoghi.

Figura 4: Struttura chimica dei nitazeni e derivati, da Cayman Chemical (2021).

Nonostante essi siano stati creati per essere una alternativa valida e sicura alla morfina, per i loro rischi

e per la mancanza di una terapia clinicamente approvata non sono stati introdotti nel mercato. Ad oggi

l’etonitazene e il clonitazene sono stati

solo inseriti nella tabella I della Convenzione Unica sugli

Stupefacenti del 1961 (Nations, 1961).

L’overdose depressione respiratoria, in seguito all’assunzione consapevole o meno di questo

induce

gruppo di sostanze, è inoltre reversibile con il naloxone ma probabilmente sono necessarie più dosi

dell’antidoto per riuscire ad evitare la morte del soggetto.

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I vari analoghi, non essendo stati inseriti nella tabella I (ad eccezione di quelli sopra citati), non sono

stati tenuti sotto controllo, finché nel febbraio del 2020 grazie ai dati resi disponibili dal CDC sono stati

trovati numerosi casi tossicologici di overdose da oppioidi con positività a questa classe di NPS

benzimidazolici (EMCDDA, 2020). “Frankenstein

Anche i nitazeni hanno u