Struttura del DNA, appaiamento dei filamenti, denaturazione, topologia e topoisomerasi

Struttura del DNA e dell'RNA

DNA: catena polipeptidica di desossiribonucleotidi NO OH sul 2'

RNA: catena polipeptidica di ribonucleotidi OH sul 2' (che conferisce instabilità alle molecole di RNA)

Polimeri di nucleotidi:

• 1 zucchero pentoso
• 1 base azotata
• 1 o più fosfati ma nel DNA e RNA sono tutti monofosfati

Basi purine/pirimidine: legame N-glicosidico in beta sul C1 dello zucchero. Il legame interessa l'N1 delle pirimidine o l'N9 delle purine.

Fosfato: legame fosfodiesterico sull'OH del 5' o del 3'; conferisce una valenza acida alla molecola

Pirimidina (anello aromatico con N, eterociclica)

• Citosina
• Timina
• Uracile

Purina (biciclica aromatica)

• Adenina
• Guanina

Pirimidine e purine sono idrofobe e planari per la costrizione di rotazione dei doppi legami alternati

NUCLEOSIDE = BASE + ZUCCHERO

5'---> Gruppo funzionale dell'ultimo nucleotide, di norma fosfato idrolizzabile dunque OH

Polarità: i due estremi non

sono uguali (scrivi il 5' a sx e il 3' a dx)
3' ---> Sempre OHSolo i trifosfato forniscono energia per la polimerizzazione, dunque la sintesi di DNA e RNA (uscita del pirofosfato) ---> ad opera dellapirofosfatasi producono scissione del legame e liberazione di energia. La reazione diventa favorita perché negativizza l'energia libera.
IMMAGINI DI RIPASSO Struttura degli acidi nucleici -DNA Pagina 103/03/2023
Basi azotate e luce:Molti doppi legami alternati ---> INTERAZIONE CON LA LUCE---> assorbono porzioni dello spettro visibile di λ=260nm---> anche il DNA è visibile in soluzione (soluzione di DNA, non di basi e basta perché esse sono idrofobe) con spettrofotometro, che misura gliassorbimenti di luce a determinate lunghezze d'onda ---> LEGGE DI LAMBERT-BEER---> posso misurare la concentrazione del DNA. Ciò che cambia sono icoefficienti (quanta luce, con quanta efficienza).Esperimenti che portarono allaInoculano le tre sospensioni: Provetta con proteinasi--> topo muore Provetta con DNasi--> topo vive Provetta con RNasi--> topo muore -----> SOLO IL DNA CONFERISCE TRASFORMAZIONE 3° ESPERIMENTO --1953--HARSHEY E CHASE Manipolano fagi ---> virus semplici con capside e acido nucleico. Il virus inocula DNA o proteine?

1. Effettuano una marcatura differenziale con fosforo 32 (DNA) e zolfo 35 (proteine), due radioisotopi
2. Waring blender (frullatore) --> divide le parti che rimangono fuori e quelle che rimangono dentro la cellula infettata
3. Centrifugano in base al peso --> le cellule, più pesanti, sono sul fondo. Esse possiedono radioattività legata al fosforo. Le altre componenti "ghost"possiedono radioattività legata allo zolfo

Il virus inocula DNA ---> IL DNA TRASMETTE L'INFORMAZIONE GENETICA Struttura del DNA Tecnica di cristallizzazione --> FRANKLIN E WILKINS --> 1° foto a raggi X dello spettro di rifrazione della fibra di

DNA.Franklin non interpreta correttamente l'immagine, Watson e Crick, aiutati da Chargaff (rapporti invarianti tra le basi), sì.

EQUILIBRIO TAUTOMERICO DELLE BASI IN AMBIENTE ACQUOSO

Struttura degli acidi nucleici -DNA Pagina 2 Forme più stabili: amminica (C e A) e chetonica (T e G)

La struttura, individuata con metodo reiterativo, suggerisce un meccanismo di copia.

Pauling: ipotizza un'incorretta struttura a tripla elica con fosfato tetraedrico al centro e basi all'esterno. Ciò non è possibile poiché il DNA non starebbe in soluzione in quanto esporrebbe le componenti idrofobe.

Appaiamento delle basi

Atomi sostituenti complementari all'altra base in termini geometrici e di legame a H (come tutti i legami deboli si basa sulla complementarietà DONATORE-ACCETTORE).

La distanza zucchero A - zucchero T è invariata ed è uguale alla distanza zucchero C - zucchero G --> NON c'è distorsione

È possibile unire

G e U oppure G e T ma in tal caso si ha un mismatch, impedito solitamente da sistemi di riconoscimento. A e T formano insieme 2 legami H C e G formano insieme 3 legami H Parametri della posizione di coppie di basi adiacenti:

• Twist: rappresenta l'angolo tra due coppie di nucleotidi rispetto all'asse della doppia elica
• Roll: inclinazione dovuta alla repulsione tra due coppie di nucleotidi rispetto all'asse della coppia A-T o C-G
• Tilt: l'angolo che si forma, sempre per repulsione, rispetto all'asse dello scheletro zucchero-fosfato

Come si dispongono i due filamenti?

• ORIENTAMENTO ANTIPARALLELO (polarità degli estremi)
• le basi ruotano una sull'altra intorno a un asse di rotazione verticale (o "z") immaginario che passa per il centro tra i due filamenti
• l'angolo di rotazione fra due coppie di basi successive è costante
• le basi ruotano una rispetto all'altra di 36°, dunque i residui

zucchero-fosfato rimangono verso l'esterno e per compiere un giro completo occorrono 10 basi distanziate tra loro di 3,4 Å ---> un giro completo = 36 Å circa

L'elica ha un diametro di circa 20Å

Due solchi asimmetrici fra le creste (una cresta è la sporgenza dei gruppi zucchero-fosfato stabilizzanti). Il fatto che il residuo zucchero-fosfato sporga all'esterno delle basi con un angolo diverso da 180°, genera la presenza di due solchi di dimensioni differenti, definiti solco maggiore e solco minore.

AVVOLGIMENTO DESTRORSO (puoi applicare la regola della mano destra)

Forze stabilizzanti:

• Legami H
• Interazioni idrofobe delle basi ("stacking" o "impilamento"). La geometria di impilamento ha un'influenza dal punto di vista energetico (es: diversa Struttura degli acidi nucleici - DNA Pagina 3
• Interazioni idrofobe delle basi ("stacking" o "impilamento"). La geometria di

impilamento ha un'influenza dal punto di vista energetico (es: diversa energia se sopra a A-T ho C-G oppure G-C)

• Interazioni idrofile degli zucchero-fosfati

WATSON E CRICK POSTULANO LA COMPLEMENTARIETA' DELLE BASI

Perché i solchi sono importanti?

Il DNA interagisce con le proteine a livello dei solchi (sono accessibili interazioni con le basi all'interno).

Solco maggiore:

• ≠G-C C-G
• A= accettore
• Quando ho G-C nello spazio esterno sono disponibili all'interazione (la firma è) A-A-D-H
• D= donatore
• Quando ho C-G nello spazio esterno sono disponibili all'interazione (la firma è) H-D-A-A
• H= idrogeno
• ≠A-T T-A
• M= metile

Maggiore interazione

Questo perché nel solco maggiore sporgono i gruppi funzionali caratteristici delle coppie di basi (donatori e accettori di legami a H e metili), che sono unici per ogni coppia e ne costituiscono una firma che consente il riconoscimento univoco della

sequenza del DNA. Solco minore: G-C e C-G NON si distinguono. A-T possiede la firma A-H-A. Struttura degli acidi nucleici - DNA Pagina 4. ECCEZIONI: TATA BOX, legata da TATAbox-binding protein, interazione a livello del solco minore. Le tre forme del DNA:

• A: si ottiene per disidratazione o aumento della forza ionica del campione. NON è presente in natura.
• B: corrisponde al 99% a quella di Watson e Crick. È quella maggiormente stabile e rappresentata nelle cellule.
• Z: forma molto rara ma presente in natura. Lunghi tratti di alternanza purina-pirimidina. Possiede forma a zig-zag (da qui il nome). Si trova in trattidi elevata ripetizione, come nei promotori, che condizionano il livello di espressione di un gene. L'elica Z è levogira, una deformazione facilmente assorbibile dal filamento di DNA.

IN UN UNICO FILAMENTO B E Z SI ALTERNANO. Facendo il flip-out (da interno dell'elica verso l'esterno) di due basi ottengo uno switch B->Z. E'

importante notare l'estrusione delle basi A e T nei punti di passaggio da una forma all'altra. Ciò che stabilizza la forma Z è l'alternanza G-C.

Il DNA può essere denaturato. La formazione dell'elica è reversibile: + calore ---> denaturazione ---> si aprono i legami H ---> si stabilizza la separazione dei filamenti.

Condizione per la reversibilità: sottrarre calore lentamente.

07/03/2023

Se seguiamo la denaturazione del DNA con uno spettrofotometro nel grafico otteniamo una curva sigmoide, che sottende un processo di cooperatività: separare i filamenti all'inizio è molto più complicato; man mano che l'elica si apre diventa più facile --> fenomeno cooperativo.

Struttura degli acidi nucleici - DNA Pagina 5: separare i filamenti all'inizio è molto più complicato; man mano che l'elica si apre diventa più facile --> fenomeno cooperativo.

T. Melting: temperatura alla

quella del filamento superiore della doppia elica e si lega tramite legami H con il filamento inferiore. La tripla elica può essere stabile solo se la sequenza specchio è presente in quantità sufficiente e se il filamento extra ha una lunghezza adeguata.Atassia di Friedreich: alterazione del gene che codifica per la fratassina. La mutazione